如何快速建立手性药物分析的LC及LC-MS-MS方法

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快速建立LC—MS／MS分析生物样品的方法

迅速发展，液相色谱一串联质谱联用（ＣＭＳＭＳＬ／／）
技术是目前公认的选择性最好的复杂样品分析技术之一＿。其次，ｌ］在药代动力学研究中，常需要对经生物样品中的微量乃至痕量成分进行定量分析，常规的分离检测技术难以满足复杂介质中痕量成分准确定量的要求，ＣＬ —ＭＳＭＳ以其高灵敏度和高选／
问题进行探讨，结出若干快速建立Ｌ — ／总ＣＭＳＭＳ分析生物样品的方法。
关键词Ｌ — ／ＣＭＳＭＳ生物样品分析基质效应
１前言
生命分析化学的重点在于为生命科学研究提供高效、简便、确的分析手段，求分析化学与生物、准要生化等相关学科更加紧密地结合；生命分析化学而所面临的最大挑战之一，分析工作必须在极其复是杂的样品基质中进行＿；命分析化学面向的对象１生
组分的分析。如何在如此复杂的基质中高灵敏度、
质谱条件、流动相、品制备方法等如何进行优化以样减小基质效应、器保护以及工作中的经验等问题仪
的探讨，总结出若干快速、敏和可靠的Ｌ —ＭＳ灵Ｃ／ＭＳ方法，用于快速分析生物样品。可
往往是成分、态复杂的生物样品，如组织提取形例
效应（ｔｉｆｅｔ是指标本中除分析物以外的其ｍａｒｅｆｃ）ｘ

手性药物的色谱制备拆分技术

手性药物的色谱制备拆分技术1李燕1，何彬1, 21.桂林医学院药学院，广西桂林 (541004)2.四川大学华西药学院，成都 (610041)E-mail：yanli@摘要：本文将近年来应用于手性药物拆分的色谱技术进行了整理、概括，着重比较了它们在制备规模上的优缺点。

尽管各种色谱拆分技术在手性药物的拆分上都有应用，但就工业制备来说，HPLC、SMB、SFC最有前景。

色谱技术在手性药物的制备拆分领域将发挥越来越重要的作用。

关键词：手性药物，拆分，色谱技术，综述中图分类号：O6 化学1. 引言手性是自然界的本质属性之一。

生命体系就是一个手性环境，生物体的基本组成成分蛋白质、多糖、核酸、酶等几乎都是手性的。

20世纪60年代震惊世人的沙利度胺事件证实了手性药物的不同对映体间往往显示出不同的药理学、毒理学及药代动力学性质。

为了保证用药安全，美国FDA1992年就发布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的消旋体新药的生产着均需提供有关报道，说明药物中所含对映体的各自药理作用、毒性和临床效果。

据相关统计数据，2002年全球500种畅销药物中手性化学品药物有289种，占59%。

专家预测，2010年世界手性化学品药物总销售额可望超过2500亿美元。

手性化合物的获得一般可以通过手性合成和手性拆分两种途径。

手性合成不但步数多，产率不高，至今还未得到广泛的应用。

因此，目前大约65%非天然对映体药物是都是通过手性拆分的方法制造的。

手性拆分技术主要包括：结晶法、色谱法、膜法、手性萃取等。

其中色谱法因其快速、高效、成本相对低等优势而得到广泛的应用。

本文综述了几种色谱拆分方法，侧重比较了它们在工业领域中进行生产的优缺点和可能性。

2. 液相色谱2. 1高效液相色谱（HPLC）HPLC在拆分对映体时通常有三种方法：1）利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性HPLC所拆分；2）在流动相中加入手性添加剂，利用非手性固定相HPLC进行拆分；3）利用手性固定相（Chiral Stationary Phase，简称CSP）的HPLC进行拆分。

lcmsms的开发流程

lcmsms的开发流程
LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱法）的开发流程概括如下：
1. 方法设计：根据待测物性质选择合适的液相色谱条件，如色谱柱类型、流动相体系、梯度洗脱程序等；同时确定质谱参数，如离子源类型、母离子及子离子的选择、碰撞能量等。

2. 标准品制备：配制含有待测物的标准溶液系列，用于绘制校准曲线和方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度验证。

3. 方法优化：通过反复实验调整液相色谱和质谱条件，优化待测物的分离度和离子化效率，确保最佳检测性能。

4. 方法验证：按照法规或实验室标准，对方法进行特异性、线性、准确度、精密度、检测限和定量限等各项性能验证。

5. 样品前处理：制定样品提取、净化、浓缩等步骤，并验证前处理方法的回收率和干扰消除效果。

6. 应用与验证：在实际样品中应用开发的方法进行分析，确认方法在复杂基质中的适用性及可靠性。

整个流程需结合实验数据反馈不断迭代优化，最终建立稳定的LC-MS/MS分析方法。

如何利用LC-MSMS,更快更好的建立生物样品分析方法

如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物样品分析方法?前言：以前曾在实验室的seminar上，做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。

时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛，在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。

首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。

药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们所说的“生物样品” (Biosample)。

生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS，更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？下面我主要从以下四个方面进行阐述：一、色谱-质谱条件的确立1、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。

虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的，基本原理如图所示。

我们在确定方法时，主要考虑以下几个因素：（1）化合物的性质：包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。

首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的pKa值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。

（2）流动相添加剂的选择：在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。

但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。

在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图一。

快速建立LC_MS_MS分析生物样品的方法

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快速建立 # ! N&! 1 ! 1 分析生物样品的方法
张娟红 # 王 # 荣 # 谢 # 华 # 贾正平 + # 张 # 强
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液相色谱质谱联用技术取得了较大进展 # 该技术可对药物及其体内代谢产物进行定性 % 定量 ## 摘 # 要 # 近年来 # 分析 # 在药物代谢研究中得到广泛应用 & 然而 # 如何更快更好地建立生物样品分析方法还有待进一步研究 &本文对 !! 如何制备样品以减小基质效应 # 以及仪器维护的经验等 # N& ! 1 1 分析生物样品时如何优化质谱条件和流动相 # 问题进行探讨 # 总结出若干快速建立 # !! N& ! 1 1 分析生物样品的方法 & 关键词 # # !! N& ! 1 1 生物样品分析 # 基质效应
在液质定量分析中 " 由于质谱检测中所采用多反应监测 # 方法" 要求准确选择好被检测化合物 !O!$ 的母离子和子离子 " 因此" 它具有很高的专属性" 基于这点 " 在对多个化合物同时进行检测时 " 不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析 ! 但由于生物样品中大量基质的存在会需要强调的是 " 严重的干扰和影响化合物的测定 " 因而需要利用色谱方法将化合物与基质分开 " 从而降低基质效应的
/ ,( 影响 " 即降低离子抑制 ’ !

LCMSMS农药一齐分析法(Ⅱ)

1. 适用范围适用于LC/MS/MS农药的一齐分析法（Ⅱ）中农药的检测。

2. 编制依据依据日本厚生劳动省《LCMS农药一齐分析法Ⅱ》编制。

3. 方法原理水果、蔬菜、加工产品中的农药残留经乙腈提取，提取溶液经净化、浓缩用50%的甲醇定容后，LC/MS/MS测定，用外标法定量。

4. 试剂4.1 乙腈：色谱级4.2 丙酮：色谱级4.3 正己烷：色谱级4.4 乙酸乙酯：色谱级4.5 无水硫酸钠：分析纯4.6 甲苯：色谱级4.7甲醇：色谱级4.8 氯化钠：分析纯4.9 0.01M 盐酸：8.29ml浓盐酸定容至1000ml5. 仪器设备5.1 Waters UPLC TQD5.2 食品加工器5.3菜刀，案板5.4电子天平5.5均质机5.6布氏漏斗，分液漏斗，普通漏斗，滤纸5.7梨形瓶（250ml，100ml）5.8 锥形瓶（200ml，100ml）5.9 C18固相萃取柱（1G 6ml）5.10氨基复合柱（Carbon/NH2 500mg 6ml）5.11硅胶柱Silica （500mg 6ml）5.12旋转蒸发仪5.13 氮吹仪5.14 玻璃离心管（10mL）5.15 分液漏斗振荡器5.16 真空泵5.17 移液枪（1mL，200μL）6. 分析步骤6.1 试料的制备：（除不加样品外，试剂空白与样品同步处理）将送交实验室的不少于500克的样品于食品加工器搅细（对于大块状的样品可先用水果刀切成小块，再放于食品加工器中搅细）。

粉碎后的样品装于一次性的塑料袋中备用。

6.2 提取6.2.1 准确称取10.0g（精确到0.1g）搅细的样品（原料称取20.0g）于均质杯中，加入70ml乙腈，在高速组织捣碎机中均质5min。

6.2.2 将样品减压抽滤，用30ml乙腈冲洗均质杯，也过滤，合并滤液。

6.2.3 将滤液倒入装有7gNaCl的300ml分液漏斗中，用20mL0.01M 盐酸冲洗三角瓶，也倒入分液漏斗中，在分液漏斗震荡器上剧烈震荡10min，静置10min，使乙腈相和水相分层。

LCMSMS农药一齐分析法

LCMSMS农药一齐分析法简介：LC-MS/MS是一种基于液相色谱联用串联质谱的分析技术，广泛应用于农药残留监测领域。

它具有高灵敏度、高选择性和高效率的优点，可以实现多种目标物同时检测和定量。

LC-MS/MS农药一齐分析法的原理：该分析方法首先通过液相色谱将样品中的目标物进行分离，然后经过串联质谱仪的产物离子扫描模式进行检测和定量。

在这种分析方法中，每个目标物都有一个特定的质谱图，通过与事先建立的质谱库中的标准谱进行比对，可以确定每个目标物的含量。

方法的步骤：1.样品的制备：将样品加入适量的溶剂中，并通过固相萃取或液-液萃取等方法将目标物提取出来。

然后使用气相色谱或高效液相色谱等方法对提取物进行净化和预处理。

2.样品的进样：将制备好的样品注入液相色谱系统中，通过自动进样器进行进样。

3.液相色谱的分离：使用液相色谱系统进行目标物的分离。

选择合适的色谱柱和流动相进行优化，以达到理想的分离效果。

4.串联质谱的检测：将液相色谱分离得到的目标物进入串联质谱仪进行检测和定量。

在质谱检测中，使用多反应监测（MRM）模式进行目标物的筛选和定量。

5.数据处理和结果分析：使用专业的数据处理软件对得到的质谱数据进行处理和分析，计算出每个目标物的浓度，并与质谱库中的标准谱进行比对确定目标物的含量。

LC-MS/MS农药一齐分析法的优点：1.高灵敏度：LC-MS/MS技术可以在低浓度下检测和定量目标物，其灵敏度通常比传统的色谱方法高几个数量级。

2.高选择性：通过质谱仪的选择离子模式和多反应监测模式，可以有效地排除样品中的干扰物，提高分析的选择性。

3.高效率：LC-MS/MS技术可以实现多种目标物的一齐分析，大大提高分析效率和样品通量。

4.宽线性范围：LC-MS/MS技术的线性范围通常较宽，可以适应不同浓度范围内目标物的测定需求。

总结：LC-MS/MS农药一齐分析法是一种高效、高灵敏度和高选择性的分析技术，在农药残留监测和食品安全领域具有重要的应用价值。

药物研究中手性分离分析方法及技巧

药物研究中手性分离分析方法及技巧手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。

液相色谱法成为目前手性药物分离测定的首选方法，根据实际工作中需要的手性分离问题，总结如下：1、流动相手性分析很关键的一项是流动相的选择，手性分析一般都采用正相，使用最多的流动相是正己烷、正庚烷、乙醇和异丙醇这四种，其中起洗脱作用的流动相是乙醇和异丙醇，正己烷和正庚烷用来调节流动相的洗脱强度。

正己烷和正庚烷对于样品分离没有什么太大的影响，不会改变选择性和分离度，通常都可以混用，不过正庚烷比正己烷对人体的伤害要小很多，但价格是后者的一倍，所以欧美的很多大制药公司多使用正庚烷，而国内多使用正己烷。

乙醇和异丙醇对样品的分离起关键的作用，不同的醇有不同的选择性，改变醇的种类可以改变选择性，常用的醇类是乙醇和异丙醇，甲醇不能使用是因为它和正己烷、正庚烷不互溶，叔丁醇粘度太大，一般作为添加剂配合乙醇或者异丙醇少量使用，提供特殊的选择性，通常能起到意想不到的效果。

一般情况下分析手性样品，很多人推荐首选异丙醇，但是我喜欢首选乙醇，因为乙醇气味比异丙醇好一点，且乙醇做流动相压力要低一些，实际上二者差别不是太大。

流动相里经常需要添加酸或者是碱来调节峰形，常用的酸有三氟乙酸、乙酸和甲基磺酸，碱一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和异丁胺的，流动相里添加酸和碱的浓度一般要求控制在0.2%(体积比)以下，我们一般用0.1%，使用的原则一般是酸性样品加酸，碱性样品加碱，但实际上很多样品是即含酸性基团又含碱性基团，这就要看哪个基团作用强了，对于某些含氨基的两性样品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一个非常好的选择，磺酸基能够抑制氨基的碱性，又能提供一个酸性的流动相环境，使样品既能得到很好的分离又能获得对称的峰形。

一般做纯度分析检测杂质含量时我们要求尽量的采用低波长来让尽可能多的杂质有紫外吸收，而做手性分析时我们需要采用尽可能高的波长来去除在低波长下才有吸收的杂质的干扰，一般原则还是尽量选择样品紫外吸收最好的地方来获得较高的灵敏度，但流动相里添加二乙胺会导致在低波长下基线波动变大，系统难以平衡，这种情况下一般要提高检测波长，实际操作过程中有些样品在高波长下吸收非常差，只能用低波长检测，这样的样品可以尝试在样品稀释的时候加入过量的二乙胺(但不宜太多)，而流动相用中性，从而获得满意的分析结果。

LC-MSMS定量分析流程与经验

LC-MSMS定量分析流程与经验LC-MS/MS定量分析流程与经验第一步： Q1 SCAN——确定母离子的质荷比●根据待测化合物性质，选择分析的极性(＋/－)、离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间●确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。

参数设置：扫描方式：Q1 Scan质量范围：Parameter Range，100～MW+30，t=1～2secCenter Width，MW±5Da，t=0.5sec通过手动调节DP、GS1，使喷雾平稳、有效第二步：Product Ion Scan ——确定子离子的质荷比●得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜●平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位参数设置扫描方式：Product Ion Scan质量范围：Parameter Range，50～MW+10，t=1～2sec通过手动调节CE第三步：优化化合物参数●根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对●选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间●用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD参数。

各离子对应分别设定。

●初步建立MRM方法●一般优化两次，以得到比较确切的结果第四步：方法转化：将连续进样方法→LC-MS方法●关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。

●单击Acquire中Build Acquire Method，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。

●设置色谱同步。

●设置色谱参数，分析时间一般为0.6～1min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。

第五步：FIA-优化Source参数●将前面用过的样品溶液稀释100～1000倍。

LC、LCMS(MS)检测原理及维护培训教材(PDF 68页)

溶剂前处理-过滤
过滤：0.45 μm或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液
滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：
适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于 DMF，THF， CHCl3 等溶剂
• APCI：对样品的基质和流动相组成的敏感度小；可使用稍高浓度的挥发性强的缓冲液；有机溶剂的种类和溶剂分子的加成影响离子化效率和产物
ESI和APCI的比较(3)——溶剂
• ESI：溶剂pH对在溶剂中形成离子的分析物有重大的影响；溶剂pH的调整会加强在溶液中非离子化分析物的离子化效率
• APCI：溶剂的选择非常重要并会影响离子化的过程；溶剂的 pH值对离子化效率有一定的影响
去离子水重蒸；二次或三次重蒸水；
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水
水的等级
未注入样品时空白梯度的色谱图
水中不纯物的出峰
水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱
有机溶剂的等级
有机溶剂的等级
HPLC级优级纯分析纯
微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45 μm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2 μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
正离子模式还是负离子模式?
• 质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和特性等
– 由于C-O、C-N、双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子
– 含–COOH, -F, -Cl, -HSO3 的化合物由于具有较强的质子给予能力，更倾向于形成负离子

LC-MSMS在临床中的方法开发和验证

液质联用(LC/MS): LC为液相色谱仪；MS为一种能够生成离子，在气态中根据质荷比的不同将其分离并进行检测的仪器。

LC/MS以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，因而兼具有液相色谱高分离度与质谱高灵敏度的特点。

分析的样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

方法开发的过程包括：文献检索、质谱方法建立、液相方法建立和前处理方法建立四大步。

第一、准备方法开发所需检测仪器、辅助设备、相关耗材及试剂等。

其中，对于分析方法需要关注以下内容：（1）样品前处理方法：样品类型、样品量、处理方法的选择，需要考虑样品处理的效果、试剂、耗材及时间成本；（2）质谱方法：离子化方式、质量分析器的选择、仪器型号、扫描方式的选择、离子检测通道及相应质谱参数；（3）液相色谱方法：色谱柱的选择、流动相的组成、洗脱方式、进样量。

第二、质谱方法建立。

质谱方法建立需完成以下步骤：1.配制纯标准溶液进行质谱扫描，根据目标分析物的极性大小选择合适的离子化方式（ESI、APCI、APPI等），并确定正负离子模式；2.确定定性定量离子对，在实现分析方法特异性和灵敏度要求的基础上，最好选择两个以上质谱响应高、选择性好、稳定性好的特征碎片离子分别作为定量和定性离子；临床LC-MS/MS方法大多为定量检测，通常采用多反应监测（MRM）或选择性反应监测（SRM）扫描方式；3.确定合适的离子源参数和扫描参数。

第三，建立液相色谱方法建立。

液相色谱方法的建立需要考虑以下内容：1.色谱柱的选择，包括填料类型（非极性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，极性固定相氰基、硅胶、氨基等）、色谱柱可耐受PH值范围（分析物的酸碱性质）；2.流动相的选择，包括流动相的纯度（超纯水、色谱级溶剂）、流动相的种类（甲醇、乙腈、水等）；3.流动相添加剂的选择，使用挥发性添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等），尽量不要使用不挥发性添加剂（硫酸盐、磷酸盐等），防止影响离子化效率，损坏仪器；4.洗脱方式的优化，包括采用等度洗脱还是梯度洗脱、起始溶剂的比例、运行时间、柱温、进样体积等；考虑到临床样本基质的复杂性，尽量选择梯度洗脱模式。

高通量筛选药物中快速移植 GC-MS 筛选方法至 LC-MSMS

高通量筛选药物中快速移植GC-MS筛选方法至LC-MS/MS
目前还有很多应用GC-MS进行高通量筛选药物，但是，GC-MS的样品制备非常耗费时间，需要经过SPE萃取、衍生等步骤，而且分析时间也较长，通常一次分析需要几小时甚至数天，因此，筛选效率较低。

由于LC-MS/MS技术的快速发展，实际上，可以把GC-MS需要经过复杂处理的样品如血液、尿液样品等
经过简单的处理如萃取后直接进入LC-MS/MS进行快速筛选。

比如，1 mL血样用3 mL 丙酮沉淀蛋白质后，蒸发至干，重新溶解于0.5 mL甲醇溶液中，取10 µL进样。

LC：Metasil Basic C8 2 mm×50 mm，200
µL/min。

MS：QTRAP®系列LC-MS/MS，TurboIonSpray®离子源。

通过以下流程快速筛选：①设定筛查化合
物列表(比如同时筛选100种甚至更多种药物)；②采集MS/MS数据(全扫描确证)；③进行库检索，对比
结果。

图16. LC-MS/MS高通量筛选药物步骤
图17显示了同步筛选25种药物的MRM色谱图，200 µL/min流速，所有药物均在20 min前出峰。

图18显示了如果采用1.0 mL/min流速，Turbo V™离子源，分析时间将缩短至3 min内，极大地提高
了筛选速度。

图17. 25种药物的MRM总离子流图（流速0.2 mL/min）图18. 25种药物的MRM总离子流图（流速1 mL/min）。

质谱(lc-ms)方法开发指南

质谱（LC-MS）方法开发指南一、概述质谱（LC-MS）是一种强大的分析技术，广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。

然而，开发一个可靠、灵敏的LC-MS方法并非易事，需要仔细的实验设计和严谨的操作。

本文旨在提供一份LC-MS方法开发的指南，帮助研究人员高效地完成LC-MS方法的开发工作。

二、样品准备1. 样品的选择：LC-MS分析的样品应具有一定的纯度和稳定性，避免样品中含有大量的杂质或不稳定的成分。

2. 样品的前处理：对于复杂样品，需要进行适当的前处理，如固相萃取、液-液萃取等，以提高分析的准确性和灵敏度。

三、色谱条件的选择1. 色谱柱的选择：根据样品性质和分析需求选择合适的色谱柱，如C18柱、C8柱等。

2. 流动相的选择：优化流动相的组成、pH值和流速，以提高分离效果和信号强度。

3. 温度控制：对于一些温敏感化合物，需要对色谱柱进行恒温控制，以避免样品分解或形成不稳定的反应物。

四、质谱条件的选择1. 离子源的选取：根据样品的性质选择合适的离子源，如电喷雾离子源（ESI）或化学电离源（APCI）等。

2. 探测器的选择：选择适当的探测器，如飞行时间质谱仪（TOF-MS）、三重四极杆质谱仪（Q-TOF）、四极杆质谱仪等。

3. 离子监测条件的优化：优化离子源的参数和质子化/去质子化离子片段的监测条件，以获得清晰的质谱图谱。

五、方法验证1. 灵敏度的验证：进行样品的定量限、检出限和线性范围的验证，以确保LC-MS方法的灵敏度满足分析要求。

2. 选择性的验证：对可能干扰的成分进行测试，验证LC-MS方法的选择性和特异性。

3. 精密度和准确度的验证：进行重复性和回收率的验证，评估LC-MS 方法的精密度和准确度。

六、实验操作的注意事项1. 仪器的维护和校准：定期对LC-MS仪器进行维护和校准，保证仪器的稳定性和准确性。

2. 样品的处理和储存：严格按照操作规程对样品进行处理和储存，避免样品受到污染或降解。

LC-MS定性分析思路与方法

6 Date | AB CONFIDENTIAL
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确定离子化方式
● 根据样品性质确定离子化方式: 高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不行的：极端非极性化合物如苯等;APCI不行的：非挥发性样品;热稳定性差的样品
● 杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好
● 样品浓度不够：有时需要浓缩
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LC条件的优化
● LC梯度的设定,目的是快速分离,峰形好,缩短时间,提高效率,可以将所有化合物都冲出，防止影响下一个样品的测定。
采取梯度洗脱，如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量，是提高灵敏度的一种有效措施，但是分析时间较长，且需要有色谱柱平衡的时间。
● 注意要采集一段时间的溶解样品的溶剂本底信息，DP同采样相同，以便扣除本底干扰，可高、低各做一次，例如20V、 80V等，所以低流速FIA方式最适合
● 注意，当样品溶液内含有离子抑制物质时，直接进样可能看不到分子峰，此时需要经色谱柱分离或重新处理样品。

多肽药物氨基酸手性分析(LC-MS法)

多肽药物氨基酸手性分析(LC-MS法)多肽药物是由多个氨基酸通过肽键连接而成的生物活性分子，通常来说，它由10~100个氨基酸连接而成，相对分子质量低于10000。

多肽药物大多来源于内源性肽或者天然肽，因此对人体没有副作用或者副作用很小。

相比于蛋白类药物，多肽药物还具有稳定性好、纯度高、生产成本低、免疫原性低等优势，加上多肽合成技术的快速发展与成熟，使得多肽药物成为近些年生物药研发的焦点。

目前，多肽药物已广泛应用于肿瘤治疗、自身免疫性疾病以及某些心血管疾病、糖尿病等的诊断和治疗，具有广阔的应用前景。

多肽药物通常由L-型氨基酸构成，D-型氨基酸在生物体内相对少见。

二者结构相似，但立体结构存在较大差异，因此对生物体产生的效应也就不同。

多肽药物的药效通常与其与生物体内特定的受体或酶的相互作用有关，而受体或酶对手性非常敏感。

因此，如果多肽药物中的氨基酸手性与受体或酶的要求不匹配，药效可能会受到较大影响。

生物制品表征氨基酸手性分析示意图。

液相色谱质谱联用技术（LC-MS）是一种强大的分析方法，结合了液相色谱技术和质谱技术的优势，其在多肽药物氨基酸手性分析中发挥着强大的功能，LC-MS能够准确测定氨基酸的手性构型。

通过LC-MS的检测，可以获得每个氨基酸峰的峰面积和峰高度，从而计算出它们的相对含量和手性纯度。

多肽药物氨基酸手性分析LC-MS法的优点如下：首先，LC-MS方法具有高分辨率和高灵敏度，能够准确测定多肽药物中氨基酸的手性构型。

其次，LC-MS方法可以同时分析多个氨基酸，提高分析效率和样品通量。

此外，由于质谱技术的应用，LC-MS能够提供关于氨基酸结构和序列的额外信息，有助于对多肽药物的质量控制和结构确认。

百泰派克生物科技（BTP）采用ISO9001认证质量控制体系管理实验室，获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务。

我们基于高通量质谱平台分析，为您提供高效精准的一站式氨基酸手性分析服务，只需要将您的实验目的告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责所有项目后续，包括样品处理、上机分析、数据分析和项目报告。

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MSMS分析方法的建立

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS/MS分析方法的建立作者：兰天吴腾等来源：《中国医药科学》2013年第09期[摘要] 目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇（S1P）快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。

方法采用C17-S1P作为内参，甲醇一步法进行蛋白沉淀，随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。

流动相为甲醇-0.1%甲酸水（95∶5，v/v），流速0.2 mL/min，每个样品的分析时间为4 min。

细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加；而经DMS处理后S1P含量显著下降。

结果 S1P的标准曲线线性范围为0.1～10 ng/mL。

LC-MS操作流程

基本操作流程开机：1、打开液氮罐自增压阀门，调节液氮罐分压表的输出压力为0.7MPa（~110psi），并确认前级泵的镇气阀处于关闭状态。

打开高纯氮主阀门。

调节纯氮气钢瓶次级减压表输出压力至0.15MPa（最大不要超过0.2MPa或30psi）。

2、打开计算机，网络交换机（LAN Switch）电源。

3、打开液相各个模块电源。

4、打开质谱前面左下角的电源开关，这时可以听到质谱里面溶剂切换阀切换的声音。

同时机械泵开始工作，仪器开始自检。

等待大约两分钟，听到第二声溶剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，表示仪器自检完成，可以联机。

5、在计算机桌面上双击MassHunter 采集软件图标“Data Acquistion”，进入MassHunter工作站。

关机：1、确认气镇阀处于关闭状态(顺时针拧紧);2、在MassHunter采集软件内点击MS 三级四极杆图标，选择“Vent”执行放空步骤。

3、出现放空相关提示，如果确认要放空，选择“Yes”。

4、可以在三级四极杆的Diagnosis界面观察涡轮泵转速的下降情况。

5、大约十分钟以后，会出现“放空完成，可关闭电源”提示，选择“OK”。

6、关闭MassHunter 软件。

然后关闭质谱及LC各模块的电源。

关闭电脑，同时关闭液氮罐自增压阀门。

方法编辑：1、在桌面上双击数据采集软件图标，打开MassHunter采集软件，进入MassHunter 数据采集软件。

在这个界面中完成所有HPLC 和三级四极杆的方法参数设置。

2、调谐步骤确认离子源的参数如下：Drying Gas Flow: 10 L/minDrying Gas Temperature: 350℃Nebulizer Pressure: 30-50 psiSheath Gas Flow: 7 L/minSheat Gas Temperature: 250Nozzle Voltage: 1500VCapillary Voltage: 4000V （正离子模式）3500V （负离子模式）3、新建方法（1）通过菜单File>New>Method 创建一个新的方法。

LC-MS在手性农药对映体分析中的应用

LC-MS在手性农药对映体分析中的应用
王楠;刘宇辉;梁啸
【期刊名称】《自然科学》
【年(卷),期】2024(12)3
【摘要】目前使用的农药中,手性农药占40%。

手性农药具有一个或多个手性中心,同时也具有多对对映异构体,它们在生物活性、生态毒性和环境行为等方面表现出对映选择性差异。

利用液相色谱–质谱联用技术(LC-MS)可以分析出如活性高、毒性低的优势对映异构体,推动农药单体的生产和推广,对食品和环境安全具有重要意义。

本文综述了LC-MS在手性农药杀菌剂、杀虫剂和除草剂对应异构体分析中的应用,旨在为农药单体使用提供依据。

【总页数】5页(P519-523)
【作者】王楠;刘宇辉;梁啸
【作者单位】辽宁大学药学院沈阳
【正文语种】中文
【中图分类】S48
【相关文献】
1.两种叶菜中5种典型手性农药对映体的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-
MS/MS)分析方法研究2.农产品中手性农药对映体残留色谱法分析研究进展3.手性有机磷农药对映体在衍生化环糊精类手性固定相上的分离4.手性有机磷农药对映体在纤维素类手性固定相上的分离
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用LC分析生物体液中手性药物

用LC分析生物体液中手性药物
陆峰
【期刊名称】《药学情报通讯》
【年(卷),期】1994(012)001
【摘要】当前测定生物体液中药物和代谢中光学异构体,先对药物作液-液提取,进行手性衍生化或直接分离,在手性固定相(CSP)上形成稳定性不同的瞬间过渡态非对映体,达到对映体分离,直接辩识,虽然有时可以进行衍生化但分析物的分离和检出率并没有因此而得到提高,而且方法复杂,冗长.CSPs也难以适用于生物体液.因此,目前生物体液中药物手性识别需先对手性药物进行提取,除去样品杂质,再注入CSP柱作直接手性识别.间接手性分离需一种高光学纯、高化学纯的手性试剂衍生化以形成离子对或共价的非对映体衍生物,于非手性固定相中分离,这样成本低,分离和检出率均有所提高,衍生化试剂光学纯度要求很高,否则其动态分离会影响定量准确性,但是,即使溶液衍生化实现自动化,对生物体液中药物进行在线预柱标记仍十分困难.【总页数】3页(P65-67)
【作者】陆峰
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
【相关文献】
1.生物检材中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析 [J], 向平;沈敏;沈保华;马栋;卜俊;姜宴;卓先义
2.固相微萃取在生物体液分析中的研究进展 [J], 张丽;顾明松;谢剑炜
3.用液相色谱法分析生物体液中的手性药物 [J], Krull,IS;杨雪梅
4.环糊精及其衍生物在手性药物分离分析中的应用 [J], 祝芳
5.生物电阻抗分析仪在肺叶切除术患者体液含量及分布评估中的应用 [J], 钟颖;马莉;陈文栋;毕春
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Ristocetin A
H H H N O OH H N O H NH 2
B
O HH H N
3
C
O N H
O
A
HO CH 3 HO HO OH O OH OH O OH
D
O OH
Features of CHIROBIOTIC Phases
Reversed phase – Largest and most versatile number of separations Polar Organic phase – Fast kinetics, second major group of separations – Best suited for LC/MS systems Normal phase – Generally provides ca 10-15% of the total methods Column coupling possible – Rapid, broad screening protocols Each column can be used in all 3 modes
HO H O NH O O NH NH HO O O NH COOH NH 2 HO OH
amine
H3C NH
Multiple use Covalent bonding Broad applicability
p-acceptor
C
Cl O NH
NH O H HO
A
Cl HO HO HO O O O O
OH H N HO HO
6.81 7.48
8.50
C(CH3 )3
9.47
12.64 13.84
Oxprenolol
OH O H N CH2
Propranolol
CH 3
Sotalol
7.83
11.82 CH 3
CH3
7.08
12.55
O OH
N H
CH 3
8.71 9.66
O S H3C N H O
3
O O C O N O H H
Cl
H
B O H H N
N H H A HN H
H H N
O N O H H H D O NH 2
Teicoplanin Aglycone
Cl O HO O H B O H H N H O O C O N H H O H H N O N O H H H D O O H OH HO HO NH 2 Cl
amino acids, neutrals, acids, sulfur containing molecules and certain primary amines
CHIROBIOTIC TAG
Mobile phase possibilities:
Reversed phase – methanol as the organic
modifier
Polar ionic© phase – as for the CHIROBIOTIC T
Neutral molecules use single solvent: 100%
MeOH, EtOH, IPA, ACN. No acid or base required
Normal Phase – good for large number of chiral

What is the Polar Organic Mode?
Ionic
The mechanism for the POM on the
CHIROBIOTIC phases is predominantly ionic, making it essential for acid and base to be added. Thus, Polar Ionic Mode©
• Techniques for chiral LC/MS/MS • Advances in preparative chiral LC
March 2003
Proposed Structure of Vancomycin
hydrogen bonding & dipole stacking sites
Metoprolol
OH O H N CH3
H3CO
CH3
CHIRACEL OD
Peak 1 – 11.9 min. Peak 2 – 18.2 min.
20/80/0.1: IPA/Hex/DEA
Peak 1 – 6.8 min Peak 2 – 7.5 min
CHIROBIOTIC T
100/0.2/0.1: MeOH/HOAc/TEA
Chiral Method Development Techniques for Analytical & Prep HPLC
Advanced Separation Technologies
AGENDA:
• Method development techniques for the
CHIROBIOTIC series of chiral LC columns
Mobile phase: Hexane/EtOH, 50/50
Flow rate: 2 mL/min
Teicoplanin
HOOC OH HO
HO
HO
O
O OH OH
CH 2OH OH
N H H A HN H
HOOC
Key sites
HO
Proposed Structures of Glycopeptide CSPs
HO HO O O OH OH O H2N O CH 3 O O H N H COOCH HN O O O O O OH OH HO HO OH O OH OH O OH CH 3
sulfoxides, coumarins
Selectivity of Methanol for Neutral Molecules on CHIROBIOTIC TAG
5-Methyl-5-phenylhydantoin 4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinone
1. 2.
Alprenolol
CH2
CH3
O OH
N H
CH3
CHIRACEL OD
Peak 1- 12.4 min Peak 2 - 16.4 min 20/80/0.1: IPA/Hex/TFA
CHIROBIOTIC V
Peak 1 – 7.69 min. Peak 2 – 8.33 min. 100/0.01/0.01: MeOH/HOAc/TEA
100 % MeOH with added acid and base (typically 0.1%, each with a range of 1.0 to 0.001%), or equivalent salts

Method development is very simple and fast
Broad Selectivity Based on the Same Stereogenic Center: CHIROBIOTIC T: Amino Alcohols
Albuterol
CH3
Atenolol
NH2 O H3 C N H OH O
Metoprolol
OH O H N CH 3 H3CO CH3
5.08 min 9.62 min
1. 2.
5.35 min 8.21 min
100% MeOH @ 0.8 mL/min
100% MeOH @ 0.8 mL/min
Chiral Sulfoxides on CHIROBIOTIC TAG
F
S
O
p-Flurophenyl
7 7.6 5.9 9
methyl sulfoxide
Normal phase vs Polar Ionic© Phase
CHIROBIOTIC columns appear to be complementary to cellulosic and amylosic phases
– Many separations that are done on Chiracel in normal phase can also be accomplished in the polar ionic© mode on CHIROBIOTIC columns – If a compound is polar, solubility may be better in the PIM rather than normal phase – The PIM can be advantageous and safer for prep
CHIROBIOTIC AG
Selectivity on the CHIROBIOTIC T can be
enhanced with CHIROBIOTIC TAG (aglycone from teicoplanin) for certain molecular types
Enhanced resolution for , , and cyclic
Ionic
What is the Polar Organic Mode?

The Polar Organic Mode terminology is now frequently applied to the Daicel phases, but in this case it means 100% organic only, usually MeOH, ACN or MeOH/EtOH The mechanism (predominantly hydrogen bonding) for the POM on Daicel is different from that on the CHIROBIOTIC phases and the optimization process is different