鸡胚细胞的原代培养

加三蒸水 至 1000ml, 调节pH值至7.2，过 滤除菌。加无菌血清至终浓度为 10％。
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
本次实验内容
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——接种——加培养液— 培养
上次实验部分
器材：5ml枪头15支、培养瓶4只、10ml烧杯1只、25ml 烧杯1只、25ml三角瓶1只、培养皿1套、中号镊子1只、 小镊子1只、胶塞4+1只、剪刀1把、饭盒1个、脱脂棉 少许、裁纸刀1把、纱布1块、2ml管2个、1.5ml管3个 包装：中镊/小镊/剪刀 1套 烧杯 大１（塞纱布），小1 胶塞 2＋１个 （2小/1大） 饭 培养皿 1套／包 盒 锥瓶 １个 封口 培养瓶 封口 1份1个 1份3个/包 枪头 塞好棉花 单独包，然后30支一大 包 2ml、1.5mlEP管 1份1个，写好标记 标记：饭盒、瓶大小包、组号、姓名（ 1组2人）
不同的细胞系所需要的培养基是不同的。
（一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。 2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结 果 的分析。 3.易发生支原体污染
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用
实验的可重复性？？
无血清培养基
1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂 体细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血 清培养基中成功地生长和增殖。 应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等 研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如 激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成 分组成。 优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确 性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和
血清的成分
血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有
以下成分： ①多种蛋白质（白蛋白 、球蛋白 、铁蛋 白 等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质， 如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长 因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。
血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细
胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养 基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复 杂血清因子的综合反应。
13. 分别取2ml和3ml细胞悬液分别接种至两只培
养皿和两只培养瓶中,分别补加培养液至总体 积3.5ml（培养皿）和5ml（培养瓶）; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 星期五下午6：00来进行细胞传代和冻存的 实验。
生长面
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、蛋座 培养瓶装1瓶：有1640完全培养基（方瓶，淡红 色；含血清）；Hank’s液 （圆瓶，无色）；饭盒1 只（内有胶塞、剪刀、镊子、 培养皿、烧杯、培养 瓶等）；胰酶1管（1ml, EP管内；标有E）；灭菌枪 头4-5支；
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液
内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细 菌的生长。
抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素
联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终 使用浓度为每毫升100单位。
培养基的配制
RPMI-1640培养粉 碳酸氢钠 青、链霉素 1袋 2.0 g 各100单位/毫升
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒精灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分: 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点: 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ培养基(如血 清)。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
培 养 基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液， 分天然培养基和合成培养基。
合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小
牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不 死．但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血 清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细 菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。
含鸡胚鸡蛋示意图
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
6. 将鸡胚转入培养皿 B再次清洗（培养皿B装有 Hank’s液）; 7. 培养皿A换Hank’s，材料再于培养皿A中漂洗; 8. 剪取适当的组织块,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块 (保持湿润）。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,用锡箔纸覆口,拿出工作台,于37 ℃ 水浴锅中消化5~7分钟(严格，6分钟)!,中间 摇动2~3次; 11. 加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹 打7~8次（请减少气泡产生）; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;