第八章 基因重组和转座

单链DNA可以由许多途径产生，RecBCD酶是产
生参与重组的DNA单链主要途径。
该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。
Rec BCD酶具有三种酶活性：① 依赖于ATP的核酸 外切酶活性，② 可被ATP增强的核酸内切酶活性， ③ ATP依赖的解螺旋酶活性。
当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，
改变，而供体DNA并未发生变化。
一、同源重组的分子机制
1.同源重组的基本条件
在交换区具有相同或相似序列
双链DNA分子间互补配对
重组酶 参与重组反应的酶 同源重组需要一些蛋白质因子（如大肠杆
菌的Rec A、B、C、D）及酶（如DNA连接酶） 等。 异源双链区的形成
2.同源重组的分子模型——Holliday模型
5´ 3´
片 5´ 段 重 组 体 拼 接 重 组 体
5´ 3´ 5´ 3´
5´
DNA 连接酶
5´
5´ 3´ 5´3´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´
5´
二、同源重组的酶学机制
已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进 同源重组各步骤有关的酶，研究最多的还是大肠 杆菌的酶。 在大肠杆菌中，RecA蛋白参与重组是最关键 的步骤。 RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促 进DNA单链的同化(assimilation)。
可接合质粒如 F 因子(F factor)
F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100 kb，
复制起点为oriV。
F质粒可以在细胞内游离存在，也可以整合到
宿主染色体内，因此属于附加体(episome)。其与
转移有关的基因(tra)占据质粒的三分之一(～33
kb)，称为转移区，包括编码F性菌毛(F pilus)、稳
由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进 行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。 RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，并水 解ATP。一旦Holliday中间体形成，即由 RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。 RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction) 的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平
位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究
中发现的。 λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性 位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。 一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基 本特征：①交换是相互的和保存原先的DNA，是典 型的保守性重组（conservative recombination）； ②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一
的同源重组机制可能有所不同。
三、细菌同源重组
1.细菌转化
通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型， 称为转化作用 (transformation)。
具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的 细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。
很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA
所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生 链的交换，从而使重组过程中DNA 配对、Holliday 中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。 当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协
同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝。RecF、RecO
和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。
RecA蛋白相对分子质量为38000，它与单链DNA
特异位点重组的结果决定于重组位点的位
置和方向。 如果重组位点以相反方向存在于同一DNA 分子上，重组结果发生倒位。 重组位点以相同方向存在于同一DNA分子 上，重组发生切除； 在不同分子上，重组发生整合。
特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向。重组位点以白箭头表示。 A重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。B重组位点同 方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合
Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型
相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也 已在真核生物中发现。在酿酒酵母中的rad51基 因与大肠杆菌recA基因同源，二者的功能有关。 该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形 成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与
单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物
的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏
球菌及嗜血杆菌等)。
转化经常是瞬时的，与特定的生理状态有关。 转 化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。 有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很 用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质 粒得以高效转化。
低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，
结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体，螺旋直径
10nm，碱基间距0.5nm。
此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋以
便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链互补的序
列。
互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以
允许转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配
对，同源链被置换出来(如下图)。 链的交换速度大约为6 bp/s，交换沿单链 5′→3′方向进行，直至交换终止，在此过程中由 RecA水解ATP提供反应所需能量。
噬菌体DNA attP POP’ BOB’ attB
Int IHF
+Fra Baidu bibliotek
细菌DNA 整合
切除 Xis
IHF
Int
BOP’ attL
POB’ attR
原噬菌体DNA
λ噬菌体的位点专一性重组
由于噬菌体DNA是环状的，在重组过程中，
它以线性形式插入细菌染色体中，此时原噬菌体
被重组产生的两个新att位点所固定。所以，形成
性核苷酸上。
一、λ噬菌体的整合与切除
λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生 长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不 同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状
态需要λDNA整合（integrate）进宿主DNA，噬菌
体DNA是细菌染色体的整合部分；由溶源状态进
入裂解状态需要λDNA从宿主DNA上切除（excise
发生同源重组。
同源重组存在热点（hot spot） 即某类型序
列发生重组的概率高于其他序列。
同源重组要求序列同源性的最低长度因不同机
体而异，一般在25~300bp之间。
同源重组发生在减数分裂同源染色体非姊妹染
色单体之间，是一种交互重组类型。
但在细菌转化、结合和普遍性转导中，同
源重组是一种单向重组类型，仅受体DNA发生
人工转化的机制目前还不十分清楚，可能与增加
细胞通透性有关。
分离
DNA
R 型 H 肺炎双球菌
SH 型 肺炎双球菌
2.细菌接合
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用 (conjugation)。
质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子
位点特异性重组广泛存在于各类细胞中， 起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它 们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程 中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA 复制循环过程中发生的整合与切除等。 此过程往往发生在一个特定的短的(20～200
bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重
组酶)和辅助因子对其识别和作用。
在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷 型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。
缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，
前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA
发生重组。
例： λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
第二节 位点特异性重组
使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP
水解供给。及至酶移动到chi位点 (5′GCTGGTGG3′)，在其3′侧4～6个核苷酸处 将链切开，产生具有3′末端的游离单链。随后 单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有 1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb 有一个，成为重组热点。
面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮
助RuvB六聚体环结合在双链DNA上，位于交
叉点上游。
RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动 分支移动(如下图)。RuvAB复合物的移动速度约 为10～20 bp/s。 同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开， 并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。 RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday 联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸 ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热 点，并决定 结果是片段重组还是拼接重组，即异 源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。
第 8 章 基因重组和转座
第一节 同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称普遍性重组、
基本重组，是最基本的DNA重组方式。通过链的
断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行
单链或双链片段的交换。
同源重组的特征：
利用DNA序列同源性来识别重组对象 蛋白 质因子紧紧帮助它们同源识别。只要两条DNA 序列相同或接近，就可以在序列中的任何一点
）下来，λDNA在宿主细菌中 以环状分子独立存 在。
这里，整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特
定位点之间的重组而实现。这些特定位点叫附着位
点（attachment site或att）。
细菌的附着位点称attB，由序列B、O和B’组成，
噬菌体的附着位点称attP，由序列P、O和P’组成。 其中B、B’、P、P’的序列各不相同，而O序列是attB 和attP所共有的，说明在这些位点处发生的重组反应。
此模型中，同源重组主要有4个关键步骤 ：
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链 连接，形成Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant)
转座的位置通常或多或少是随机的。当转座
子插入一个基因内时，该基因即失活，如果是重
要的基因就可能导致细胞死亡。因此转座必须受
到控制，并且频率都很低。
转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它
可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且其在基
因组中成为“可移动的同源区”。
Holiday 重组模型 (双链侵入 模型）
Holiday中 间体
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´
5´
5´ 3´ 3´ 5´ 3´
DNA 连接酶
这两个新的附着位点attL（BOP’）和attR（POB’
）是很重要的，这样可以使整合和切除反应不在 一对相同的反应序列之间发生。整合过程要求在 attB和attP之间进行识别，而切除过程则在attL
和attR之间识别。
因此，位点专一性重组反应的定向特征取决
于重组位点的识别。尽管重组反应是可逆的，
定接合配对、转移的起始和调节等，总共约40个 基因。
3.细菌转导
转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体 转移到受体细胞的过程。 普遍性转导:是指宿主基因组任意位置的DNA成为成 熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌； 局限性转导:某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主 染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。
RecA蛋白介导的DNA链交换模型
A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链 DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来; B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面
任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源 双链DNA进行链的交换。
但反应导向则由不同条件决定，这是噬菌体生
活过程的重要特征，因为它保证了整合反应不
会立即被切除反应所逆转。反之亦然。
二、位点特异性重组的分子机制
第三节 转座
转座因子(transposable element)是一种可以由 染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子， 也就是一段可以发生转座(transposition)的DNA ，又称为转座子(transposon)。