第四章 细胞破碎技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞数的计算方法： 直接计数法：血球计数板 间接计数法：细胞破碎后，测定细胞悬浮液中特定细胞 释出物的浓度
16
四、细胞破碎方法的选择依据
应从以下方面考虑： ➢ 细胞的处理量 ➢ 细胞壁的结构、强度 ➢ 目标产物对破碎条件的敏感性 ➢ 破碎程度 具体的操作条件应从以下三方面进行权衡： • 高的产物释放率 • 低的能耗 • 便于后续提取
于团状、丝状菌
✓处理能力可达0.1-100 m3/h
7
8
X挤压法（改进的高压匀浆法）
• 浓缩的菌体悬浮液冷却至-30 ℃ ~-25 ℃形成冰晶体，利用 500MPa以上的高压冲击
• 适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留 率高
• 主要用于实验室 • 对冷冻－融解敏感的生物物质不适合
第四章 细胞破碎技术
生物分离的目的组分： • 胞内产物 • 胞外产物
细胞破碎的难易：
• 与细胞种类有关 • 与目的物的稳定性有关
细胞： 细菌 酵母 霉菌 动物细胞 植物细胞
1
一、细胞壁的结构
1. 细菌细胞壁结构： G+: 肽聚糖 G-: 外壁层为脂多糖
和磷脂、脂蛋白；内 壁层肽聚糖。 （脂多糖需Ca2+、Mg2+
研磨法图
• 利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵 内进行（或细胞匀浆器）
• 常用磨料：石英砂、氧化铝 • 增效方法：预先冷冻样液
4
旋刀匀浆器
5
研磨法仪器
研钵
细胞匀浆器
6
2.大规模方法： 高压匀浆法
•过程：高压(可达50-100Mpa)喷出—碰撞—释放到低压 •高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液 •影响因素：压力、循环次数、温度 ✓适用于酵母和绝大多数细菌，不适
分离纯化包含体蛋白的基本步骤： 收集细胞→破碎细胞→分离包含体→包含体洗涤→
溶解包含体（目标蛋白变性溶解）→蛋白质产物的构型 复原（目标蛋白的复性）
19
•溶解包含体：加变性剂溶解
常用6 mol/L盐酸胍替代8 mol/L脲溶解包含体。偶 而也可用1％ SDS溶解包含体，但在后面的步骤里较 难除去。
13
（三）化学破碎法
通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。 常用有：酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。
➢ 表面活性剂、碱——溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。 表面活性剂如胆酸盐、SDS、Triton X-100、Tween等。
➢ 酸——蛋白质水解成氨基酸，常用6M HCl。 ➢ 有机溶剂——可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。如丁酯、丁醇、
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
15
三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
时间、液体的温度等 • 优点：操作简单，液量损失少。 • 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
11
超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
12
（二）物理破碎法
反复冻融法
物理Байду номын сангаас总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
才能稳定）
2
2. 酵母：由酵母纤维素组成，主要成分是葡聚糖和 甘露聚糖
3. 霉菌：几丁质和葡聚糖 4. 植物细胞：纤维素、半纤维素、果胶、木质素等 5. 动物细胞：无细胞壁
3
二、常用细胞破碎方法
（一）机械破碎法
1.实验室方法(小规模)： 旋刀匀浆法图
• 通过固体剪切力进行破碎，剧烈 • 能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同 • 注意防止升温
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
20
17
实际应用中，常采用多种方法结合： 主要为机械法与非机械法的结合，如 酶+高压匀浆 酶+超声 其他如：化学法+冻融法
18
五、基因工程包含体的纯化方法
包含体：外源基因在细胞内高度表达蛋白，因此 凝集而成的无活性固体颗粒。 包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便 可沉淀，与细胞碎片和可溶性产物分离。
丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
14
（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
✓ 细菌：溶菌酶，G- 还需加入EDTA ✓ 酵母：消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶 ✓ 霉菌：几丁质酶、蜗牛酶 ✓ 植物：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 ✓ 自溶法：细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶
高速珠磨法（beadmill）
•利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌 •提高破碎效率的方法：提高搅拌速度、增加小珠量、降 低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率
9
高速珠磨机
10
3. 超声波破碎法（ultrasound）
• 超声波振荡器，15-25kHz的超声波 • 超声设备：槽式，探头式 图 • 超声波作用机理：空化作用 • 破碎作用影响因素：超声波的声强、频率、处理
• 机理：冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能； 胞内水形成冰晶粒胀破细胞
• 缺点：溶质释放、扩散慢
渗透压破碎法（溶胀法） • 机理：低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法 • 操作：一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中 • 操作方法改进：细胞预先置于高渗介质中 • 特点：最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等
16
四、细胞破碎方法的选择依据
应从以下方面考虑： ➢ 细胞的处理量 ➢ 细胞壁的结构、强度 ➢ 目标产物对破碎条件的敏感性 ➢ 破碎程度 具体的操作条件应从以下三方面进行权衡： • 高的产物释放率 • 低的能耗 • 便于后续提取
于团状、丝状菌
✓处理能力可达0.1-100 m3/h
7
8
X挤压法（改进的高压匀浆法）
• 浓缩的菌体悬浮液冷却至-30 ℃ ~-25 ℃形成冰晶体，利用 500MPa以上的高压冲击
• 适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留 率高
• 主要用于实验室 • 对冷冻－融解敏感的生物物质不适合
第四章 细胞破碎技术
生物分离的目的组分： • 胞内产物 • 胞外产物
细胞破碎的难易：
• 与细胞种类有关 • 与目的物的稳定性有关
细胞： 细菌 酵母 霉菌 动物细胞 植物细胞
1
一、细胞壁的结构
1. 细菌细胞壁结构： G+: 肽聚糖 G-: 外壁层为脂多糖
和磷脂、脂蛋白；内 壁层肽聚糖。 （脂多糖需Ca2+、Mg2+
研磨法图
• 利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵 内进行（或细胞匀浆器）
• 常用磨料：石英砂、氧化铝 • 增效方法：预先冷冻样液
4
旋刀匀浆器
5
研磨法仪器
研钵
细胞匀浆器
6
2.大规模方法： 高压匀浆法
•过程：高压(可达50-100Mpa)喷出—碰撞—释放到低压 •高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液 •影响因素：压力、循环次数、温度 ✓适用于酵母和绝大多数细菌，不适
分离纯化包含体蛋白的基本步骤： 收集细胞→破碎细胞→分离包含体→包含体洗涤→
溶解包含体（目标蛋白变性溶解）→蛋白质产物的构型 复原（目标蛋白的复性）
19
•溶解包含体：加变性剂溶解
常用6 mol/L盐酸胍替代8 mol/L脲溶解包含体。偶 而也可用1％ SDS溶解包含体，但在后面的步骤里较 难除去。
13
（三）化学破碎法
通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。 常用有：酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。
➢ 表面活性剂、碱——溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。 表面活性剂如胆酸盐、SDS、Triton X-100、Tween等。
➢ 酸——蛋白质水解成氨基酸，常用6M HCl。 ➢ 有机溶剂——可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。如丁酯、丁醇、
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
15
三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
时间、液体的温度等 • 优点：操作简单，液量损失少。 • 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
11
超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
12
（二）物理破碎法
反复冻融法
物理Байду номын сангаас总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
才能稳定）
2
2. 酵母：由酵母纤维素组成，主要成分是葡聚糖和 甘露聚糖
3. 霉菌：几丁质和葡聚糖 4. 植物细胞：纤维素、半纤维素、果胶、木质素等 5. 动物细胞：无细胞壁
3
二、常用细胞破碎方法
（一）机械破碎法
1.实验室方法(小规模)： 旋刀匀浆法图
• 通过固体剪切力进行破碎，剧烈 • 能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同 • 注意防止升温
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
20
17
实际应用中，常采用多种方法结合： 主要为机械法与非机械法的结合，如 酶+高压匀浆 酶+超声 其他如：化学法+冻融法
18
五、基因工程包含体的纯化方法
包含体：外源基因在细胞内高度表达蛋白，因此 凝集而成的无活性固体颗粒。 包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便 可沉淀，与细胞碎片和可溶性产物分离。
丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
14
（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
✓ 细菌：溶菌酶，G- 还需加入EDTA ✓ 酵母：消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶 ✓ 霉菌：几丁质酶、蜗牛酶 ✓ 植物：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 ✓ 自溶法：细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶
高速珠磨法（beadmill）
•利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌 •提高破碎效率的方法：提高搅拌速度、增加小珠量、降 低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率
9
高速珠磨机
10
3. 超声波破碎法（ultrasound）
• 超声波振荡器，15-25kHz的超声波 • 超声设备：槽式，探头式 图 • 超声波作用机理：空化作用 • 破碎作用影响因素：超声波的声强、频率、处理
• 机理：冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能； 胞内水形成冰晶粒胀破细胞
• 缺点：溶质释放、扩散慢
渗透压破碎法（溶胀法） • 机理：低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法 • 操作：一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中 • 操作方法改进：细胞预先置于高渗介质中 • 特点：最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等