薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分
最全的TLC经验薄层层析显色剂
最全的TLC经验薄层层析显色剂
一、TLC经验简介
TLC（Thin Layer Chromatography，薄层层析）是一种常用的分离技术，它是一种物理分离方法，用于分离从未接触过的化学混合物。
它主要利用不溶于固定相的物质在一定的有机溶剂/挥发溶剂系统中的互相溶解性，从而将混合物分离成不同组分。
TLC可以大量分离未知物质、识别未知物质、鉴定物质的纯度、测定物质的比例、比较不同批次的物质、测定固体液体及气体的组成等。
二、TLC实验步骤：
1.准备薄层层析膜：TLC膜一般用玻璃或石英板，平板制成，一般涂有活性炭、白土、石英砂、铝粉等。
2.准备支持介质：需要选择的是盐酸和醇溶液，如85%乙醇-盐酸、苯甲酸-乙酸-乙醇和砒霜-乙醇等。
3.准备液体样品：需要用适当的溶剂溶解样品，然后将溶解后的液体样品用滤纸过滤，去除杂质后，备用。
4.加载樣品：将液体样品加入到提前准备的膜上。
5.洗膜：在膜上加入支持介质，移动膜直至支持介质溶解样品，使样品在膜上分离成几个不同的区域。
6.显色：用显色剂溶液浸泡膜，以使样品呈现出特定颜色。
三株海洋放线菌次级代谢产物的研究中期报告
三株海洋放线菌次级代谢产物的研究中期报告
本研究旨在分析三株海洋放线菌的次级代谢产物，包括提取、纯化
和结构鉴定。
截至目前为止，已经完成了以下工作：
1.菌株的筛选和培养
筛选了三株海洋放线菌，分别命名为M1、M2和M3。
这些菌株在富含葡萄糖的土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长出优质的菌落。
我们选择使用玉米汁培养基进行大规模菌体培养。
2.次级代谢产物的提取和分离
通过对培养基中的菌体进行提取和分离，从而获得了三种次级代谢
产物。
3.分离和纯化
通过色谱技术（包括硅胶柱层析、倒置层析和HPLC）对次级代谢产物进行纯化和分离。
在M1和M2菌株中，我们成功地分离了目标化合物，并获得了高纯度的结晶物质。
在M3菌株中，由于与其它化合物的相互作用，需要进一步优化分离纯化的步骤。
4.结构鉴定分析
使用一系列的光谱技术（包括核磁共振、质谱和红外光谱）对M1和M2中的化合物进行了结构鉴定和确认。
在M3中，仍需使用更多的化学
方法进行分离和鉴定。
总的来说，我们已经成功地获得了三种海洋放线菌的次级代谢产物，并对其中两种进行了结构鉴定。
下一步将会进一步优化分离纯化的步骤，并对M3的化合物进行更深入的研究和鉴定。
TLC生物自显影技术在药物筛选中的应用_曲建博
从天然产物中得到的成分往往要进 行生物活性测定。传 统的活性测定方法需在整个动物或某个 器官上进行, 这 要求 被测 化合物首先 被分离出 来, 并且 要有足够 大的量, 许多 从 天然产物中得到的成分不能满足这一要 求[ 1] 。目前常用的微
量 生 物 活 性 测 定 方 法, 如 微 生 物 抑 制 法 ( ST O P 、L A ST 、 CA ST 、F A ST 、BR -T est、Delv otest P ) 、酶法( Penzyme) 、免疫 测 定 法 [ enzyme -liked immuno so rbent assay ( EL ISA ) 、Cite Pr obe ] 和放射 性免疫测定法( Char m) , 可对微 量化合物进 行 较准确的活性测定, 但是这些方法在使用过程中有一定 的局 限性。例如, 微生物抑制法虽然操作简单、耗 费低, 但是 其专 属性 和灵敏度不 高, 易 出现假阳性 结果; 酶法和放 射性免 疫 测定 法虽然灵敏 度高, 但其花费相 当昂贵, 一般不 适用于 未 经分离的天然药物筛 选[ 2] 。而 T L C 生物自显影法可弥 补以 上不 足, 其操 作简单、耗费低、灵敏度 和专属 性高, 是一种 快 速测定生 物活性的方法[ 2～4] , 尤其适用于 对具有抗菌/ 真菌, 抑制胆碱酯酶以及清除自由基和抗氧化 等活性成分的筛选。 笔 者 就 T L C 生 物 自 显 影 技 术在 药 物 筛 选 中 的 应 用 作 一 综述。 1 TLC 生物自显影对抗菌/ 真菌化合物的筛选 1. 1 T L C 生物自显影: T LC 生物自显影是一种将薄层 色谱 分离和生物活性测定相结合的药物筛选 方法。利用薄层板将 混合物( 如植物提取物) 在薄层板上展开后, 将薄层板与 接种 了病原微生物( 人体致病菌或植物致病菌) 的 培养基相接触, 通过一定的培养, 非活性部位会被生长出的病原微生物 所覆
海洋微生物抗肿瘤活性物质研究进展
１１０１４的发酵产物分离得到２５个化合物，包 括４个五元环内酯类化合物，８个酚类衍生 物和１３个环二肽，采用ＳＲＢ法测定了１３个 环二肽的体外抗肿瘤活性，其中环二肽１０在 ５ ｍｇ·Ｌ＿１时有较强的体外抗肿瘤活性，１， ３，４，８，９，１２具有弱的体外抗肿瘤活性，同时 发现这些环二肽的体外抗肿瘤作用在５～ １００ ｍｇ·Ｌ＿１范围内不具有浓度依赖性，其 它化合物未表现出体外抗肿瘤活性，朱天骄 等［２６３从一株海洋放线菌￥１００１的活性部位 分离鉴定了１个异黄酮类化合物，１个苯甲 酸类衍生物，以及６个环二肽类化合物，并经 活性测试阐明了环二肽类化合物为该菌株的 主要活性相关成分。文献报道也显示环二肽 类化合物可作为免疫功能调节剂和抗肿瘤制 剂，并且体内体外试验证明均有效。测定了 化合物１～８对人白血病细胞Ｋ５６２的抑制 活性，结果表明环二肽类化合物４，５和７在 １０ ｔ比ｍｏｌ·Ｌ叫时即能表现出细胞坏死活性， 抑制率分别为１５．４％，１９．３％和１８．６％，其 他化合物在１００ ｇｍｏｌ·Ｌ＿１高浓度时也未检 测到相关活性。江红等口７］在筛选新免疫抑
摘 要：概述２０００年以来海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究进展，着重介绍海洋细菌、海洋放线茵及海洋 真茵抗肿瘤活性物质取得的成果，并展望该领域研究的广阔应用前景。 关键词：海洋微生物；抗肿瘤活性物质｝海洋细茵Ｉ海洋放线茵；海洋真茵 中图分类号：Ｒ９３１．７７，Ｒ９７９．１文献标识码：Ａ文章编号：１００２—３４６１（２００８）０３—００５１—０６
海洋细菌抑菌活性菌株的筛选
株 芽孢 细 菌 和 １８株 粪 大 肠 杆 菌 ． 用 纸 片 法 对 其 押 茵 活 性 进 行 检 测 ， 果 表 明 ：１ ０ 利 结 １７ 株 海 洋细 菌 具 有 押 茵 活性 ， 占总 分 离 菌 株 的 ２ ％ ； 般 细 菌 、 ４４ 一 芽孢 细 茵 、 大肠 杆 粪 菌 的押 茵 活 性 菌株 分 别 占各供 溉 茼株 的 １ ． ％ 、７ ３ 、５ ２％ ； 菌 活 性 菌 株 的 比 ７ １ ２ ％ ３ 抑 纠 与 样 品 来 源 密切 相 关 ， 各 娄 海 洋 细 菌 的抗 茼谱 有 很 大 的 不 同 ． 且
１ 材 料 和 方 法
１ １ 样 品 采 集 ．
ｊ ２０ 一 ０ ０年 ３月 至 ２ ０ ０ １年 ５月 分 别 从 福 建 的厦 Ｉ 泉 州 、 狮 、 江 、 清 、 山 和 南 海 、 ］、 石 晋 福 东 东 海 、 海 等地 海 域 采 集 海 洋底 质 和 水 样 ， 在 厦 门海 域 采 集 生 物 样 品 黄 并
关键词： 洋 细 菌 ： 茵 活 性 ； 海 押 筛选
中 图分 类 号 ：９３ ２ ０ ９ ９ 文献 标识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ０８ ５ 【 ０ ２ ０ －１ １０ １０ — １ ０ ２ ０ ） ２０ ８ —６
海洋微 生物有 产生 生物活性 物质的 巨大潜 力 ， 目前 已从 海 洋 微 生 物 （ 括 海 洋 细 菌 、 洋 包 海 真 菌 和 海 洋 放 线 菌 ） 分 离 到 许 多 海 洋 生 物 活 性 物 质 ， 些 物 质 化 学 结 构 丰 富 多 样 ， 多 分 子 中 这 许 结 构 新 颖 独 特 ， 陆 地 生 物 所 不 具 有 的 ）因此 ， 们 对 从 海 洋 环 境 中 极 其 多 样 性 的微 生 物 中 是 ． 人 开 发 到新 的特 效 药 寄 予 极 大 的 希 望 目前 ， 已知 的 大 多 数 生 理 活 性 化 合 物 的 产 生 是 菌 株 特 异
一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究
一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究放线菌,尤其是链霉菌,作为抗生素的重要来源,一直以来都是天然产物研究的热点之一。
本文以德国北海海水中分离到的一株海洋放线菌为研究对象,通过对其16S r DNA测序鉴定其与链霉菌Streptomyces sp.strainnenu<sub>D</sub>S<sub>2</sub>1有99%的同源性。
本实验将该菌编号为AC1。
通过初期大米培养基发酵,发现其代谢产物种类丰富,且乙酸乙酯及正丁醇萃取部分对水稻纹枯病菌、梨黑斑病菌表现出良好的抑菌活性。
对该菌采用大米发酵以及高氏一号液体培养基发酵,之后用硅胶柱、凝胶柱、C18反相柱以及高效液相色谱柱等色谱分离纯化方法结合薄层色谱分析对其发酵产物进行分离纯化,对分离得到的代谢产物成分采用质谱（MS）以及1D和2D 核磁（1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC）等波谱技术进行结构鉴定,并进行抑菌活性的研究,最终结果如下:（1）从AC1的大米发酵代谢产物中分离出了编号为I-VIII共8个单体化合物。
其中I号化合物为2,3-dihydroxybenzamide,II号化合物为pyramidamycin B,VIII号化合物为flufuran,V、VI、VII号化合物为首次从自然界中分到的酰胺类天然产物,III、IV为新的化合物。
I,II,III,IV,VII号化合物为苯甲酰胺类化合物,V,VI,VIII号化合物为呋喃类化合物。
从高氏一号液体发酵代谢产物当中分到了IX和X两个单体化合物.其中IX号为苯甲酰胺类化合物3-[（3’-amino-3’-oxoprop-1’-en-2’-yl）oxy]benzamide。
X号化合物为新的链型酰胺类化合物。
在分离鉴定的10个化合物当中,VIII 化合物为该菌产生的主要成分。
（2）将分离得到的10个化合物采用滤纸片扩散法对番茄灰霉病菌、苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌5种植物病原真菌以及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种病原细菌作体外抗菌实验,筛选其中具有抗菌活性的成分,其中VIII化合物对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、苹果斑点落叶病菌都具有一定的抑菌活性,V,VI化合物则表现出对枯草芽孢杆菌的抑制活性。
海洋细菌的分离、鉴定及抗烟草花叶病毒活性分析
ｐ ｒｃｅａ ｄｔｅｉｈｂｔ ｎｒｔｓｗｅｅ３ ２ ％ ａ ｄ３ ．８ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ａｔ ｌ ｎ ｉｉｏ ｅ ｒ ６．９ ｉ ｈ ｎ ｉ ａ ｎ ５０ ％ ｅｐ ｃｉ ｌ ．Ａｃ ｏｄｎ ｅｍｏｐ ｄｏ ｉａ ｈ ｓｏｏｉａ ｈ ｒｃｅｓａ ｄ ｖ ｃ ｒｉｇｔ ｔ ｒ ｈ ｇｃｌ ｙ ｉｌｇｃｌｃ ａａ ｔｒ ｎ ｏｈ ｐ １ Ｓ ｒ Ａ ｅ ｕ ｎ ｅ ｔａｎ９ ｗａ ｄ ｎｉｅ ｓＢａ ｉｕ ｅ ｕ ，ｓ ａ ０Ｗａ ｅ ｔ ｅ ｓ ｃ ／ｕ ｑ ／ ｒ ． ６ ＤＮ ｓ ｑ ｅ ｃ ，ｓｒｉ ｓｉｅ ｔ ｉ ａ ｃ ｌｓ ｒｓ ｆ ｄ ｌ ｃｅ ｔ ｉ １ ｓｉ ｎｉ ｄ ａ ｒｎ ｄ ｆ ｉ Ｂａ ／ ａ ｕｍａ ／ ／ ｓ ｓ
海洋放线菌Y12-26代谢产物中bafilomycins分离纯化及结构鉴定
５２ ７
海 洋 放 线 菌Ｙ１—６ 谢 产 物 ｔｂｆｏ ｃｎ分 离 纯 化 及 结 构 鉴 定 魏 川 等 ２２ 代 ０ ａ ｌｍｙｉｓ ｉ
海 洋 中高 压 、 高 盐 、低 营养 、低 温 等 独 特 的环
左 右 ，分 别 获得 活 性 组 分Ａ２ Ｈ ， 冉进 行ＨＰ Ｃ制 ＊ Ａ３ Ｌ
ｉｏｌｔｏ ｎ ｐ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｈｅａ ｔｖ ｎ ｉｕｎ ａ ｏ ｏｕ ｓ ａｉ ｎ ａ ｄ ｕ ｉ ｃ ｔｏ ．ｔ ｃ ｉ ｅａ ｔｆ ｇ ｌｃ ｍｐ ｎｄｓｗｅ ｅ ｉｏ ａｅ ｎ ｕｒｆｅ ｒ ｉ ｒ ｓ ｌ ｔｄ ａ ｄ ｐ ｉ ｄ ｆｏｍ ｕ ｔ ｒ ｘ ｒ ｃ ｔａｎ ｉ ｔ ｃ ｌｕ ｅｅ ｔａ ｔ ｓｒ ｉ ｈｅ ｏｆ
收稿 日期：２ １ 一１２ ０ ０ ｌ．３ 基金项 目：国家高科技研 究发展（６ ） ８ ３计划（ 编号：２ ０ ＡＡ ９ ４ ７。 ０ ８ ０ Ｚ ０ ）
作者简介 ：魏刚 ，男，生于１ ８ 年，硕士研究生 ，主要从事农用抗 生素 的创制研 究。 ５ ９ 通讯作者 ，Ｅ ｍ ｉ ｔ ｌ ＠ｅｕｔ ｄ ． — ａ： ｏ ｌ ａ ｍ ｃ ｓｅ ｕ ｎ ． ｃ
Ａ２ 、Ｂ１ 、Ｂ２ 、Ｃ１ 、Ｃ ｔ ２ 、Ｄ和Ｅ ｔ，ｂ ｆ ｏ ｃｎ 】 ａ ｌｍｙ ｉ类 ｉ
备 ，制备 高效 液相 色 谱仪 （Ｈ ＭＡＤＺ Ｓ Ｌ ８ ． Ｃ ＳＩ Ｕ．Ｃ 一Ａ Ｌ 一
８ Ｓ Ｄ一 ０ 、制 备 柱 型 号 ：ＶＰ ５ ／ Ｎｕ ｌｏ ｉ Ａ— Ｐ １ Ａ） ２ ０２ ｃｅ ｓｌ １
关键 词：海洋放线菌 ；分离纯化 ；结构 鉴定；ｂ ｆｏ ｃ ｓ ａｌ ｉ ｍｙｉ ｎ
中 图 分 类 号 ：Ｒ ７ ． ５ ９ ８１ ＋
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TLC-生物自显影-MTT法检测滇重楼内生真菌中抗菌活性成分
TLC-生物自显影-MTT法检测滇重楼内生真菌中抗菌活性成
分
赵江林;徐利剑;黄永富;周立刚
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】2008(020)001
【摘要】本文采用TLC-生物自显影-MTT法检测了3株滇重楼内生真菌即芬芳镰刀菌、季氏毕赤氏酵母和烟曲霉正丁醇提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和稻瘟病菌的抗菌活性成分,以芬芳镰刀菌和季氏毕赤氏酵母菌液提取物中含有的抗菌活性成分为多.同时与打孔药剂扩散法的检测结果进行了比较,为进一步快速分离内生真菌中抗菌活性成分提供了依据.
【总页数】6页(P28-32,51)
【作者】赵江林;徐利剑;黄永富;周立刚
【作者单位】中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100094;中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100094;中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100094;中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100094
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.96;S482.2
【相关文献】
1.利用二维生物自显影技术快速检测追踪金钱松内生真菌抗细菌活性成分 [J], 何佳;赵启美;陈钧
2.关于滇重楼内生真菌抗菌活性的筛选和菌株鉴定研究 [J], 代娇;宋秋玲;田甜
3.TLC-生物自显影检测26种植物中的抗细菌和抗氧化活性物质 [J], 单体江;张伟豪;王松;白日娜;翁道玥;林希乐;孙坚
4.促进滇重楼皂苷类活性成分积累的内生真菌筛选 [J], 李艳冰;林亮;廖秋红;杨生超;刘涛
5.滇重楼内生真菌的分离及其对滇重楼种子胚发育的效应(英文) [J], 程坤;杨艳琼;赵昶灵;王荔;陈疏影;申毓晗;柴静
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应用薄层色谱_生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性
应用薄层色谱2生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性谷丽华1,2,吴 弢1,23,张紫佳2,侴桂新1,2,王峥涛1,23(1.上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室,上海201203;2.上海中药标准化研究中心,上海201203)摘要:目的 采用薄层色谱2生物自显影法研究与评价中药的抗氧化活性。
方法 用1,12二苯基222苦肼基自由基乙醇溶液(1,12di phenyl222p icrylhydrazyl,DPPH)和传统显色剂显色,拍摄图像,采用模拟扫描,获得各抗氧化成分的峰面积。
结果 以总峰面积大小为指标判定不同来源中药的抗氧化能力,结果表明浙江天台产乌药(94340)、四川凉山产厚朴(175647)和收集于上海的紫苏子(153206)清除DPPH自由基能力最强。
以化学对照品峰面积与总峰面积的百分比来判定化合物抗氧化活性,表明去甲异波尔定(4318%～6610%)、厚朴酚与和厚朴酚(7312%～9312%)、木犀草素与芹菜素及成分“U”(4716%～6810%)分别是乌药、厚朴和紫苏子的主要抗氧化活性成分。
结论本方法在中药抗氧化活性成分筛选及质量评价方面具有操作简便、选择性高、重现性好等优点。
关键词:薄层色谱2生物自显影;抗氧化活性;乌药;厚朴;紫苏子;DPPH中图分类号:R917;R93 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2006)10-0956-07 Evaluati on of anti oxi dant acti vity of Radi x L i n derae and other two Chi n ese drugs usi n g T LC2bi oautographyG U L i2hua1,2,WU Tao1,23,ZHANG Zi2jia2,CHOU Gui2xin1,2,WANG Zheng2tao1,23(1.Key L aboratory of S tandardization of Chinese M edicines,M inistry of Education,Institute of Chinese M ateria M edica,Shanghai U niversity of T raditional Chinese M edicine,Shanghai201203,China;2.Shanghai R&D Center for S tandardization of Traditional Chinese M edicines,Shanghai201203,China)Abstract:A i m To evaluate the anti oxidant capacity and quality of traditi onal Chinese medicines using T LC2bi oaut ography.M ethods T wo chr omat ogra m s of each crude drug sa mp le were obtained,after devel op ing,by s p raying with1,12di phenyl222p icrylhydrazyl(DPPH)s oluti on in ethanol and classical stained reagents,separately.The i m ages s p rayed with DPPH s oluti on were cap tured under light after thep lates were heated at40℃f or30m in,and scanned using video scan s oft w are t o get peak areas of active compounds.Results T otal peak areas of the s pots on T LC were calculated t o evaluate the anti oxidant capacity of the tested crude drugs fr om different habitats and s ources.The results indicated that RadixL inderae cultivated in Tiantai(Zhejiang p r ovince),Cortex Magnoliae Officinalis cultivated in L iangshan (Sichuan p r ovince),and Fructus Perillae acquired in Shanghai have the highest scavenging p r opertiest owards DPPH in their res pective T LC2aut ographic assays.Noris oboldine,magnol ol and honoki ol, luteolin,ap igenin and an unknown compound“U”p r oved t o be the maj or anti oxidant components in the corres ponding crude drugs as they contribute the dom inating peak areas t o the t otal ones.Conclusi onT LC2bi oaut ography can not only be used f or screening of the components with anti oxidant potency but als of or the pur pose of quality evaluati on of traditi onal Chinese medicines at the sa me ti m e,and the methodp r oved t o be selective,si m p le and rep r oducible.Key words:T LC2bi oaut ography;anti oxidant;Radix L inderae;CortexMagnoliae Officinalis;Fructus收稿日期:2005212219.基金项目:国家中医药管理局中医药科技重大项目(02代08);上海市重点学科建设项目资助(Y0301);上海市科委启明星项目资助(06QA14047).3通讯作者 Tel:86-21-51322513,Fax:86-21-51322519,E2mail:wutao@shutc Perillae;DPPH 自由基与许多病理和生理现象,如肿瘤、炎症、动脉粥样硬化及衰老等有关,故寻找阻断自由基反应的抗氧化物质具有重要意义。
生物自显影
一定浓度的 INT 培养基配制的菌悬液 37℃培养过夜
通用显色剂
抗菌生物自显影TLC法
纸片法抗菌测试
有无抑菌斑（有无抑菌 能力）
抑菌斑的多少（潜在活 性化合物的数目） 各抑菌斑大小（化合物 的相对活性能力比较） 活性化合物的极性范围
有无抑菌斑（有无抑 菌能力）
抑菌斑大小（抑菌能 力初步比较）
结合不同显色剂可初步 得出活性化合物的结构 类型
Four pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from Curtisia dentata (Burm.f) C.A. Sm. leaves
生物自显影TLC在天然药物筛选的应用抗菌生自显影TLC普通TLC
研究思路
良好的临 床用药经 验
植物资源 特殊、稀 有
民间药 南非茱萸 树皮
抗菌能力研究 （叶＞皮） 化学成分研究 薄层鉴别（成 分相似）
研究空白
树皮与叶的对比 研究
选题：南非茱萸树皮》 南非茱萸叶
Bioassay-guided fractionation
There is no end to learning THANK YOU
海洋放线菌WBF16次级代谢产物的分离与结构鉴定
Ａｂ ｔａ ｔ ０ｂ ｔ ｅ Ｔ ｏａｅａ ｄｉｅ ｔｙｔｅａ ｔｕ ｒ ｏ ｓ ｔｅ ｔ ｆ ｍ ｅ ｏ ｄｒ ｔｂ ｌｅ ｆ ｈ ｓｒ ｃ ｊｃｉ ｏｉ ｌ ｎ ｎｉ ｎｉ ｍｏ ｎ ｔｕ ｎｓ ｒ ｓｃ ｎ ａｙｍｅａ ｏｉ ｓｏ ｅ ｅ ｖ ｓ ｔ ｄ ｆ ｈ ｔ ｃ ｉ ｏ ｔ ｔ
２８ ５
中国抗生素杂志２ 年４ ０ 月第３ 卷第４ １ ２ ７ 期
文 章 编 号 ： １０ －６ ９２ １）４０ ５ ．３ ０ １８ ８ （０ ２０ —２ ８０
海洋放线 菌ＷＢ １ 次级代谢产物 的分离 与结构鉴定 Ｆ６
陆建胜 陆 园园 邢莹莹 奚涛
（ 中国药科大学 生命 科学技术学院海洋药物研 究 中心，南京 ２ ０ ０ ） １０ ９
ｎ ｔ ｒ ｌ ｏ ｏ ｄ ａ ｄ ｃ ｍｐ ｕ ｄ １ ｗａ ｒｔ ｓ ｌｔ ｄ ｆｏ ｍａ ｉ ｅ ｍｉ ｒ ｏ ｇ ｉｍ ｓ Ｃｏ ｏ ｎ ｉｐ ａ ｅ ｅ ｔｒ ａｕ ａ ｍｐ ｕ ｎ ｏ ｏ ｎ ｓｆ ｓｌ ｉｏ ａ ｅ ｍ ｒｎ ｃ ｏ ｒ ａ ｓ ． ｍｐ ｕ ｄ １ ｄ ｓ ｌｙ ｄ ｂ ｔ ｃ ｎ ｉ ｙ ｒ ｎ ｅ
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放线菌有效成分分析
放线菌有效成分分析研究进展摘要：植物内生放线菌是一类具有巨大开发潜力的新微生物资源，且是数量众多，都分布于没有外部感染症状的健康植物体内，并与植物协同进化，具有促进植物生长，增强植物抗逆性的作用。
目前从许多活体植物组织内分离到的植物内生放线菌中，已有的研究表明，植物内生放线菌在植物病害生物防治中具拮抗机制及其生防作用。
因此，研究放线菌已成为一个十分活跃并具有巨大应用前景的领域。
关键词：放线菌；有效成分；拮抗机制；研究现状Actinobacteria effective composition analysis and research progress Abstract: plant endogenous actinomycetes is a kind of great development potential new microorganism resources, and is numerous, are distributed in no external infection symptoms plant body health, and cooperative coevolution with plant, have promote plant growth, and strengthen the function of plant resistance. At present many living plants from within the organization to plant endogenous actinomyces separation, the existing research shows that endophytic actinomyces can produce antibiotic material, plant growth promoters, plant growth inhibitors, and with new features of the enzymes physiological activity such as material. Therefore, the actinobacteria has become a very active and has great application fields. (plant endogenous actinomyces and physiological activity material research progress)Keywords: actinomycosis; active ingredient; antagonistic mechanism;Research前言：放线菌(Actinomycete)是一类重要的微生物资源，广泛地分布于土壤、湖泊、河流、海洋等不同的自然生态环境中，有的也共生或寄生于动植物宿主上。
薄层色谱显色剂及检测物质介绍
对苯醌
邻苯醌
2,5-二甲基-对苯醌
1,4-萘醌
9,10-蒽醌
9,10-菲醌
磷钼酸(PMA)：广谱配制方法：10 g of磷钼酸+100 mL乙醇
次硝酸铋钾
溶液甲：0.85 g次硝酸铋+ 10 ml冰醋酸+ 40 ml水
溶液乙：8 g碘化钾+ 20 ml水。临用时取甲、乙二液各0.5 ml，加冰醋酸2 ml及水10 ml混合。
该显色剂主要用来跟踪含氮化合物，浸泡后化合物显示桔红色。（生物碱）
配制方法
在100ml广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。
或者在瓶中，加入10g碘粒，30g硅胶
香草醛(香兰素)
广谱
配制方法
15g香草醛+ 250mL乙醇+2.5mL浓硫酸
挥发油类可以用硫酸香草醛显色剂，还有高级醇、酚、甾类及精油都可以用它做显色剂。酸香草醛又称硫酸香兰素显色剂，其实是一种广谱性的显色剂，很多一般的物质如有机酸，挥发油，甾体，萜类等都可以显色，除生物碱、三萜或甾体皂甙类显色不明显，可用一些特殊显色剂外，一般都可使用香兰素显色。
黄酮类母体结构图
黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。
薄层色谱生物自显影技术
上述结果表明,AChE不仅和AD的胆碱能系统有关,也参与了 AD患者老年斑的形成发展以及神经元的死亡过程,而胆碱 能活性下降与AD的老年斑和神经纤维缠结密切相关,二者 形成恶性循环,加剧了AD的恶化。目前,增强胆碱能活性仍 然是缓解AD症状最有效的方法,因此,寻找活性好、毒性低 的AChE仍是开发治疗AD新药的有效途径。 目前用于治疗AD的AchE类药物除石杉碱甲外都是合成药物， 如他克林，多奈哌齐等，它们的存在活性不是很强，选择 性较低的缺点。目前发现的抗AChE活性较好的化合物多半 是生物碱。此外，皂苷、萜类等也有不错的AChE抑制活性。
AChE的生物功能： 分为催化功能和非催化 功能。催化功能是指AChE的 经典功能,即在胆碱能突触处 快速水解神经递质ACh,从而 终止胆碱能神经信号的传递。 非催化功能是指其具有诱导 轴突生长和突触形成,参与细 胞迁移、粘附和凋亡,促进造 血细胞形成和Aβ聚集以及影 响炎症和免疫反应等非经典 功能。
1、将所用酶溶液的浓度从6.67U/mL降低到1.0U/mL,同时降低了底物和显 色剂的用量,从而大大降低了实验所需费用。 2、将原方法的检测限至少降低了两个数量级,这对发现植物中微量的AChE 非常有利。 3、优化了显色背景,从而使抑制剂斑点更容易被观察到。
4、将改进的生物自显影方法中的乙酸-α-萘酯溶液换成α-萘酚溶液进行实验, 排除由于TCL天然产物阻止α-萘酚和快蓝盐B反应产生的假阳性结果, 提高 方法的准确率。 通过一系列的改进,此薄层色谱生物自显影方法已经成为一种高通量、低 花费、便于大范围推广的跟踪分离天然的方法。
一、实验材料 二、仪器与试剂 三、实验步骤
一、实验材料：
天南星科植物石菖 蒲的干燥根茎
二、实验仪器与试剂：
薄层层析TLC通用显色剂
薄层层析通用显色剂1通用试剂(1)重络酸钾-硫酸:检查一般有机物.喷洒剂:5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中.薄层检查:喷洒后加热到150℃至班点出现(2)荧光素-溴:检查不饱和化合物喷洒剂:0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中溴试剂:5%的溴的四氯化碳溶液喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.(3)碘:检查一般有机物.方法:a层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合物呈棕色斑点。
b层析谱放碘蒸气中5分钟（或喷5％碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷1％淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。
(4)硫酸：通用喷洒剂：5％的浓硫酸乙醇溶液，或15％浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸－醋酸（1：1）喷洒后处理：空气中干燥15分钟，再热至110℃直至出现颜色或荧光。
(5)硝酸银－氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：检查还原性物质。
溶液I:0.1%N硝酸银;溶液II:5N氢氧化铵喷洒剂:I和II以1:5混合(临用前混合)喷洒后处理:105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现.(6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体喷洒剂:5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液喷洒后处理:120℃加热至斑点出现.沉淀试剂:1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性.2生物碱(7)硫酸:检查生物碱及含碘化合物喷洒剂:0.1克硫酸?混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入浓硫酸至澄清.喷洒后处理:110℃加热数分钟至斑点出现.(8)碘化铋钾(Drage ndorff)试剂:检查生物碱及其他含氟化合物.溶液I:0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中溶剂II:8克碘化钾溶于20毫升水中.制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂用.喷洒液:制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得(9).碘化汞钾(Mayer)试剂:检查生物碱.制备液:13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水稀释至1000毫升.喷洒液:制备液加1/10体积的17%盐酸.喷洒后处理:观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.(10)?酸纳-浓硫酸(Mandelin)试剂:检查生物碱.1%>酸纳的浓硫酸溶液.与多种生物碱呈不同颜色.(11)碘－碘化钾(Wagner)试剂:检查生物碱.1克碘及10克碘化钾,溶于50毫升水中,加热,加2毫升醋酸,再用水稀释至100毫升.可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.3酚类,鞣质(12)三氯化铁:检查酚类及??酸.喷洒剂:1~5%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液.并加盐酸少许.??酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.(13)铁氰化钾-三氯化钾:检查酚类,芳香胺类及还原性物质.喷洒剂:1%铁氰化钾水溶液,2%三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.喷洒后处理:喷洒后酚性物质呈蓝色斑点.再喷2N盐酸,能使颜色加深,纸谱可用稀盐酸洗去喷洒液.(14)4-胺基安替比林-铁氰化钾(Emerson反应):检查酚类.喷洒剂:I.2%4-氨基安替比林乙醇溶液;II.8%铁氰化钾水溶液.或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液方法:先喷洒I,再喷洒II,即显色,或再放入密闭缸中,缸内放25%氢氧化铵,即产生橙色至深红色.(15)对氨基苯磺酸,重氮盐(Pauly试剂):检查酚类,芳香胺类及能偶合的杂环化合物.喷洒剂:4.5克对氨基苯磺酸,加热溶于45毫升12N盐酸中,用水稀释至500毫升,取10毫升稀释液用冰冷却,加10毫升冷4.5%亚硝酸钠水溶液,0℃放15分钟(此试剂于0℃可保存3天),用前加等体积1%碳酸钠水溶液.一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.(16)对甲苯磺酸:检查甾体,黄酮,鞣质.喷洒剂:20%对甲苯磺酸氯仿溶液.喷洒后处理:100℃加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.4含氧杂环及蒽醌类*(17)三氯化铝:检查黄酮体.喷洒1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光(18)碱式醋酸铅:检查黄酮体.喷洒剂:饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液.于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.(19)醋酸镁:检查蒽醌甙,甙元及黄酮体喷洒剂:0.5%醋酸镁甲醇溶液方法:90℃加热5分钟,呈红色至紫色斑点.(20)氢氧化钾:检查香豆素,蒽醌甙及甙元喷洒剂:5~10%氢氧化钾的甲醇溶液.于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点.5萜类,甾体(21)三氯化锑(Carr-Price试剂):检查甾体,萜类,皂类.喷洒剂:25克三氯化锑溶于75克氯仿中(亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液).喷洒后处理:100℃加热5分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.(22)五氯化锑:检查甾体,萜类,皂甙.喷洒剂:五氯化锑-氯仿或四氯化碳(1:4),用前新鲜配制.喷洒后处理:120℃加热至斑点出现,并于紫外线荧光分析灯下检示.(23)香兰醛-硫酸:检查高级醇类,酚类,甾体,萜类,芳香油.喷洒剂:1克香兰素溶于100毫升浓硫酸,或0.5克香兰醛溶于100毫升硫酸-乙醇(4:1)中.喷洒后处理:室温或120℃加热观察显色斑点.(24)4-二甲氨基苯甲醛,醋酸,磷酸(E.P.试剂):检查?Azulene及?前体Proazulene.喷洒剂:0.25克4-二甲氨基苯甲醛,溶于50毫升醋酸5克85％磷酸和20毫升水的混合液中(棕色瓶中保存数月):烃室温即成蓝紫色斑点,>前体于80℃加热10分钟出现蓝紫色斑点.(25)氯胺T－三氯醋酸:检查强心甙.喷洒剂:I.3%氯仿T水溶液新鲜制备.II.25%三氯醋酸乙醇溶液(能保存数天).10毫升I加40毫升II,用前混合.喷洒后处理:110℃加热7分钟,紫外线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光. (26)亚硝酸基铁氰化钠-氢氧化钠(Legal试剂):检查不饱和内酯;甲基酮或活性次甲基,常用于强心甙喷洒剂:1克亚硝基铁氰化钠溶于100毫升2N氢氧化钠-乙醇(1:1)的水溶液.显红色或紫色斑点.(27)3,5-二硝基苯甲酸(Legal试剂):检查强心甙,α,β-不饱和内酯.喷洒剂:1克3,5-二硝基苯甲酸溶于50毫升甲醇,加入1N氢氧化钾50毫升.强心甙呈紫红色斑点.6糖类(28)邻苯二甲基苯胺:检查还原糖.喷洒剂:0.93克苯氨,1.66克邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇中.喷洒后处理:105℃加热10分钟.(29)2,3,5-Triphenyl-tetrazo lium chloride(T.T.C.)：检查还原糖及其他还原物质。
薄层色谱直接生物自显影方法(TLC-Bioautography)在抗菌剂分析中的应用
薄层色谱直接生物自显影方法(TLC-Bioautography)在抗菌
剂分析中的应用
王双英
【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》
【年(卷),期】2012(033)002
【摘要】生物自显影法(Bioautography)是在复杂的基质中检测物质对生物体的生长速率和检测生物活性.这种技术主要用于研究源于植物、微生物、组合化学的活性物质来寻找新的具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤及抗蚤状幼体寄生虫活性的复合物,调查废水、饮用水、体液、饲料和食品中的抗生素及抗生素药品的质量控制,寻找能有效对抗植物致病细菌及真菌的抗生素类化合物,检测毒物(如黄曲霉毒素)及光毒性化合物(如呋喃香豆素).本文讨论了生物自显影法的三种形式,即接触法,浸润法和直接法,重点讲述了直接法及其应用,包括测试各种类型的化合物,也包括研究生化过程及影响细菌生长的因素.
【总页数】3页(P67-69)
【作者】王双英
【作者单位】复旦大学药学院,上海201203
【正文语种】中文
【中图分类】R978
【相关文献】
1.微乳液在生物碱薄层色谱分析中的应用 [J], 康纯;闻莉毓;丁仲伯;朱霞石;郭荣
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薄层色谱生物自显影法筛选新疆莫合烟天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性成分
薄层色谱生物自显影法筛选新疆莫合烟天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性成分王健;朱萍萍;倪国柱;温琳豫;支玲;胡曙晨【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2014(000)020【摘要】Objective To explain nicotine in tobacco can reduce the incidence of degenerative diseases,perform the activity screening of acetyl cholinesterase inhibitors of Xinjiang's unique Mohe-tobacco for illuminating the action mechanism. Methods The thin layer chromatography(TLC)bioautographic method combining TLC with biological activity assay was used to conduct the activity screening of extract solution of Xinjiang Mohe-tobacco. Results Nicotine in the extract solution of Xinjiang Mohe-tobacco appeared the white spots on the purple background by the TLC bioautography,indicating that which possesses the activity,but the white spots were weak, indicating that the nicotine content in the extract solution was unable to reach the significant inhibiting concentration,its activity was lower than that of the reference substance huperzine A;the DPPH development method revealed that the extraction solution of Xinjiang Mohe-tobacco simultaneously possesses the better antioxidant activity. Conclusion Nicotine in Xinjiang Mohe-tobacco can be com-bined with acetyl cholinesterase and inhibits its activity. The TLC bioautographic method is easy to operate with high sensitivity andspecificity in the activity screening for natural acetyl cholinesterase inhibitor.%目的：为阐明烟草中的烟碱降低退行性疾病发病率的作用机理，对新疆特有的莫合烟进行天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性筛选。
生物自显影技术简介[文献综述]
![生物自显影技术简介[文献综述]](https://img.taocdn.com/s3/m/b0135e844028915f804dc275.png)
毕业论文文献综述生物工程生物自显影技术简介一、前言目前，从天然产物中筛选、分离和提取天然抗菌成分已成为天然防腐剂和新药研发等研究领域的热点，筛选得到的产物往往需要进行生物活性鉴定，传统的鉴定方法需要在整个动物或者是器官上进行，这样不仅需要大量的活体实验体，还需要大量的目标提取物，实验过程复杂，操作要求高，无法满足实验要求，这样就使得我们去寻找并建立灵敏、方便、快捷且经济的活性检测方法，目前都采用微量生物活性物质的鉴定方法，如酶法[1]，微生物抑菌法，免疫原法等，这些方法都有各自的特点，适合于不同实验，本篇文献介绍一种操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高的生物活性检测方法，生物自显影法，并简要介绍该方法的几种分类和应用。
二、主题1、TLC生物自显影技术简介普通生物自显影技术是一种利用薄层色谱来对生物活性进行测定的方法，薄层色谱是一种分离色谱，他能将天然产物初提物中的活性成分和非活性成分在薄层板上很好的分离并展开，再通过与混合了微生物（各种真菌，致病菌，病原微生物）的培养基相接触，通过一定的手段培养，培养基上会出现两个不同的区域，一个是被微生物覆盖的区域，即非活性区域，另一个出现抑菌圈的地方则是活性区域，相对薄层板上的展开位置就是生物活性物质的所在，通过洗脱剂可将其收集。
再参考该物质的标准展开样板，则可得知该物质的化学结构，分子式等信息。
2、TLC生物自显影技术的分类[2]2.1 琼脂扩散法琼脂扩散法是较早的一种生物自显影法，其操作步骤就是最原始的步骤，所需要注意的是，在实验过程中可在培养基中加入一定量的四挫盐（如MTT，INT等），四挫盐本身颜色较浅，但是它在接触了微生物的代谢产物之后会变成深色，有助于我们的判断，还有一点就是如果薄层板采用的是硅胶吸附剂，那么可以在硅胶和培养基之间放置一张湿润的滤纸，因为琼脂有粘性，它与硅胶层接触后会产生黏着，会破坏抑菌圈的观察。
2.2 直接TLC生物自显影法该法与上述方法的区别是它的载体由培养基变成了薄层板，用特制培养液培养细菌制成菌悬液，然后将菌悬液喷洒在展开完成的薄层板上，一定潮湿避光的条件下培养一定时间，同样加入一定量的四挫盐，但是该方法只适用于那些能在薄层板上很好生长的真菌类微生物。
TLC
薄层色谱法（TLC）程晓飞 2011213045色层分析法是1903年由俄国化学家、植物学家茨维特首创的，用于分离植物色素。
后来采用此方法，亦可用于无色组分的分离。
所以色谱法只不过是一个延用的名词，并非表示只能分离有色组分。
薄层色谱法就是其中的一种。
1简介薄层色谱法（TLC），是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一薄层。
带点样、展开后，根据斑点显色和比移值（Rf）与适宜的对照物进行比较，来进行定量定性分析。
示意图如右：比移值（Rf）是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数。
定义为溶质迁移距离与展开剂迁移距离之比。
在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。
薄层色谱法具有许多特点，如：1）速度快，需几至十几分钟，可同时展开多个试样；2）试样处理简单，对试样限制少；3）仪器简单，便于操作；4）分离能力较强，灵敏度较高等。
在实验室中，薄层层析主要用于以下几种目的。
(1) 监控反应进程。
在反应过程中定时取样，将原料和反应混合物分别点在同一块薄层板上，展开后观察样点的相对浓度变化。
若只有原料点，则说明反应没有进行；若原料点很快变淡，产物点很快变浓，则说明反应在迅速进行；若原料点基本消失，产物点变得很浓，则说明反应基本完成。
(2) 作为柱层析的先导。
一般说来，使用某种固定相和流动相可以在柱中分离开的混合物，使用同种固定相和流动相也可以在薄层板上分离开。
所以常利用薄层层析为柱层析选择吸附剂和淋洗剂。
(3) 检测其他分离纯化过程。
在柱层析、结晶、萃取等分离纯化过程中，将分离出来的组分或纯化所得的产物溶样点板，展开后如果只有一个点，则说明已经完全分离开了或已经纯化好了；若展开后仍有两个或多个斑点，则说明分离纯化尚未达到预期的效果。
(4) 确定混合物中的组分数目。
一般说来，混合物溶液点样展开后出现几个斑点，就说明混合物中有几个组分。
(5) 确定两个或多个样品是否为同一物质。
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薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分
目的采用薄层色谱生物自显影方法对北极海洋放线菌T-2-3提取物的抑菌成分进行研究。
方法采用大孔树脂对该放线菌活性成分进行富集，并针对活性成分进行薄层生物自显影检测。
结果经检测，Rf 0.40的点为活性化合物。
结论薄层色谱生物自显影法是一种快速分离检测抑菌成分的实验手段。
Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin, and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components.
Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity 海洋微生物由于其特殊的生存環境，表现出特异的代谢方式，同时可以产生结构新颖且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物质的重要来源[1]。
目前为止，已知有22000多种微生物次级代谢产物中70%由放线菌产生，而10000多种抗生素由链霉菌属产生[2]。
链霉菌属在放线菌中占有重要的地位，是生物活性物质的重要来源。
薄层色谱生物自显影法（TLC-Bioautography）是近年来应用的一种集分离、生物活性和鉴定于一体的”化合物+生物活性”的测定方法[3-4]。
本实验室前期从北极海底海泥沉积物中分离得到一株海洋放线菌T-2-3，经初步鉴定为链霉菌属。
本实验利用TLC-生物自显影法对T-2-3的提取物中的抗菌活性成分进行检测，为进一步分离纯化活性成分提供了依据。
1资料与方法
1.1一般资料噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；替加环素、氨苄西林购自美国Amresco公司。
所用试剂均为市售分析纯。
1.2方法
1.2.1 T-2-3菌株粗提物样品制备将生长良好的T-2-3斜面培养物接种至种子培养基中，180 r/min摇床，28 ℃培养3 d；然后转接于发酵培养基中，180 r/min 摇床，28℃下持续发酵5 d，收取发酵液，并用D-101大孔树脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脱，洗脱部位减压浓缩得浸膏，将乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制备成20 mg/mL供试样品。
1.2.2供试菌及其培养供试细菌：①革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄八叠球菌；②革兰氏阴性菌：大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌；③临床耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧
西林表皮葡萄球菌3株、肺炎克雷伯杆菌3株、鲍曼不动杆菌3株。
以上菌株由中国药科大学海洋药物研究中心提供。
细菌及临床耐药菌的培养：挑取单菌落接到100 mL LB液体培养基中，37℃，过夜培养，菌液稀释至106 CFU/mL，待用。
1.2.3打孔扩散法检测提取物的抑菌活性提取物用甲醇溶解配成浓度为2 mg/mL的溶液，作为检测样品。
将氨苄西林、替加环素配成100 μg/mL的溶液，分别为阳性对照。
将LB琼脂（含量为2%）培养基倒入培养皿中，厚度约为4 mm，待其冷却凝固。
然后，取200 μL指示菌种子液用涂布棒均匀涂布，用打孔器（Ф=6 mm）在培养基上打孔，每皿4个孔，每孔加药100 μL，分别为空白对照、阴性对照、阳性对照、样品，37℃下培养18~22 h后，观察结果，测量抑菌圈直径。
1.2.4提取物的薄层层析将甲醇溶解的提取物采用毛细管点样，点样量为5 μL，点样直径<3 mm。
预先用展开剂（氯仿：甲醇=7∶4）饱和层析缸，5 min 后将硅胶板放入层析缸，进行线性上行展开，当展开剂至硅胶板上端1 cm处，取出并用铅笔标记溶剂前沿，挥干溶剂，然后用5%硫酸-乙醇喷雾，100℃下加热显色5 min。
1.2.5生物自显影将展开的薄层板在超净工作台上紫外杀菌30 min。
将含有2%琼脂的LB培养基，以涂布法涂加指示菌，即先将温度为40℃~50℃的LB琼脂培养基涂加到薄层板上，待培养基凝固后，在薄层板上涂加200 μL的指示菌种子液，将薄层板放在湿室内37 ℃培养12 h，取出薄层板，在上面喷加外源显色剂噻唑蓝（MTT），约10 min后，即可观察结果。
有抑菌成分处，指示菌由于受到抑菌成分的抑制而出现抑菌斑；无抑菌成分处，指示菌正常生长，通过MTT 显色出现蓝色背景色，与抑菌斑区分开[5]。
2结果与分析
2.1打孔扩散法对抑菌成分的检测提取物对多种G+、G-细菌及多种临床耐药菌有明显的抑制活性，见表1、表2，其中对G+的抑制活性明显强于G-及多种临床耐药菌。
2.1.1提取物对细菌的抑制活性，见表1，抑制圈表示为（x±s）。
2.1.2提取物对临床耐药菌的抑制活性，见表2。
2.2 TLC-生物自显影法对抑菌成分的检测采用TLC-生物自显影法初步检测了样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及MRSA的抑制活性，见图1。
结果显示，薄层板上有两个明显的点J1、J2，Rf值分别为0.67、0.40，其中J2显示为活性点，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及MRSA分别有不同程度的抑制活性。
图1 TLC-生物自显影检测放线菌T-2-3提取物中抑菌活性成分
注：A：5%硫酸-乙醇加热显色；B、C、D分别为样品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、MRSA的抑菌效果。
3讨论
海洋特殊生态环境中的生命资源已成为拓展天然药用资源的新空间，也是目前资源最丰富、保存最完整、最具新药开发潜力的新领域[6]。
TLC-生物自显影法可在普通实验室条件下进行，操作简单，结果直观，重复性好，灵敏度高，已广泛用于多种生物活性物质如抗菌剂、酶抑制剂、抗氧化剂的筛选。
本文在TLC-生物自显影的基础上结合MTT比色法，检测了北极海洋放线菌T-2-3提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及MRSA的抑菌成分，并根据活性成分的极性大小，为活性成分的进一步分离纯化提供依据。
参考文献：
[1]黄永中,罗雄明,王建华.海洋沉积物来源链霉菌属次生代谢产物及其生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发,Nat Prod Res Dev,2011,23:758-766.
[2]Fenical,W,Jensen,PR. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nat. Chem. Biol 2006,2:666-673.
[3]Anwesa B,Subir KB,Nishith KP,et al,In vitro antibacterial potential of Eugenia Jambolana seed extracts against multidrug-resistant human bacterial pathogens[J].Microbiological Research, 2012,167:352-357.
[4]杨成,熊延靖,刘辉.薄层色谱-自显影技术分离检测石榴皮清除自由基活性成分[J].皖南医学院学报,2011,30(4):270-272.
[5]赵江林,徐利剑,黄永富,等.TLC-生物自显影-MTT法检测滇重楼内生真菌中抗菌活性成分[J].天然产物研究与开发Nat Prod Res Dev 2008,20(51):28-32.
[6]史清文,李力更,王于方.海洋天然产物研究与新药开发[J].药物评价研究,2011,3(33):165-174.。