生物光子学5-02

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• 相衬显微镜（1934, Zernike） :
– 光入射到折射率较高的介质中， 传播速度降低，离开介质后，振 幅不变，但出现了相位差。 – 通过一定的光学装置可以把相位 变化转变为振幅变化，把不可见 的相位像变为可见的振幅像，把 介质折射率或厚度的差异变为光 强度的差异，这就是相衬显微镜 所依据的光学原理。
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• 分辨力和最小分辨距离：
– 显微镜的分辨力主要由物镜的分辨力所决定； – 表示物镜分辨力大小的参数是最小分辨距离（一般用 表示），它是指物镜可以分辨的两个物点之间的最小 距离。
0.61 NA
衍射极限决定了光学显微镜的极限分辨力,它和光波长,数 值孔径有关。 分辨力和分辨率是两个概念！
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• 偏光显微镜：
高密度柱状六角液晶小牛胸腺DNA 的显微照片（浓度大约450毫克/毫升， 10X物镜的偏光显微镜测量）
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• 4）微分干涉显微镜（DIC）：
– 使照明光束通过起偏器并投射到石 英棱镜上，在胶合面上光束分为寻 常光（o光）和非寻常光（e光）平 行地透过样品，经物镜后重新被两 个石英棱镜会聚，可观察到样品面 或内部的微小起伏图像的显微镜。 – 沃拉斯顿棱镜
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显微镜的几种观察方式
• 1）暗场显微镜：
• 暗场显微镜技术是利用斜射照明法阻 挡透过标本细节的直射光，以反射光 和衍射光来观察标本。 • 暗场显微镜的最关键部件是暗场聚光 镜，能把投射到它表面的包含各个立 体角的光，转换成一个中空的光锥束 ，并让这个光锥束的顶点中心在样品 表面。 • 在普通显微镜下直射光透过标本，看 到的是物体形态和结构。而在暗场显 微镜下从侧面照射到物体的光束，绕 射或反射造成物体外形的侧影，看到 的是物体的轮廓或物体的运动。
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• 微分干涉显微镜：
– 在光路上与偏光显微镜类似，但在透射光路中 多了一对双折射晶体（2,6沃拉斯顿棱镜）； – 第一个晶体用于将偏振光分解为两个振动方向 垂直的偏振光，并发生横向的位移； – 如果两个双折射光束通过完全相同的样品结构 ，那么经过样品后光程不会发生变化；但如果 两束光经过的结构不同，那么到达像面时光程 差会发生变化； – 双折射晶体6消除两束偏振光的横向移动，而 检偏器7选择和其振动方向相同的移相波列； – 这两列光波在像面发生干涉，将光程差转换为 强度差并成像。
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• 自然光 • 线偏振 • 圆偏振
– 各向同性物质——单折射性 – 各向异性物质——双折射性
• o光：服从通常的折射定律 • e光：具有不同于正常光线的传播速度和折射率，异常光线的传播速度 随着通过双折射材料光线的方向而变化。 • 在任何各向异性的材料中，至少可以找到一个方向，在这个方向上o光 29 和e光的传播速度相等，这个方向称为光轴。
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• 浸润物镜：
– 提高数值孔径 – 干系、水浸、油浸 – 不能混用 – 标记：W, OIL
盖玻片 n=1.52 N=1.52 空气 NA=0.9,n=1 水NA=1.2,n=1.33 油 NA=1.37,n=1.52
NA=n sinα
– 数值孔径越大，对光的收集能力越强，空间分辨率越 高。
– 透射显微镜中最普遍的照明方 式为柯勒照明，可以提供均匀 明亮的视场，无闪耀，对样品 加热小。 – 视场光圈和聚焦光阑分别放在 成像光路和照明光路的共轭面 上，这样就可以独立控制对样 品的照明角度和强度。
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• 显微照相：
– 相机与显微镜的连接需要特殊设计的接口。 – 接口的放大倍率取决于记录单元的面积以及中间像的大小。
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目镜的眼点和视场：
• 眼点：
– 如果在目镜的上面放置一块荧光透明物质或场玻璃，就可以看到从 目镜中射出的光束呈陀螺形。在目镜上面所出现的光线交叉点称为 眼点，也称为出瞳。交叉点的横切面呈圆盘状，直径通常为11.5mm，在光学上它是显微镜所形成的物镜孔径的像。
• 视场：
– 目镜改变放大倍率 – 目镜改变视场（环状光阑）
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• 暗场显微镜：
效果对比Βιβλιοθήκη Baidu
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• 2）相衬显微镜：
– 显微镜样品的像的形成取决于由样品所引起的光的变化，在光学显 微镜中，最主要的变化是振幅变化和相位变化，在入射照明和透射 照明中这两个因素以不同的程度同时发生。 – 常规显微镜中，像的反差主要是由光的吸收差异所引起的。当用单 色光照明时，改变了光的振幅，于是各个结构部分显示出不同的亮 度；当用白光照明时，由于吸收的不同改变了光谱的成分，不同的 结构部分便显示出不同的色彩。 – 当光波通过一个具有不同折射率的复杂透明物体（如未染色的生物 学切片），振幅保持不变，光的传播速度会发生变化。
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• 物镜的标记 ：
– 用颜色编码可快速识别 物镜的放大倍率以及浸 润介质的种类
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• 物镜的标记 ：
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• 目镜 ：
– 目镜的作用：对中间像进一步 放大，并成像到视网膜上 – 1 中间像位置，放十字线 – 2 视场 – 3 目镜镜头 – 4 目镜瞳孔位置= 眼睛瞳孔 – 5 屈光度补偿的聚焦环
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– 由于相机的记录媒介（胶卷）和CCD的面元尺寸的不同，因此其接 口光路是不同的，前者要对中间像做进一步的放大，而后者则往往 要缩小已经放大的像。 – 一般情况下，中间像的大小为15－20mm，而对于CCD相机，其有 效面元的尺寸要小于其标称值，比如，1/2英寸CCD的有效区域对角 线长度为8mm，1/3英寸CCD相机有效区域对角线长度为5.3mm等 等。因此在上页图中，选择缩小一倍的接口可以基本上记录大部分 中间像。
– 物镜和筒镜之间的光是平行光，可在中间加滤光片、反光镜等而不影响成像质量 – 物镜和筒镜共同形成完全校正后的中间像，无需目镜进一步校正
• ICS物镜的共同点：
– 相同的等焦面长度（45mm），可自由切换 – 标准螺纹配合
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• 物镜的性能指标：
– 数值孔径：NA=n sinα – （自由）工作距离 • 这个距离不能够小于0.1mm。在现代物镜中，自由工作距离和物 镜长度的总和被规定为一个固定的数值。 • 物镜的设计原则：较低倍数的物镜具有较少的透镜，它被做得短 一些，具有较长的工作距离；较高倍数的透镜具有很多透镜，它 被做得较长一些，相应地具有较短地工作距离。使用一组这样的 物镜时，在转动物镜转换台时，只需要用细调稍微聚焦就可以得 到一个清晰的像。
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• 显微镜从光路上分有两种－透射和反射：
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• 正立和倒置显微镜：
正立显微镜：光路设计简单，光损 少，样品高度有要求，方便多视场 观察，镜头不易落灰易维护。
倒置显微镜：光路长，光损较大，光路设 计较复杂，对样品高低无要求，检测方便 快速，不适合多视场分析，价格高。 23
– 相衬显微镜可以用来观察未染色 的活体组织和细胞结构。
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• 相衬显微镜：
明场和相衬显微镜下的细胞图像
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• 3）偏光显微镜：
– 偏光显微镜是一种具有起偏器、检偏器和补偿器等装置的特殊显微 镜，它可以用于对于具有各向异性的生物学材料如纤维蛋白、淀粉 粒、纺锤丝等的观察和定量研究。 – 光的偏振
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• 物镜的校正类型：
– 物镜除了放大倍数、数值孔径和油浸系外，校正类型也 很多 – 分为像差和色差的校正 – 消色差、半复消色差（ FL ）、复消色差（ APO ）、 平面消色差（ PL或PLAN ）、平面复消色差（ PLAN APO或PL APO ）等五种物镜
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5.2 光学显微技术
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• 视频显微成像技术－电子放大：
– 如果将CCD相机或摄像机的输出接到监视器上，那么总 的放大倍率将是光学和电子放大倍率的乘积。 – 光学放大倍率为： Moptical=Mobjective×Madapter
– 电子放大倍率为：
Melectronic=diagonalmonitor/diagonalsensor – 总的放大倍率为 Moveral=Moptical×Melectronic
(500-1000)NA=475-950 60*15=900 60*12.5=750 60*10=600 60* 25=1500 60*20=1200
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• 集光器（聚光镜）
– 集光器的主要功能是照明样品，将视 场光阑成像在样品上，而将孔径光阑 成像在物镜的光瞳上。好的集光器有 利于显微镜达到其极限空间分辨率， 改善样品照明的均匀性。 – 集光器有两种：明视场集光器和相差 以及暗视场集光器。 – 右图所示是集光器和物镜的组合。
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• 偏光显微镜：
– 右图：偏光显微镜的原理示意图 – 偏光显微镜的特点，就是将普通光改 变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别 某一物质是单折射性（各向同性）或 双折射性（各向异性）。 – 起偏器与检偏器
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• 偏光显微镜：
• 下图：聚合体纤维（Polymer fiber）的 明场像、偏光像以及彩色偏光像
主讲人：刘立新
lxliu@xidian.edu.cn 西安电子科技大学
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第5章
生物光子学成像技术
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5.2 光学显微技术
• 物镜：
– 在显微镜中，物镜的作用是将样品做第一次放大，形 成中间像。
– 物镜是决定显微镜的像的质量、分辨率和放大倍数的 最关键的光学部件。 – 物镜一般由几个不同球面半径的透镜组合而成，放大 倍数越高、矫正程度越高的物镜其构造愈复杂。
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• 常规物镜的放大倍率等于b/a=f/z=z’/fb
• 目镜的放大倍率等于250/目镜的焦距
• 总大放大倍率等于物镜与目镜放大倍率的乘积 • 所有物镜的使用都是有条件的，即特定的镜筒长度
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• 无穷远物镜的放大倍率＝Tube lens的焦距和物镜焦距的比值 • ICS（infinity color-corrected system）物镜的优点：
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• 显微镜的照明方法－临界照明：
– 直接照明物体，照明的光锥可以通过在集光器入瞳处的孔 径光阑而控制，照明区域的大小是通过视场光阑来调节。
– 缺点：
• 物场上光的强度不均匀 • 当使用低放大倍数时像的亮度太强
FD
AD
CL
OP
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G
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• 显微镜的照明方法－柯勒照 明：
• 物镜的校正类型-Cont ：
– 消色差物镜：用于一般观察，没有特殊标记。可以使两种色彩 （486和656nm）的像点重合在一起。
– 半复消色差（萤石）物镜：标记FL或Fluorite，它是由一种光学性 能不同于玻璃的矿物质－萤石（CaF2）所制成，可以很好地校正色 差，并且对球面差的校正也比消色差物镜好。常用于高倍观察和显 微照相。缺点：显示出一定程度的场曲率 – 复消色差物镜：标记APO，它在红绿蓝三种色彩上对色差可以校正。 分辨率更高，价格昂贵。
– 平面消色差物镜：标记PL和PLAN，它除了具有消色差物镜的性能 外，最大的优点是对于场曲率能进行很好地校正
– 平面复消色差物镜：标记PLAN APO和PL APO，它是一种可以既 可以对场曲率进行校正，而且在复消色差水平上可以对色差和球面 差进行校正的透镜复合体。一般包含8－15个由不同材料制成地单 个透镜，价格非常贵。
– 视场直径也称视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容 纳被检物体的实际范围，其大小等于目镜的场值（视场数）除以物 镜的放大倍数 – 目镜的场值(field number，FN)，是目镜的固定参数，标刻在目镜 的外面，单位mm
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5.2 光学显微技术
• 目镜/物镜组合的选用：
– 为了达到同样的放大倍率， 可采用不同的目镜/物镜组合 ，但是，最佳的组合是应该 是既能保证对样品细节的分 辨，又不至于做无用的放大 。有用的放大倍率应该介于 (500－1000)×NA。