诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤

诱变育种流程及紫外诱变育

种的详细步骤

-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

诱变育种的一般步骤：

1.首先是天然菌种的选育：

调查研究及查阅充分的资料

↓

设计实验方案

↓确定采集样品的生态环境

采样

↓确定特定的增殖条件

增殖培养

确定特殊的选择培养基及可能的

定性或半定量快速检出法

平板分离

↓

原种斜面

↓确定发酵培养基础条件

筛选

↓

初筛（1株1瓶）

↓

复筛（1株3～5瓶）

↓结合初步工艺条件摸索

再复筛（1株3～5瓶）

↓

3～5株

↓

单株纯种分离

生产性能试验

→毒性试验

菌种鉴定

2.诱变菌种：

出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。

诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。

紫外线诱变育种：

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-

265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不

要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。

由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

具体操作步骤

1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml 左右，作为待处理菌悬液。

3．取2～4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。