高级生化的文献翻译

由两个蛋白质组学技术用来识别比较蛋白质赤霉素在水稻中的调控蛋白质组学已成为在植物生物学各领域的蛋白质的大规模分析的重要方法。我们比较了两种蛋白质组学技术，二维液相色谱（2D-LC）和荧光二维差异凝胶电泳（2D-DIGE），他们找出水稻赤霉素（GA）调节蛋白的能力。两周龄水稻幼苗分别用或不用5 IM赤霉素48小时和蛋白质从叶鞘的基部区域中提取。该蛋白由两种技术的分离之后，赤霉素应答的蛋白质的氨基酸序列使用蛋白质测序和质谱进行分析。2D-LC和2D-DIGE能够解决1248蛋白组分和1500蛋白质，分别。出于这些，2D-LC确定9蛋白质表达上调和9中被下调GA处理;2D-DIGE确定4上调和4下调蛋白质。两种技术检测到重叠套蛋白质。例如，胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶和光系统II放氧复合蛋白被鉴定为赤霉素调节蛋白的两种方法。此外，这两种方法揭露未在2D-PAGE，随后通过考马斯亮蓝染色检测其以前没有报道赤霉素调节未知的蛋白质，和新的蛋白质。这些结果表明，这两种方法是其中的一些非常有用的工具，用于检测蛋白质这可以起到在各种生理和发育过程中的植物。

关键词：水稻·叶鞘·赤霉素·2D-LC·2D-DIGE

前言

在后基因组时代，蛋白质组学正变得越来越重要，因为蛋白质是直接相关的功能。因为蛋白参与活细胞中大多数过程，蛋白质的详细了解是该研究的关键的细胞和生物分子水平。此外，核苷酸序列提供有关的蛋白质补充的基因组编码只有有限的信息;转录后调控经常导致缺乏转录水平和蛋白丰度之间的相关性。蛋白质组学必须解决的问题包括从简单的识别蛋白质对翻译后修饰，蛋白质- 蛋白质相互作用，和亚细胞定位的鉴定。因此，蛋白组学是日益复杂的细胞过程的调查越来越重要。它也被成功地用于遗传和生理研究。蛋白质组学已成为在植物生物学各领域的蛋白质的大规模分析的重要方法。随着一些植物的基因组序列的可用性，植物蛋白质组学是打在基因组注释着越来越重要的作用，最近已经对植物生长发育，抗病性强，光合作用和植物功能等方面的理解应用。在过去的十年里，水稻蛋白质组学领域长足的进步。水稻是最重要的作物在世界之一，是主要的主食一半以上的世界人口。水稻是由于其相对小的大约440兆的基因组也为单子叶作物物种的优良模式植物。在日本晴品种的完整的基于地图的基因组序列已经完成，并且因此预计粳稻的完整基因组会解码，并提供给公众。多种多样的完整基因组的分析的一部分，基因预测程序已被用于建立蛋白质的类别;再加上蛋白质功能研究，这些类别提供了更多的来自生物体的基因和基因组序列的有用的分类方案。到目前为止，水稻蛋白质组学一些研究已经揭示不同的功能类别的蛋白质。水稻蛋白质组数据库网站（http://gene64.dna.affrc.go.jp/RPD/main.html）已经建成并提供了对水稻蛋白质组研究进展的大量信息。在水稻蛋白质组的以前的研究，两维（2D）的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）加上直接蛋白质测序和/或质谱（MS）用于蛋白质的分离和鉴定。自从O'Farrell9表明，蛋白质可以基于解决在其等电点和分子量通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，2D-PAGE仍然受到质疑作为分析复杂的最有效的方式蛋白质混合物。现代大幅面凝胶（例如，20〜20厘米）是高度可再现的和考马斯亮蓝（CBB）或银染色允许几百蛋白质可视化。所检测到的斑点的颜色密度和大小使蛋白质定量。这些方法的精确度，但是，是由多数的染色技术的低动态范围的限制。荧光染料用于蛋白的最新发展克服了这一限制。尽管2D-PAGE 的力作为蛋白质组学工具，等电点的和分子量，可以通过这种技术来解决的范围是有限的。因为它是难以分开使用等电聚焦碱性蛋白（pH值>8.0）根据奥法雷尔的方法（IEF）凝胶制备，固相pH梯度凝胶，其覆盖电点的范围从6.0到10.0，也已在使用的第一维。蛋白质分离的这些限制，必须克服，以便识别在给定的蛋白质的所有蛋白质。二维液相色谱（LC），它结合pH梯度和反相柱，是有望延长蛋白质分离的范围内的新的蛋白质组学技术。同位素

编码的亲和标签（ICA T）技术最近已开发出用于在无2D-PAGE的定量比较。然而，关于再现性和所需的建立统计显着性尚未完全resolved.11替代“凝胶少”的方法，如多维蛋白质鉴定技术（MudPIT）重复数的问题，已有效地用于许多目录多肽在从几个生物体总蛋白的混合物，包括rice.14,15然而，虽然MudPIT是一个极好的手段，以产生本特定蛋白质样品中的蛋白质的详尽目录，它不会产生可再现的定量信息。植物细胞分裂，生长和分化需要在开发过程中进行精确控制，以确保组织的协调发展。植物激素是影响这些现象的最重要的因素之一。植物细胞分裂，生长和分化需要在开发过程中进行精确控制，以确保组织的协调发展。植物激素是影响这些现象的最重要的因素之一。因此，植物激素赤霉素（GA）在很多重要的作用植物的生长发育，如种子发芽方面，茎伸长，叶片扩展，以及花和果实发育。GA 代谢和GA反应途径之间的密切互动最近revealed.The GA及其反应途径的代谢还集成了与其他信号通路调节植物生长，因此，GA对发展的影响很可能是极其复杂的。在这项研究中，2蛋白质组学技术，2D-LC和荧光2D差异凝胶电泳（2DDIGE），比较了其识别由植物激素的GA在水稻调节蛋白的能力。

实验步骤

植物材料和治疗。水稻(Oryza sativa L. cv.Nipponbare)幼苗生长于下白色荧光灯塑料育苗盆（600mol/平方米/秒，12小时光照期/天）在28℃和75％相对在一个生长室中的湿度（三洋，日本大阪）。在2周后播种，育苗盆转移至塑料容器中含有5 IM赤霉素（和光纯药，大阪，日本）48小时。该实验重复10次;用于2D-LC实验5次，对于2D-DIGE另外5次。六十苗，30苗的控制和治疗30苗，用于每个实验。

二维液相色谱分析。叶鞘（500毫克）的基底区域匀浆用1mL的50mM的Tris-HCl（pH 8.0）中，并与1.2毫升含有7.5M尿素，2.5M硫脲，12.5％甘油，50mM的三 - 裂解缓冲液盐酸（pH值8.0），2.5％正辛基葡糖苷，6.25毫三 - （羧乙基）膦盐酸盐和1.25毫蛋白酶抑制剂（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），用玻璃研钵和杵在冰上。每个匀浆离心15000克5分钟，并除去上清液。将沉淀用一个附加的1.2毫升的裂解缓冲液并离心。该合并上清液用经过2D-LC分析所述ProteomeLab PF2D试剂盒（Beckman Coulter公司，富勒顿，CA）中根据制造商的建议。用于第一维，将上清液（2毫克蛋白）注射到由AKTA探险家经营的色谱聚焦柱（Amersham Biosciences社制，皮斯卡塔韦，新泽西州），以及沿分离电点梯度。用于第二维，所述的pI级分使用通过HPLC系统（吉尔森路易斯中心），操作反相柱分离。 HPLC数据分析，比较对照组和治疗，并显现为与ProteoVue软件（Beckman Coulter公司）的梯形图案。实验重复5次。荧光染料标记。叶鞘（500毫克）的基底区域匀浆用1mL含有8M尿素，2％的Nonidet P-40（NP-40），0.8％两性电解质（pH为3.5-10和pH5-8，Amersham Biosciences 社制裂解buffer9的），5％2-巯基乙醇和5％的聚（乙烯吡咯烷酮）-40，使用玻璃研钵和杵在冰上。每个匀浆离心15000克5分钟并除去上清液。将沉淀物洗涤用另外1.2毫升的裂解缓冲液并离心。该合并的上清液混合，用50％三氯乙酸酸为10％的最终浓度。将溶液保持冰和30分钟离心15000？克10分钟。该所得沉淀物用100 IL冰冷乙醇，悬浮在标记缓冲液并用Cy5标记的Cy3或荧光染料（Amersham Biosciences社制）每个荧光染料标记的样品的等体积混合，加入到裂解缓冲液，通过2D-PAGE分离，如下所述，和扫描利用台风8600k可变成像仪（Amersham Biosciences社制）。图像映射与DeCyder软件分析（Amersham Biosciences社制）。实验重复5次。