附子中3种双酯型生物碱含量测定方法建立

2 附子研究概况附子为亚门毛茛科(Ranunculaceae)植物乌头(AconitumcarmichaeliDebx．)侧根(子根)的加工品，其性大热、辛、甘，归心、肾，生品极毒。

中医认为附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛、逐风通痹、温阳行水等功效。

附子始载于《神农本草经》，主风寒咳逆邪气，温中，金疮，破症坚积聚，血瘕，寒湿，拘挛膝痛，不能行步[1]。

2.1 附子化学成分研究国内外学者对附子化学成分的研究表明，附子的化学成分分为生物碱类物质、脂类物质和多糖类物质三大类。

其中生物碱类物质为其主要成分，包括脂溶性生物碱：乌头碱（aconitine），中乌头碱（新乌头碱mesaconitine），次乌头碱（下乌头碱、海帕乌头碱hypaconitine），塔拉乌头胺（talatisamine），和乌胺（higeramine）棍掌碱氯化物（coryneine chloride）[2]，异飞燕草碱（isodelphinine），苯甲酰中乌头碱（benzoyl mesaconitine），新乌宁碱（neoline），北乌头碱（beiwutine），多根乌头碱（karakoline），去氧乌头碱（deoxyaconitine），准葛尔乌头碱（songorine）；水溶性生物碱：江油乌头碱（jiangyouaconitine），新江油乌头碱（neojiangyouaconitine）、尿嘧啶(Uracil)[3]、附子亭碱（fuzitine）、消旋去甲基衡州乌药碱（demethylcoclaurine）[4]、、附子宁碱（fuziline）、去甲猪毛菜碱（salsolinol）[5]等。

其中双酯型生物碱乌头碱（aconitine），中乌头碱（mesaconitine），次乌头碱（hypaconitine）为其主要成分，约占0.4%-0.8%，易溶于氯仿、苯、无水乙醇和乙醚，难溶于水，微溶于石油醚，既是附子的药效成分，又是毒性成分。

三者易水解成为毒性较小的单酯型生物碱：苯甲酰乌头碱（乌头次碱Benzoylaconine)、苯甲酰中乌头碱(Banzoylmesaconine)、苯甲酰次乌头碱(Benzoylhypaconine)[6]。

其毒性仅为双酯型生物碱的1/1000。

单酯型生物碱如果进一步水解则变为毒性更小或无毒的醇胺类生物碱：乌头胺(乌头原碱Aconine)、中乌头胺(Mesaconine)、次乌头胺(Hypaco-nine)。

其毒性仅为乌头碱的1/2000左右[7]。

此外，附子还含有棉子油、蓖麻油、附子脂酸等脂类物质和乌头多糖。

2.2附子主要药理作用2.2.1 对心血管系统的作用研究表明，附子对心血管系统的用主要体现在以下几个方面。

首先是强心作用，附子的强心机理是附子中的强心成分致β受体兴奋，释放儿茶酚产生强心作用。

已经被证明的具有强心作用的成分有去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱、氯化甲基多巴胺、尿嘧啶以及附子苷，其中去甲乌药碱活性很强，对体内心脏、离体心脏和功能衰竭的心脏均有较强的强心作用，在稀释至10-9时仍表现出强心作用。

秦永刚[8]等用离体蛙心，对不同蒸煮时间的附子进行了强心作用及心脏毒性的初步实验观察，实验结果表明，蒸煮8h、10h、12h的附子具有强的正性肌力作用，且心脏毒性显著降低。

张志仁[9]等的研究表明附子炮制前后有效部位对正常及心衰大鼠血流动力学作用趋势一致，且对心衰大鼠血流动力学作用较正常大鼠血流动力学作用显著。

第二是抗心肌缺血缺氧的作用。

附子中的生物碱具有扩张冠状血管和四肢血管的作用，可抗急性心肌缺血及常压下缺氧[10]。

第三是增强心率、对抗缓慢型心律失常。

附子中水溶性成分能对抗乌头类生物碱所诱发的心律失常，但是对多巴因、三氯甲烷所引起的心律失常无效，具有特异性。

附子注射液可对抗垂体后叶素所致的各种不同类型的心律失常[11]。

第四是对血压的影响。

附子中的水溶性成分对血压的影响具有双重性，去甲乌药碱可以降血压，而氯化甲基多巴胺和去甲猪毛菜碱具有升压的作用。

第五是抗休克作用。

附子煎剂及复方可减缓血压下降、心率减慢等，能显著延长休克动物生存时间[12]。

2.2.2 抗炎镇痛作用大鼠足踝肿胀实验证明，附子具有显著的抗炎和对外周性疼痛的镇痛作用。

其抗炎镇痛机理，学术界的看法不一，除了已经被证明的具有较好抗炎作用的乌头类生物碱[13]和一些水溶性的成分外，还有一部分学者认为附子的抗炎镇痛与垂体-肾上腺皮质系统有关[14]。

因此，附子的抗炎及镇痛的作用机理和有效活性成分有待进一步研究探讨[15]。

2.2.3 免疫系统作用附子对免疫系统的作用表现为增强脾细胞的增值反应，增强巨噬细胞表面Ia抗原表达，增强红细胞免疫复合物(RBC—IC)花环形成率，产生抗体，提高免疫能力。

马健[16]等研究发现乌头碱可增强巨噬细胞表面Ia抗原表达，提高抗原能力，从而增强机体免疫应答反应。

此外，阮期平[17]等研究还发现附子中有两种糖复合物，同样具有抗癌、抗衰老和增强免疫机能的作用。

2.2.4抗肿瘤作用附子具有很好的抗肿瘤作用，其抗肿瘤成分为多糖类成分，抗肿瘤机制为增强机体细胞的免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，调节癌基因的表达。

多位专家对此进行了研究，彭文珍[18]等研究发现附子多糖对HL-60有诱导分化作用。

2.2.5 其他作用除上述介绍的药理作用外，附子还具有抗衰老、抗肾上腺素[19]、兴奋离体肠管自发性收缩、降糖等作用。

张涛[20]等研究结果表明，附子能提高老年大鼠血清总抗氧化能力及抗氧化酶活性，降低自由基代谢产物的含量，提高机体抗自由基能力，减少脂质过氧化，改善细胞膜的流动性，从而保证细胞膜的完整和功能，起到延缓衰老的作用。

附子多糖可以通过提高对葡萄糖的利用，但不提高胰岛素水平的方式起到降糖的作用。

2.3 乌头碱的毒性及中毒机制附子的主要成分为双酯型的生物碱，包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，它们既是附子的活性药效成分又是毒性成分。

中毒剂量为0.2mg，服用剂量为2～4mg时即可致死。

乌头碱的毒性主要作用于神经系统、消化系统、心血管系统和呼吸系统。

对于神经系统，乌头碱能够对各种神经末梢和中枢系统产生一个先兴奋后再抑制的过程，并对心肌直接作用，进而造成呼吸中枢麻痹，中枢性血压下降，甚至引起室癫而死亡。

对于心血管系统，乌头碱对心脏的损害最严重，临床表现为心悸、胸闷、血压下降、心率失常、心率减慢或过速，严重甚至发生心跳骤停、急性心源性脑缺血综合症等[21]。

对于消化系统，乌头碱对胃肠迷走神经的兴奋作用可引起流涎、吞咽困难、恶心、频繁呕吐、胃部灼热、腹痛、腹泻、肠鸣音亢进，严重者可导致呕吐咖啡色样液及解鲜血样粪便，里急后重，酷似痢疾等表现[22]。

对于呼吸系统，乌头碱的毒性可导致呼吸困难、呼吸麻痹甚至休克死亡。

2.4 附子有效成分的检测附子化学成分复杂，其中药效表现最为明显的当属生物碱类成分，然而其剧毒性也是有目共睹的。

附子的药效大小可以用总生物碱的含量来衡量，但不能以此来衡量附子的毒性大小。

因为总生物碱包含多种类型的生物碱，各类型生物碱之间毒性差异极大，其中以双酯型生物碱的毒性最大，其他如单酯型、氨醇型生物碱的毒性很小。

因此当以双酯型生物碱的含量作为毒性指标。

附子中有效成分的检测方法主要有以下几种：2.4.1总生物碱的检测附子总生物碱的测定有两种常用方法，其一为药典方法，即中和滴定法，分为直接滴定法和回滴定法，直接滴定法的滴定终点不明显，不易判断；回滴定法灵敏度低，误差大。

其二为酸性染料比色法，该法的原理是在酸性染料的作用下，生物碱类药物和氢离子结合而成的阳离子与酸性染料中的阴离子定量的结合成有色离子，经有机溶剂的提取后，在一定波长下测其吸收值，经数据处理后可得总生物碱的含量。

该法灵敏度高，样品用量少，专属性好，但是对实验条件的要求严格，对实验条件十分敏感，稍作改变即会对结果产生较大影响，因此最好能找出一种更好的替代方法[23]。

2.4.2 双酯型生物碱与单酯型生物碱的检测单一成分的酯型生物碱的含量测定方法主要有3种：第一为薄层色谱法，在一定的波长下用紫外或是可见光照射薄层板，在薄层板上对紫外或可见光有吸收的物质就会产生相应的斑点，对其进行扫描，扫描得到的图谱和积分值可用做药材的质量检查。

该法可同时分析多个样品，展开剂用量少、选择多，样品处理简单。

范时根[24]等以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(10:5:1)为展开剂，改良碘化铋钾试剂喷雾，样品波长500nm，参比波长600nm，测定附子中的乌头碱含量，效果良好。

第二为高效毛细管电泳法，该法具有分离时间短、杂质干扰少、使用有机溶剂少、操作简便等优点，已被香港工业署组织的中药质量控制实验室用作有毒中药材的质量管理控制，是一种很有应用前景的分析方法[25]。

第三为高效液相色谱法法(HPLC)，该法是现代中药检测中应用最多的方法，该法检测准确、灵敏度高、分离效果好、线性范围广，且能够同时检测几种生物碱含量。

近年来，运用HPLC 法对附子中的生物碱进行检测的研究报道较多，方法不尽相同。

如刘岚等[26]选用Kromasil C18(4.6mm×250mm,5µm)色谱柱，以甲醇-水-氯仿-三乙胺(70:30:1:0.15)为流动相同时检测成药中4种乌头类生物碱含量。

贾金艳[27]等采用Welchrom-C18(5μm, 4.6mm×250mm)色谱柱，以甲醇-水-三乙胺(75:25:0.033)为流动相检测了附子中新乌头碱的含量，实验结果表明该法稳定可行,准确性好。

侯大斌[28]等采用Zorbax extend-C18(150mm×4.6mm,5.0μm)色谱柱，乙腈—0. 1%乙二胺为流动相进行梯度洗脱，时间程序为0→15→30→35→60 min，乙腈体积分数相应为35%→50%→75%→35%→35%，对附子不同组织中的生物碱含量进行了测定与比较。

2.5附子炮制工艺研究概况附子因其出色的临床效果为医家首肯，然而又因其毒性，让人敬而远之，为了安全考虑，临床上必须使用经过炮制的制附子。

附子的炮制历史悠久，古人从汉代即开始对附子进行加工炮制，随着时代的发展，附子的炮制方法不断得到改进，到现在已经发展出多种工艺十分成熟的炮制方法，既有对传统炮制方法的改进又有现代创新的新炮制工艺。

现从传统炮制工艺和现代炮制工艺两方面进行说明。

2.5.1 传统炮制工艺传统的附子炮制工艺以减毒为主要目的，以此来保证用药的安全性，现在临床上使用最多的主要有以下几种：盐附子：选择大小均匀的泥附子，洗净，于食用胆巴水溶液中浸泡过夜，然后加食盐，再浸泡，每日取出晒晾，并逐步延长晒晾时间，直至附子表面出现大量结晶盐粒（盐霜）、体质变硬为止，即得盐附子。