鸡胚细胞的原代培养
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
鸡胚成纤维细胞的培养2008
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数 注意事项 1、 务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充 分混匀细胞悬液。 2、 对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下， 数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格 的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须 重新计数
[实验内容及操作程序] 1. 取胚及剪碎 将胚蛋气室端向上直立于蛋座上， 用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜， 继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去 头部、翅爪及内脏，用PBS液(简称P液)洗去体表血液， 移入另一灭菌平皿中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为 约1mm3大小的碎块，加3mL P液轻摇，后将P液与组 织碎块一起用滴管移入细胞瓶中。
6．分装到细胞瓶后放入37 ℃中进行培养.
防止污染是决定细胞培养是否成功的首要条件:
1. 在实验前,操作室,无菌工作台等实验场所需用紫外灯消 毒30分钟.
2. 实验前先洗手,并用75%的酒精消毒手及放入无菌台的 器具.
3. 在进入无菌台后,先点燃酒精灯.吸管在吸液体前,瓶口在 打开和关闭前都应在火焰上旋转灭菌,以免附在瓶口的细菌污染 液体.烧过的金属器械要待冷后才能接准确,敏捷,但不必太快,以 免引起空气流动过大,增加污染机会.为拿取方便,工作台面上的 用品要合理摆放.液体在未用前不要过早打开瓶盖,用后应及时 封闭瓶口.操作时不要向着无菌台讲话或咳嗽,以免把口腔中的 微生物带入工作台而发生污染.
1、用镊子敲碎气室的蛋壳部，掀开各层膜，取出胚体。 2、放进平皿中，去头，去肢，去内脏，用PBS洗涤。 3、洗好的组织放进另外一半平皿，加一管PBS，一起剪 碎组织。 4、静置一段时间，吸出一部分清液，将组织和少量的清 液一起移入细胞瓶。 5、吸取胰酶到细胞瓶中，放入水浴锅消化，5min摇动一 次，到液体混浊，20-30分钟。 6、加入两管PBS，吹打，静置1min，吸出上层的清液， 再加入PBS,重复1-2次。 7、加两管培养基到另外一个细胞瓶中，盖好盖子备用。 （旧瓶）加一管培养基，吹打，静置少许时间，吸取适 量的悬液（此时是细胞悬液），放入加好了培养基的新瓶 中，稍微吹散。 8、放入37℃温箱培养。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
鸡胚细胞的原代培养共28页
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养
鸡胚培养和细胞培养第⼀节鸡胚接种⼀、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多⼈类和动物病毒的⽣长增殖，是常⽤的病毒分离培养⽅法之⼀（⾐原体、⽴克次体的分离亦⽤鸡胚）。
⽬前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应⽤较多。
可⽤于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再⽤鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是⼀种不可缺少的培养⼿段。
鸡胚培养的优点是，来源充⾜，价格低廉，操作简单，⽆需特殊设备或条件，易感病毒谱较⼴，对接种的病毒不产⽣抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需⽤第⼆试验系统来测定病毒存在与否；⾮ SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚⾄还可能带有鸡⽩痢沙门⽒菌、霉形体、鸡⽩⾎病等病毒。
因此，⽤鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使⽤⾮免疫蛋来孵鸡胚，最好⽤ SPF 鸡胚。
⼀般说来，孵育⾄ 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的⽣长，因为此阶段鸡胚发育⽇趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，⾻胳不健全，还未长出⽻⽑，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获⾼滴度的病毒，14 天以后，胚胎⾻骼硬化，胚⽪表⾯⽻⽑渐⽣，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）⼀定要注意到这⼀点。
孵育⾄ 21 天左右，⽺⽔和尿囊液已全部被胚胎吸收，⼀部分卵黄陷⼊胚胎腹部，另⼀部分则仍留在体外，胚胎已发育成⼩鸡，破壳⽽出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为⽯灰质的卵壳，上有⽓孔供⽓体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使⽓体分⼦与胚胎内的液体分⼦在内外进⾏交换，因此在孵育时需要有⼀定的湿度和空⽓。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱⽔、引起鸡胚死亡。
⽓流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
原代培养(13)
二、讨论
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精擦试，试剂等瓶口也要擦试。 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时 间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，
TCID50
（50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的
传统表示法， 即能在细胞培养孔或试管内引起50%组织细胞
病变所需的病毒最高稀释度。
实验六 干扰素（IFN）效价滴定
干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能
保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒
数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。
实验结果：
一、结果观察：镜下及染色观察，一般病毒对照孔出现3＋或 4＋，干扰素保护孔CPE不再进展时，可终止反应，并染色。
二、效价计算：
实验七 中和试验 —稀释血清固定病毒法
实验结果：用倒置显微镜及活细胞染色观察。首先观察对照：
V对照（3+～4+）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为
实验小结
实验一 配液
实验二
原代鸡胚成纤维细胞的 制备、培养及观察
一、实验结果观察
• 肉眼观察：培养液颜色、浑浊度等 • 镜下观察：细胞的形态、折光性、轮廓等 • 成纤维细胞形态学特征：细胞呈梭形、长条形或不规则形。 多数情况下细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也 见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形 式。
指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体的效价 （滴度）。
实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)
13. 分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培 养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积 5ml; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 后天上午来观察细胞,并进行细胞传代. 生长面
含鸡胚鸡蛋示意图
标记气室示意图
培养中的成纤维细胞
注 意
清理台面,用品洗净,交回. 预习下节课内容：细胞的传代培养/冻存 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作, 本周的原代培养和传代培养. 要对结果进 行分析。
• B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化 接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养 器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。
• C悬浮细胞培养 某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某 种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶 段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加 适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使 用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每 毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳 定
6. 将材料转入B再次清洗; 7. A换Hank’s，材料再于A中漂洗; 8. 剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37 ℃水浴锅中 消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次; 11. 于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化. 用吸管充分吹打7~8次; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养研究
关键词 ： 鸡小肠上皮细胞 ； 分离 ； 原代培养 ； 鸡胚
中 图分 类 号 ：８ １ １ ￥３ ． 文 献 标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０— ２６ ２ １ ）６—１６ １０ ２ ８ （０ １ ０ １４—０ ７
Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｒｍ ａ ｙ Ｃｕ ｔ ｒ ｆ ｓ ｌ ｔｏ ｎ ｉ ｒ ｌｕ ｅ ｏ Ｃｈ ｃ ｅ ｉ ｋ ｎ Ｅｍ ｂｒ ｏ Ｓ ａ ｌＩ ｔ ｓｉ ａ ｉｈ ｌａ ｌｓ ｙ ｍ ｌ ｎ ｅ ｔｎ ｌＥｐ ｔ ｅｉ ｌＣｅｌ
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实验三、鸡胚细胞的原代培养lz
操作
1. 照egg, 画气室线。 egg消毒,台面消毒; 2. 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 3. 将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。
4. 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 5. 小镊撕内膜，挑出鸡胚→ A清洗,剪去头,肝,
腿,翅等。
标记气室示意图
含鸡胚鸡蛋示意图
本次实验内容
• 鸡胚是最小的不必考虑供应问题的动物 • 安全要求低
用品器材
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 吸耳球2个、 1640培养基1瓶（方瓶） 、 Hank’s液 1瓶（圆瓶）；蛋座
2.塑料篮子内： 吸管1筒， 饭盒1只（内有胶塞、剪刀、镊子、培
不同的细胞系所需要的培养基是不同的。
（一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。
2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果 的分析。
3.易发生支原体污染
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
11. 加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹 打7~8次;
12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
13. 分别取2ml和4ml细胞悬液接种至两只培养瓶 中,补加培养液至总体积5ml;
14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 15日（星期天）下午3:00来观察细胞,并进行
【医学实验】禽流感病毒的鸡胚培养法 PPT课件
4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影 响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血， 不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现 沉淀就可以判定。
思考问题
加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？ 血凝试验设置空白对照的意义？ 病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍 数如十倍比稀释？
鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚 层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚培养的病毒接种
（一）活胚检查
1.血管 2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml 尿囊液。
2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第 3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。
3. 反复吹打3～4次第2孔，从混匀的第2孔中 丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀，再 吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9孔，第9 孔经稀释吹打后吸出0.4ml，
6）将烧杯中的细胞平均分配于5个25ml细胞瓶中， 补充1640培养基至3ml，置37 ℃培养
7）培养24小时后观察细胞的生长情况并描述细胞形 态。
原代细胞的培养与维持
1) 充分漂洗; 2) 起始的2天中尽量减少振荡; 3) 分离繁殖或测定病毒之用，细胞浓度可以加大，
尽量贴壁形成厚层； 4) 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。
置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
剪去头部、翅爪及脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。
鸡胚成纤维细胞原代培养与纯化的初探
１． ． ６冰箱 ： ２ 阿里斯 顿。
１３ 主 要试 剂 ．
Ｐ Ｓ液 ； Ｍ Ｍ 培 养 基 ；． ％胰 蛋 白酶 ；． ％Ｅ — Ｂ Ｄ Ｅ Ｏ５ ２ ０ ２ Ｄ ０
Ｔ — ａ１０ Ｉ ｌ Ａ Ｎ ； Ｕ／ 的青 、 ０ ｍ 链霉素溶液 ； 灭活的血清 ； 双蒸水 ；
三蒸水 。
２ 实 验方 法
器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 。美国 Ｅ ｄｔｎｅ ｎｏ ｏｉ公 ｒ
司用 中空 纤维 生物反应 器大规 模培养 动物 细胞生 产 出免 疫 球 蛋 白 Ｇ Ａ、 和尿激 酶 、人 生长激 素等 。美 国 Ｇ ｎｎ ｅ 、 Ｍ ｅｅｔ ｈ ｅ 公 司应 用 Ｓ ４ Ｖ ０为载体 ，将 乙型 肝炎 病毒 表 面抗 原 基 因插
１． ． ５倒置 显微镜 ： ２ 上海 照相机三 厂 。
维细胞在一定生理状态下所需的各种条件 。体外培养 的细 胞在培养条件下便于控制条件 ， 可以做一些非常精确 的细
胞生 物学研 究 ， 胚成纤 维细胞 的原代 培养 在分 子生物 学 ， 鸡
细胞学 ， 遗传学 ， 免疫学 ， 病毒学， 肿瘤学 ， 及细胞工程学等
２ １ 胚成纤 维细胞 的原代 培养 ．鸡 ２ １１取材 ．．
生成素 、单克隆抗体等产品。该技术经从使用转瓶（ｌｒ ｒｌ ｏｅ
ｂｔｅ 、ｅＣ ｂ 等 贴 壁 细 胞 培 养 ，发 展 为 生 物 反 应 器 ｏｌ Ｃｌ ｕ ｅ ｔ） ｌ
（ｉ ｅｅ ｒ进行大规模细胞培养 。由于动物细胞培养技术 Ｂｏ ａｔ ） ｒ ｏ
领域 口 ， 展成 为一 门重 要 的生物技 术 ， 得显 著成 就 ， ｌ 发 ４ 并取 因而 细胞培养 是探索 和指示 细胞生命 活动规 律 的一种 简便 易行 的实验技 术 。 随着 细胞 培养 的原理 与方法 日 完善 ， 臻 动物 细胞 大规 模培养 技术趋 于成熟 。 十数年来 ， 功生产 了包括 狂犬 近 已成 病疫苗 、 疫疫苗 、 口蹄 甲型肝炎 疫苗 、 乙型肝炎 疫苗 、 细胞 红
鸡胚成纤维细胞的制作与培养 (2)
• 实水验浴仪箱器、：37C℃O培2培养养箱箱、超净工作台、倒置显微镜、 • 实验材料： • 蛋架、酒精灯、酒精碘酊棉球、试管架、消毒水等。 • 已灭菌的材料：细胞培养瓶(5-7mL)、吸管(巴氏
吸管)、三角瓶、平皿若干、漏斗、 4层纱布（在漏 斗里面）、手术剪、镊子（装在铝饭盒）、烧杯、 离心管、注射器等。
DMEM培养基
无水氯化钙 硝酸铁.9H 酸二氢钠 D-泛酸钙
2丁O 二酸氯化酒钾石酸无胆水碱硫酸镁丁二氯酸化钠钠
无水磷 叶酸肌
醇烟酰胺 甘氨酸 核黄素 盐酸硫胺
盐酸吡哆辛 葡萄糖 甲硫氨酸
L-丝氨酸
L-色氨酸
L-苏氨酸
L-酪氨酸
L-缬氨酸
L-盐酸精氨酸
L-盐酸胱氨酸
L-盐酸组氨酸
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
• 鸡胚：9~11日龄 • 消化液：含0.25％胰蛋白酶（预先置于37℃温箱
中）
• 培养基：用DMEM培养基(含5-10%胎牛血 清,100单位双抗）
• Hanks液：洗胚及吹打用
实验方法
1. 取胚及剪碎：
将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊酒 精棉消毒气室，以镊子击破卵壳，撕开卵 膜、撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌 平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，Hanks 液洗去体表血液，移入灭菌烧杯中，用灭 菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1立方毫米大小 的碎块，加入2-5mL Hanks液轻摇洗去 体表血液，静止1～2min，使其组织块下 沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，吸干 Hanks液，留组织。
• 5.过滤： • 用4层纱布将吹打后的细胞过滤到离心管中。
• 6.离心： 2000rpm，10~15min，弃上清液，用DMEM约2ml重悬 沉淀的细胞（吹打均匀）。
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2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
培 养 基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液， 分天然培养基和合成培养基。
合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小
牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不 死．但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血 清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细 菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液
内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细 菌的生长。
抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素
联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终 使用浓度为每毫升100单位。
培养基的配制
RPMI-1640培养粉 碳酸氢钠 青、链霉素 1袋 2.0 g 各100单位/毫升
13. 分别取2ml和3ml细胞悬液分别接种至两只培
养皿和两只培养瓶中,分别补加培养液至总体 积3.5ml（培养皿）和5ml（培养瓶）; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 星期五下午6：00来进行细胞传代和冻存的 实验。
生长面
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
含鸡胚鸡蛋示意图
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
6. 将鸡胚转入培养皿 B再次清洗（培养皿B装有 Hank’s液）; 7. 培养皿A换Hank’s，材料再于培养皿A中漂洗; 8. 剪取适当的组织块,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块 (保持湿润）。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,用锡箔纸覆口,拿出工作台,于37 ℃ 水浴锅中消化5~7分钟(严格，6分钟)!,中间 摇动2~3次; 11. 加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹 打7~8次（请减少气泡产生）; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
血清的成分
血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有
以下成分： ①多种蛋白质（白蛋白 、球蛋白 、铁蛋 白 等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质， 如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长 因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。
血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细
胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养 基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复 杂血清因子的综合反应。
不同的细胞系所需要的培养基是不同的。
（一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。 2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结 果 的分析。 3.易发生支原体污染
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用
人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分: 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点: 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血 清)。
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、蛋座 培养瓶装1瓶：有1640完全培养基（方瓶，淡红 色；含血清）；Hank’s液 （圆瓶，无色）；饭盒1 只（内有胶塞、剪刀、镊子、 培养皿、烧杯、培养 瓶等）；胰酶1管（1ml, EP管内；标有E）；灭菌枪 头4-5支；
实验的可重复性？？
无血清培养基
1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂 体细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血 清培养基中成功地生长和增殖。 应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等 研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如 激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成 分组成。 优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确 性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和
加三蒸水 至 1000ml, 调节pH值至7.2，过 滤除菌。加无菌血清至终浓度为 10％。
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
本次实验内容
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——接种——加培养液— 培养
上次实验部分
器材：5ml枪头15支、培养瓶4只、10ml烧杯1只、25ml 烧杯1只、25ml三角瓶1只、培养皿1套、中号镊子1只、 小镊子1只、胶塞4+1只、剪刀1把、饭盒1个、脱脂棉 少许、裁纸刀1把、纱布1块、2ml管2个、1.5ml管3个 包装：中镊/小镊/剪刀 1套 烧杯 大１（塞纱布），小1 胶塞 2＋１个 （2小/1大） 饭 培养皿 1套／包 盒 锥瓶 １个 封口 培养瓶 封口 1份1个 1份3个/包 枪头 塞好棉花 单独包，然后30支一大 包 2ml、1.5mlEP管 1份1个，写好标记 标记：饭盒、瓶大小包、组号、姓名（ 1组2人）