利用荧光染料法检测单核苷酸多态性(SNP)

利用荧光染料法检测单核苷酸多态性（SNP）

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，并且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP是继RFLP 和STR后的第三代分子标记，具有数量多、分布广和遗传稳定等特点。它与许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，SNP分析对于群体遗传学、疾病相关基因的研究、新药研究、临床检验和分子诊断等领域有着重要作用。

荧光定量PCR中的SNP分析平台主要是基于等位基因特异性杂交原理，通过检测PCR过程中产生的荧光信号来区分等位基因，每检测一个SNP位点需要一对TaqMan探针(或分子信标)和一对位于检测位点的上下游引物。下面介绍一种新的基于荧光定量PCR 检测SNP位点的方法，它不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。

该方法使用了两种不同的等位基因特异性正向引物，每个正向引物3′端的最后一个碱基对应于SNP位点的二等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料（SYBRGreenI）来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。

为了区分这两种扩增产物，我们在其中一个等位基因特异性引物的5′加一个20bp左右含GC重复序列。由于DNA的溶解温度主要与其片段长度和GC含量有关，经过修饰后的引物的长度和GC含量明显高于另一个等位基因特异引物，因此，使用这两种引物后的PCR扩增产物有着不同的Tm值。在PCR扩增结束后，运行一个溶解曲线程序，即让产物慢慢从60度升温到90度，从溶解曲线图上就可以分析出哪种等位基因参与了PCR扩增，由此也得到了相应的基因组的基因型。

补充一点：

1. 在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA 双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料与双链产物结合，经检

测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量监督了。

2 .HRM，即High Resolution Melt，高分辨率溶解曲线，这是一种通过比对不同DNA分子溶解度的不同从而检测突变的方法。可以用来检测突变、SNP等，目前在突变筛查、产前诊断、肿瘤早期诊断乃至生物分子进化方面都有应用，不过大部分的文章都集中在国外。可以进行HRM检查的机器要求要在DNA双链变性的过程中以0.1-0.3度/s的速率变化，从而保证所做出曲线的准确性。目前我所知道的能进行检测的仪器包括：RotorGene 6000（主要用于RT-PCR，HRM属于副业）；HR-1（Idaho tech），单通道，一次上样10微升，需要毛细管，不能进行PCR；Lightscanner，多通道，分96和384两种，不能进行PCR）。