网织红细胞计数 (2)
网织红细胞计数实训报告
一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。
本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。
二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。
2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。
3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。
三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。
常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。
染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。
2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。
（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。
（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。
（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。
（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。
（4）计算时要确保数值准确。
四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。
通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。
五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。
同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。
此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。
网织红细胞
②检查骨髓的功能。 ③检测贫血的治疗效果。 ④评估骨髓移植后、再生障碍性贫血细胞毒药物诱 导治疗后或EPO治疗后的红细胞造血情况。
【检测原理】 1．普通显微镜法 活体染料的碱性着色基团可与 网织红细胞RNA的磷酸基结合，使RNA胶体间的负电 荷减少而发生凝缩，形成蓝色的点状、线状或网状结 构。 2．血液分析仪法 特殊染料与网织红细胞中RNA 结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占成熟 红细胞的百分数（Ret%），并可根据RNA含量将网织 红细胞分类及计算网织红细胞其他参数。
2. 正确辨认网织红细胞 外周血液网织 红细胞主要为Ⅳ型，凡含有2个或2个以上 颗粒、且颗粒必须远离细胞边缘的红细胞 均应计为网织红细胞。红细胞各种颗粒或 包涵体的鉴别见表2-26。
六、网织红细胞计数
网织红细胞（Ret，RET） 是介于晚幼红细胞和成熟红细 胞之间的过渡细胞，略大于成 熟红细胞，其胞质中残存的嗜 碱性物质RNA经碱性染料活体 染色后，形成蓝色或紫色的点 粒状或丝网状沉淀物。
ICSH将网织红细胞分为4型 （表2-23，图2-20）。
图2-20 网织红细胞
网织红细胞检测的目的：
【方法学评价】网织红细胞计数的方法学评 价见表2-24。
Байду номын сангаас
【质量保证】以手工计数法为重点。 1．选择合适的染料 用于网织红细胞检测 的活体染料很多，有煌焦油蓝（ brilliant cresyl blue）、新亚甲蓝（ new methylene blue）、 中性红、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。网织红细胞活 体染料的评价见表2-25。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
网织红计数的方法与原理
2 检测原理及方法
2.1检测原理
网织红细胞的核糖核酸以弥散胶体状态存在。常 规细胞染色法在涂片及染色过程中对细胞进行了 固定，使网织红细胞的核酸物质即使着色也难于 在普通显微镜下识别。Ret须经活体染色或荧光染 色后才可用显微镜识别或经仪器计算分离。 因此就有两大类计数方法：显微镜计数法和仪器 计数法。
网织红细胞计数
马强虎
网织红细胞计数
1 概念、分型及形态特征 2 检测原理及方法 3 方法学评价 4 质量控制 5 参考值 6 临床意义
1 概念、分型及形态特征
1.1概念：
网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间 的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞，直径 8.0~9.5um，其胞质中残存的嗜碱性物质核糖核酸 （RNA）源自有核红细胞，嗜碱性物质RNA经碱 性染料（煌焦油蓝或新亚甲蓝等）活体染色，形 成蓝色或紫色的点粒状或丝网状结构沉淀物，故 称作网织红细胞。
3.方法学评价
检测方法
评价
普通显微镜法 玻片法 试管法
简便、成本低，可直观细胞形 态；影响因素多，重复性差
水份易蒸发，染色时间短，结Hale Waihona Puke 果偏低易掌握，重复性好，易复查
Miller窥盘计数法 仪器法
规范计算区域，减少了实验误 差，ICSH推荐方法
检测细胞多，精密度高，与手 工法相关性好，易标准化，仪 器贵；出现Howell-jolly小体， 有核红细胞，巨大血小板可是 结果假性增高。
细胞数÷1000 ×100%
网织红细胞
2.3 Miller窥盘计数法（ICSH推荐使用的Ret显微镜 计数法）
1．标本采集：真空采血管或普通空针采静脉血， 用EDTA-K2抗凝（1.5~2.2mg/ml）
网织红细胞测定讲稿
血沉过程一般分为3期： 1、缗钱状红细胞形成期，一般要经 过数分钟至10min. 2、 快速沉降期，形成缗钱状红细胞 以等速下降，约40min.
3、细胞堆积期，又称缓慢沉积期或 堆挤期，此时红细胞堆积在试管底 部。健康人血沉波动于一个狭窄范 围内，而在许多病理情况下血沉可 明显增快。
二、检测原理
五、质量控制
（一）、网织红细胞目视计数误差较 大，影响因素主要有： 1、操作人员对网织红细胞认识不同； 2、用煌焦油兰乙醇染液时，应待乙 醇完全挥发干后才能加入血液，否 则可使血液凝固，染色时间要充足。
3、血涂片质量好坏，血膜厚薄； 4、计数红细胞数量的多少和计数方法 等； 5、染液与血液比例以1：1为宜，严重 贫血时可适当增加血液比例 ；
（四）、Zeta红细胞沉降率测定：
1、原理：红细胞表面唾液酸所带负 电荷形成zeta电位，使红细胞之间 互相排斥，在血浆中保持一定的悬 浮稳定性。
肿瘤患者化疗过程
网织红细胞动态变化
结果：化疗后骨髓造血功能明显受抑，白细胞、 网红及血小板极度降低，其中中性粒细胞绝对数 降至0.02×109/L以下、网红绝对数降至10×109/L 以下，高荧光强度网红百分率和中荧光强度网红 百分率(HFR%+MFR%)逐步降至最低水平或0，网红 分类几乎全部由低荧光强度网红(LFR)组成。造血 功能开始恢复时高荧光强度网红和中荧光强度网 红的出现或升高较中性粒细胞绝对数达到 0.2×109/L早4.5天（中位数）、达到0.5×109/L 早7.5天（中位数），较网红绝对数（RET#）达到 正常范围低限早15天（中位数）。
6、目前，首选Miller窥盘法计数网织红细胞。
（二）、仪器法：虽可计数红细胞10000－50000 个，但如存在Howell-Jolly小体、有核红细胞、 巨血小板，则可见假阳性。
网织红细胞计数
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3．作为病情观察的指标
溶血性贫血及失血性贫血，治疗过程中 连续观察网织红细胞计数，可作为判断 病情变化的参考指标。 如治疗后网织红细胞逐渐降低，表示溶 血或出血已得到控制。 如网织红细胞持续不减低，甚至更增高， 表示病情未得以控制，甚至加重。
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四、红细胞沉降率测定
红细胞沉降率（ESR），简称血沉率 指红细胞在一定条件下沉降的速率。 正常情况下，红细胞在血浆中具有相对 的悬浮稳定性，沉降极其缓慢。 在病理情况下，血沉率可明显增快。
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临床意义
2．血细胞比容减低 见于各种贫血。 不同类型的贫血，红细胞体积大小不同， 故血细胞比容的减少与红细胞数量减少 并不—定成正比。 因此必须将红细胞数、血红蛋白量和血 细胞比容三者结合起来，计算红细胞各 项平均值才有参考意义。
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(二)红细胞平均值的计算
1．平均红细胞容积(MCV) 指每个红细胞的平均体积，以飞升（ fl ）为单 位。
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参考值
魏氏(Westergoen)法： 成年男性0~15mm/1小时末
成年女性0~20mm/1小时末
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临床意义
(一)生理性变化 12岁以下的儿童血沉略快。 妇女月经期血沉略增快，可能与子宫内膜破损 及出血有关。 妊娠3个月以后至分娩后3周血沉快，与生理性 贫血及纤维蛋白原含量增加等有关。 老年人血浆纤维蛋白原含量增加血沉加快。 高原地区居民红细胞增多，血沉低于平原地区。
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R et i c-C O U N T（Thi azol e O r ange）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
网织红细胞计数标准操作程序
网织红细胞计数标准操作程序1.检验目的通过对网织红细胞计数，判断机体造血功能的旺盛程度。
2.检验原理网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质内尚有嗜碱性的RNA物质，经新亚甲蓝或煌焦油蓝活体染色后呈浅蓝色或深蓝色网状结构。
3.标本ETDA-K2抗凝血或新鲜外周血。
4.试剂新亚甲蓝枸橼酸氯化钠染色液。
5.操作步骤5.1在小试管中加入染色液2滴；再加入静脉血（或末梢血）2滴，混匀后放置37℃恒温水箱中。
5.2 温育15分钟后取1滴混悬液制成涂片。
5.3在油镜下直接观察1000个红细胞中Ret数。
6.结果计算直接观察法：网织红细胞比例=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/10007.生物学参考区间网织红细胞比例：成年人：0.005~0.015；新生儿：0.03~0.06；儿童:0.005~0.015。
8.实验室解释8.1增加表示骨髓造血功能旺盛。
见于各类增生性贫血，溶血性贫血增加尤为显著；巨幼细胞贫血、缺铁性贫血分别应用维生素B12、叶酸或铁剂治疗后显著增多，表示有治疗效果；也是放疗和化疗以及骨髓移植和EPO治疗后骨髓造血功能恢复的指标。
8.2减少常见于骨髓增生受抑抑制、再生障碍性贫血和纯红细胞再生障碍。
9.变异的潜在来源标本应在4小时内进行处理。
置于清洁的棕色瓶中保存，染色液应无沉淀。
新亚甲蓝染料为WHO所推荐，着色强且稳定，背景清晰，利于计数；室温<15℃时，放37℃恒温水箱；用瑞士-吉姆萨染液复染后，可使Ret计数结果减少。
10.参考文献10.1尚红、王毓三、申子瑜《全国临床检验操作程序》，第四版，人民卫生出版社。
网织红细胞检测意义
最新血细胞分析仪的应用，为网织红细胞计数提供了更进的测试手段。
这类仪器采用荧光染色和激光测量的原理，不但能客观地测量大量网织红细胞，而且还能将其分为高荧光强度、中荧光强度、低荧光强度三类，这种分类法对估计化疗后骨髓造血功能的恢复及骨髓移植效果有较重要的意义。
[方法学评价] 由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低。
试管法容易掌握，重复性效好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查，避免再次给被检者穿刺造成不必要的痛苦，被列为手工法网织红细胞计数的方法。
近年来，国内使用米勒窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高。
目前，国外逐步使用网织红细胞仪器法测定大致有流式细胞仪法，网织红细胞计数仪法和多参数血液分析仪法。
流式细胞仪法是将红细胞染色后使含 RNA网织红细胞可被计数，进而得出网织红细胞的百分比和绝对值，此法是只能计数网织红细胞当选目，不能分析其成熟程度，网只红细胞计数仪是专门进行网织红细胞测定的仪器操作简单，只需将抗凝血液吸入仪器内，仪器可自动染色、自动分析，自动找印各阶段网织红细胞的分布图。
结果准确。
仪器法的优点是测量细胞多，避免主观因素，方法易于标准化。
但仪器价格昂贵，尚难以广泛应用。
[参考值] 成人：0.008-0.02或(25-75)×109/L初生儿：0.02-0.06[临床意义]1．网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。
溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达0.20或更高。
急性失血后5-10天，网织红细胞达高峰。
2周后恢复正常。
典型再生障碍性贫血病例。
网织红细胞百分比常0.005。
网织红细胞数低于5×109/L为诊断再生障碍性贫血的标准之一。
2．网织红细胞可作为疗效观察指标。
凡是骨髓增生功能良好的病人，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在1周左右可百家高峰，贫血严重，网织红细胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。
(三)网织红细胞计数
（3）放、化疗监测
机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。
(三)网织红细胞计数
网织红细胞（Ret）
是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间 的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞， 其 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA 物 质 。 嗜 碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与 颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）
3. 低倍镜浏览，选取红细胞分布均匀网织红细胞染 色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油 镜，在Miller窥盘下计数小方格中的RBC数和大方 格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的RBC 总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至 几个视野RBC总数>1000为止）。
Miller窥盘
将Miller窥盘放在显 微镜目镜中,通过窥盘 中大小方格间的9比1 比例关系计算RBC数和 Ret数。
网织红细胞
计数方法
1、普通光学显微镜法：活 体染色后推片镜检
2、网织细胞计数仪法：荧 光染色后用流式细胞术计数
二、试剂器材
1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液
2、器材 毛细血管采血用具、小试管、 载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲 苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm （较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正 中央开一边长为3mm的菱形或正方形小 孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）
网织红细胞计数标准操作程序
网织红细胞计数标准操作程序1 方法试管染色法。
2 原理网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后呈浅蓝色或深蓝色的网状结构。
网织颗粒越多，表示红细胞越未成熟。
3 试剂网织红细胞染色液：3.1品牌：珠海贝索生物技术有限公司（BASO diagnostic, Inc）3.2包装规格：2瓶×100ml3.3主要成份：新亚甲蓝3.4储存条件：室温（15℃～30℃），相对湿度不大于80%，无腐蚀性气体和痛风良好的室内保存。
3.5使用期限：2年（开瓶后效期为6个月）。
3.6注意事项：避免高、低温环境及阳光直射。
4 实验器材显微镜、滴管、载玻片、推片、香柏油、擦镜纸、乳胶手套、试管架、移液器等。
5 标本要求5.1标本必须为末梢血或EDTA-K2抗凝的静脉血。
静脉采血后立即与抗凝剂混匀，放置室温立即送检。
5.2 标本在室温下最多保留4小时。
不能在4小时内检测的标本，放置于冷藏冰箱（2℃~8℃）中保存，8小时内标本有效，使用前从冰箱中取出回复室温后检测。
6 操作步骤6.1于0.5ml 试管内加入20μl网织红细胞染色液。
6.2取血液20μl，加入试管内，混匀，盖紧盖子，并标记相应标本号。
6.3静置20分钟或更久。
6.4推成薄片2张，待干。
6.5在油镜下选择红细胞分布均匀，染色较好部位，每张片子检查1000个红细胞中网织红细胞数，算出百分率，以均值报告。
7 计算网织红细胞数（%）= 1000个红细胞中网织红细胞的数目×1001000如：玻片1：油镜下计数1000个红细胞时见10个网织红细胞，则网织红细胞的相对比值为：网织红细胞数1（%）=10×100=1.0 % 1000玻片2：油镜下计数1000个红细胞时见12个网织红细胞，则网织红细胞的相对比值为：网织红细胞数2（%）=12×100=1.2 % 1000最终，网织红细胞数（%）= 1.0% + 1.2%×100=1.0 % 28 参考范围0.5% -1.5%9 临床意义网织红细胞的多少可反映骨髓造血功能的情况。
6.实验五、网织红细胞计数
【注意事项】
4．不宜瑞氏复染。可使网织红细胞计数 结果减少。 ①红细胞染色越深，网织结构越不清晰。 ②染料沉渣易沉淀在血膜上影响观察。 5．试剂应定期重配，以免变质沉淀。
【注意事项】
6．Miler窥盘是用1/9的面积推断整个 大方格内的红细胞数，所以细胞分布 必须很均匀，否则会得出错误结果， 判断的方法如下： 5个大方格内红细胞数/5个小方格内 红细胞数=9 7．对压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。
网织红细胞计数 Retic
【概念】
网织红是晚幼红细胞脱核后到完全成熟 的红细胞之间的过渡型细胞，其胞浆中尚存 有嗜碱性物质，用煌焦油蓝活体染色后，胞 浆中可见有兰绿色网状结构，故名网织红。 计数时任何没有核的，有两个或更多的 相当于核糖粒RNA蓝染物质颗粒的红细胞，均 计为网织红细胞。
【形态特点】 比成熟红细胞稍大，直径8.0～9.5μm。细胞 内含有兰色颗粒或线条状网织结构，颗粒愈少 愈成熟，多分布于边缘。
【方法】 1、试管法 小试管内加染液2滴+血2滴混匀 （颜色为墨绿色） 37℃水浴15min。取 出混匀2min，制成薄血膜片待干 油镜计数1000个红细胞中的网织红 细胞数
【方法】
2、玻片法 1）在载玻片的一端加加煌焦油蓝1滴，干燥 备用。 2）取血液1滴，滴在干燥的染料上，用推片 角混匀，然后用另一块玻片盖在此载玻片 后静置15min～20min，取用1滴制成薄血 涂片。 3）观察计算同试管法
O型 花冠型
Ⅰ型 丝球形
骨
髓
Ⅱ型 网 型 周
Ⅲ型 破网型 围
ⅣⅢ型 破网型
Ⅳ型 点粒型
【形态】
【器材】 1、显微镜 2、Miller窥盘（直径19mm，厚1mm， 内含大小两个正方格，二者面积比为 9:1） 3、试管、玻片 4、水浴箱
网织红细胞计数SOP(手工法)
XXXX医院
临床检验实验室
网织红细胞计数（
［检测原理］
网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质,
经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色的网状结构。
溶于双蒸馏水100ml中，过滤后备用；
2,10g/L煌焦油蓝ACD溶液：取ACD保养液（血库用）20ml,用1mol/L NaO调至PH 7.5左右，加入研细的煌焦油蓝200mg溶解后过滤备用。
（二）方法：
1，于小试管中滴加1滴煌焦油蓝生理盐水溶液或煌焦油蓝ACD溶液。
2，加入末梢血2滴于上述试管中，混匀。
［标本的收集与处理］
1,用EDTA-K20.2ul抗凝静脉血1ml,轻轻摇动抗凝。凝集，溶血，血量小 于0.5 ML或抽血时间超过四小时为不合格标本，拒收。
2，直接采集未稍血液。
［操作步骤］一，百分计数；
（一）试剂：
1,10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液：煌焦油蓝1g,枸橼酸钠0.4g，氯化钠0.85g
4，试剂定期重配，以免变质沉淀。
5，用瑞氏--姬姆萨染液复染后可使网织红细胞计数结果减少。
6，因操作误差大，不宜用波片直接染色法。
7,网织红细胞也可用荧光染色或流式细胞仪计数。
8,抗凝血标本应尽可能快地制片。
（四）参考范围：
成人：0.005--0.015 （ 0.5%--1.5% ）;
新生儿：0.03--0.06 （ 3%--6% ）
XXXX医院
临床检验实验室
文件编号：
XXXX
网织红细胞计数(Ret)，网织红细胞绝对值计数
网织红细胞% X红细胞/ul
网织红细胞的名词解释
网织红细胞的名词解释网织红细胞，又称为网织红细胞百分比（reticulocyte count），是一种通过血涂片染色观察的血液指标，它可以用于评估骨髓功能和贫血程度。
下面将对网织红细胞进行详细的名词解释。
一、网织红细胞的定义和形成网织红细胞属于红细胞发育的中间阶段，是由骨髓中的幼稚红细胞经过一系列分化成熟过程形成的。
在正常情况下，幼稚红细胞从骨髓进入血液循环后1-2天内会不断成熟，通过脾脏和其他器官中的巨噬细胞摄取和降解，形成成熟的红细胞。
而在某些疾病或贫血的情况下，骨髓造血功能受到影响，幼稚红细胞的释放增加，导致网织红细胞数量升高。
二、测量方法和指标意义网织红细胞的测量可以通过染色法获得，通常使用新型染色剂，如甲氨基丙酸酯化Eosin浸染液。
在血液中使用此染料染色后，网织红细胞呈现出明亮的结构，容易与其他红细胞区分。
网织红细胞的计数通常以百分比形式表示，即网织红细胞百分比，正常值在0.2-2%之间。
网织红细胞的数量可用于评估骨髓造血的活跃程度和红细胞释放的速度。
在贫血的情况下，网织红细胞百分比通常会增加，这是因为骨髓为了补充体内缺氧的红细胞，加速释放幼稚红细胞到血液中。
因此，网织红细胞的测量可以用于判断贫血的类型和程度，包括缺铁性贫血、溶血性贫血和骨髓异常造成的贫血。
三、临床应用1. 评估贫血的类型和原因：当患者出现贫血症状时，通过检测网织红细胞百分比可以判断贫血的类型以及其原因。
例如，网织红细胞百分比升高伴随着低红细胞计数和低血红蛋白水平时，可能是由于骨髓产生红细胞减少或红细胞寿命缩短引起的缺铁性贫血。
2. 监测治疗效果：对于贫血患者，在治疗过程中定期监测网织红细胞百分比可以评估治疗的效果。
如果治疗有效，网织红细胞百分比会逐渐下降，说明骨髓功能得到恢复，红细胞释放速度变慢。
3. 评估骨髓功能：网织红细胞的测量也可用于评估骨髓造血功能。
例如，在病毒感染、骨髓疾病和恶性肿瘤等情况下，骨髓造血功能可能受到损害，导致网织红细胞百分比升高。
(三)网织红细胞计数
三、操作步骤
1.于小试管中加入染液2滴。 2.在已加入染液的小试管中加入新鲜全血2滴，立即混匀，室温下 静置15-20min。
3.制片：去混匀染色血液1滴制成薄血涂片，自然干燥。
4.观察：低倍镜下观察红细胞分布和染色情况，选择红细胞分布 均匀、着色好的部位。
5.计数：在油镜下，在Miller窥盘下计数。
临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血； • ＜2提示为骨髓增生低下或红细胞系成熟障碍性贫 血。
（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维
生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织红细胞计数值开始上升，
7~10d达到最高(10%左右)；两周以后逐渐降至正常水平， 红细胞、血红蛋白开始升高。 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造血功能，网 织红细胞计数值上升。
思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数2.6x1012/L，血细胞比 容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，如何报告网织 红细胞检测结果？
（2）显微成像系统：
图2-21 Miller窥盘结构示意图
试剂器材
1、试剂 新亚甲蓝溶液 2、器材 静脉采血用具、EP管、载玻片、推片、 显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘 或直径约20 mm（较目镜内径稍小）的圆形硬 纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形 小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
【方法】
1．普通显微镜法 活体染料的碱性着色基团可与
网织红细胞RNA的磷酸基结合，使RNA胶体间的负电
荷减少而发生凝缩，形成蓝色的点状、线状或网状结
构。 2．血液分析仪法 特殊染料与网织红细胞中RNA 结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占成熟 红细胞的百分数（Ret%），并可根据RNA含量将网
一、网织红细胞(Ret)计数
血红蛋白结构图
血红蛋白特点
3. 亚铁血红素无种族特异性，由2价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。 4. Hb状态 氧合Hb(HbO2 ）
--与O2结合，
还原Hb(Hbred）-脱氧 高铁Hb(Hi)-被氧化成。
碳氧Hb（HbCO）-与CO结合， 硫化Hb（SHb）-病理情况
Hb及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。
费用低廉，国内目前使用的主要方法；但易产生沉淀。
四、操作 1. 取小试管一支，加染液和血液各2滴，混匀。 2. 置37℃水浴箱15min，取出后微振2min，推片。 3. 将Miller 窥盘放入目镜，选择合适部位计数，油镜下 Miller 窥盘的小格A内计数所有无核红细胞，大格B （含小格面积）内计数网织红细胞。或计数1000个红 细胞中的网织红细胞数。 五、计算 大格网织红细胞总数 1. Ret% = ×100 小格红细胞总数×9 B 2. 绝对值计算:RBC×Ret%（ × 109/L）
【临床意义】
（1） 评价骨髓造血功能： ① RET↑是红系造血功能活跃的反映。表示骨髓造血功能旺
盛，见于增生性贫血，以溶贫最为显著（6～8%，急性溶血 可达20%，严重者可达40～50%）；急性失血可明显↑ ；缺 铁和巨贫RET正常或轻度↑ 。
② RET↓表示骨髓造血功能减低，多见于再障，尤以急性再
染色后，使含有RNA的RBC被计数，自动计算出RET的%及绝对数。优点：
测量细胞多，避免主观因素、方法易于标准化。国外已广泛使用，国 内逐步推广使用。但成本高。
近年来，新型多参数血细胞分析仪具有Ret计数功能。
【质量控制】
1.抗凝血最好在4h内处理，保存在4º C，可延长至8h. 2.染色温度控制在37º C为宜，无论何种染液，室温（25º C） 以下染色时，RET检出率明显减低，故要求37º C恒温染 色。 3. 玻片法容易使血液中的水分蒸发，造成涂片困难，受染料沉 淀的干扰，故已少用。 4. 试管法为手工RET计数的首选方法，染液与血液的比例以 1:1为宜，严重贫血时可适当增加血液比例。 5. 推制血膜不宜太薄或太厚，否则会造成RET分布不均。 6. ICSH推荐使用Miller窥盘作Ret计数，其CV=10%±
实验二网织红细胞计数
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一、目的
掌握网织红细胞活体染色原理、形态 学特点、计数方法。
熟悉正常参考值及临床意义。
理
网织红细胞是未完全成熟的红细胞， 由于其胞浆中尚残有核糖体等嗜碱性 物质，经煌焦油蓝染液活体染色后， 可见有蓝绿色的点状，线状或网状结 构，网织红细胞点状结构越多，表示 细胞越年轻，反之则更近于成熟。
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四、临床意义
⒈ 通过网织红细胞计数，可判断骨髓红细 胞系统造血情况。溶血性贫血时，网织红细 胞高达0.20或更高。急性失血后5~10天，网 织红细胞达高峰，２周后恢复正常。再生障 碍性贫血，网织红细胞比值小于0.005。
⒉ 网织红细胞可作为疗效观察的指标.
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二原理二原理网织红细胞是未完全成熟的红细胞网织红细胞是未完全成熟的红细胞由于其胞浆中尚残有核糖体等嗜碱性由于其胞浆中尚残有核糖体等嗜碱性物质经煌焦油蓝染液活体染色后物质经煌焦油蓝染液活体染色后可见有蓝绿色的点状线状或网状结可见有蓝绿色的点状线状或网状结构网织红细胞点状结构越多表示构网织红细胞点状结构越多表示细胞越年轻反之则更近于成熟
⒋ 参考值：成人0.008~0.020，初生儿 0.020~0.060。
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㈡ 试管法 ⒈ 小试管中放入１％的煌焦油蓝生理盐 水溶液２滴，加入血液２滴后混匀，紧塞 管口，待15分钟后混匀，倾出１滴后推片。 ⒉ 待干后，低倍镜下选细胞分布均匀， 着色清晰处，用目镜中加入网格计数器或 用纸圈缩小视野，计数1000个红细胞中的 网织红细胞数，除以1000，即得网织红细 胞数。
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三、方法
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一、实验原理
网 织 红 细 胞 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA 物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后 RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结 合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状 或网状结构，可在显微镜下识别。计数1000 个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百 分比，或×红细胞计数结果报告其绝对值。
3香柏油转换至油 镜，在Miller窥盘下计数小方格中的RBC数和大方 格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的RBC 总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至 几个视野RBC总数>1000为止）。
Miller窥盘
将Miller窥盘放在显 微镜目镜中,通过窥盘 中大小方格间的9比1 比例关系计算RBC数和 Ret数。
B1
3
A
四、计算
ler窥盘法：网织红细胞（Retic） 百分率(%)= （大方格内Retic总数） /（小方格内RBC总数×9）×100%
2.直接计数法：网织红细胞（Retic）百 分率(%)= 多个视野内Retic总数/多 个视野内RBC总数×100%
五、注意事项
1.用酒精染液时，应待玻璃片上的酒精挥发干燥 后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动， 使染料和血液混合，防止凝固。
三、操作步骤
1. 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴， 任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于 已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合 （玻片法）；试管法取染液2滴入试管，加血2滴 混匀，封闭好，待15分钟以上时间，
2. 推片：取混合液1小滴于载玻片的一端，推制成薄 而均匀的血膜，
2.染色时间一定要充足，混合后不能立即推片， 室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻 片防止蒸发。
3.染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。 4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数 5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。 6.与变性珠蛋白小体鉴别
六、参考值
成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） 成人绝对值（24-84） 109/L
网织红细胞（Ret）
是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间 的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞， 其 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA 物 质 。 嗜 碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与 颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）
网织红细胞
感谢下 载
骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。
（3）放、化疗监测
机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。
计数方法
1、普通光学显微镜法：活 体染色后推片镜检
2、网织细胞计数仪法：荧 光染色后用流式细胞术计数
二、试剂器材
1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液
2、器材 毛细血管采血用具、小试管、 载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲 苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm （较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正 中央开一边长为3mm的菱形或正方形小 孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）
• RPI=病人网织红细胞（%）/2 * 病人HCT/正常
人HCT（男0.45，女0.40）
• 临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；
八、思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数 2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细 胞计数相对值为35%，如何报告网织红 细胞检测结果？
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型
再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 做为急性再障的辅助诊断指标。
失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 显高于正常。
营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。
（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高(10% 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。