植物基因克隆方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等
3）RNA中沾染了基因组DNA 4）镁离子浓度太高
建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因： 1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑
制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。 2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
● 利用antibody筛选表达文库(Expression Library)
Antibody production Construction of Expression Library
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）退火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
（一）已知 基因产物 的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基因分离
1、利用DNA探针筛选基因文库 前提是已知一段DNA序列并构建了基因文库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。wenku.baidu.com
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
● 利用protein测序的氨基酸信息
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
乙醇对RNA沉淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺
和胍盐。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可
以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等
3）RNA中沾染了基因组DNA 4）镁离子浓度太高
建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因： 1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑
制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。 2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
● 利用antibody筛选表达文库(Expression Library)
Antibody production Construction of Expression Library
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）退火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
（一）已知 基因产物 的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基因分离
1、利用DNA探针筛选基因文库 前提是已知一段DNA序列并构建了基因文库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。wenku.baidu.com
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
● 利用protein测序的氨基酸信息
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
乙醇对RNA沉淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺
和胍盐。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可
以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多