液相色谱方法开发(HPLC)

剂
A
泵
溶剂 A 比例阀 A
混合 混合器
（溶剂混合 溶剂 B 泵 泵 B 溶剂 B
A
B 低 高压梯度
梯度：高压混合

高压梯度
使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积
梯度：低压混合

低压梯度
用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积
① THF / H 2O ＝ 28 : 72 ② MeOH / H 2O ＝ 58 : 42

改变色谱柱
③ CH 3CN / H 2O ＝ 38 : 62
方法开发的其他因素

流速对柱效的影响
不同内径的色谱柱有自己的最佳流速
样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响
根据变化的方向及大小决定下一步干什么
改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大 梯度洗脱有利于复杂样品的分离

开发液相色谱方法的考虑因素
分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外，在开发色谱方法时，以下 几个因素也都要考虑：
灵敏度
成本 容易使用
载样量

高端检测器
光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass
Spectrometry）
示差折光（REFRACTIVE INDEX）检测

示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相 色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）
通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质
245.6
在整个UV-Vis带 宽上检测吸光度
283.5
240.9
0.004
0.002 0.000 200.00 220.00 240.00 260.00 nm 280.00 300.00 320.00
都需要相应的软 件进行数据的分 析
方法开发一般的具体步骤



先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性

以上因素均影响分离度
液相色谱的方法开发
梯度方法
液相色谱泵
稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合

准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成


有效的流速范围
制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑
滞后体积
梯度分析更为关注
目的：在任何情况下保持最高精度
梯度的洗脱方式

高压梯度及低压梯度

更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性
化学结构、分子量及紫外光谱等等
流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求

选择液相色谱的检测器
向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品
的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waters

对色谱柱有足够的了解
掌握分离机理，自己开发方法

充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应

对压力、温度及流速等变化不敏感
长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性

灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪 音的比值（S/N） 6:1 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 S 好的信噪比有利于：

如设计不当，梯度的 准确性受影响
滞后体积（系统
体积）设计合理
梯度洗脱的特点

优点
单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高

缺点
仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低？
一般流出问题

早流出峰的分离度差. 迟流出峰的峰宽增加而峰高降低. 由于k’范围宽，所以分析时间长. 强保留组分造成柱污染.
等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.
梯度洗脱 - 一个解决方案
梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成.
优点 • 改善分离度 • 提高检测性能 • 能够分离复杂样品 • 缩短分析时间 • 降低由于强保留组分而使色谱 柱性能变差的可能性 其他应用 • 柱清洗 • 方法开发中的尝试运行

用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液 相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（Solute property detectors）

对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动
相的变化（选择型）

整体性质检测器（Bulk property detectors）
不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化
作出响应（通用型）
不同种类的检测器的分类
紫外/可见光检测器 荧光检测器 固定波长 可变波长
溶质性质 -选择型
电化学检测器
放射化学检测器 氮/硫检测器 质谱检测器 示差折光检测器
光电二极管矩阵
整体性质 -通用型
蒸发光散射检测器
电导检测器
理想的HPLC检测器
分析速度 溶剂损耗
色谱柱寿命
效率
改变流速
5%/min 1 ml/min -> 5%/ml
5%/min 2.5 ml/min -> 2%/ml
0 2 4 6 8 T im e ( m in ) 10 12 14
结论

充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相?
离子抑制? 离子对? 还是其他
Hale Waihona Puke Baidu

观察流动相条件改变时色谱峰的移动
液相色谱的检测器

常规检测器
示差折光检测器（Refractive
Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors）
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 RI ug 104 是 是 否 ABS ng 105 否 否 否 ELSD ng 否 否 否 是 FL pg 103 否 否 否 MS pg 103 是 否 是 EC fg 106 是 是 是 Cond pg 105 是 是 否 MS pg 103 是 是 是

背景吸收的影响
吸光度
理想
2
1
实际
1
0
背景吸收降低 了线性范围
背景吸收
0
多数流动相有 紫外吸收
浓度
荧光（FLUORESCENCE）检测

发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子 达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即 振动能（2） 激发态 荧光 S1
基态
激发 （1） S0
发射 （3）
1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能 量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光
共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象
荧光检测器原理
荧光检测器的应用

环境中的污染物
多环芳烃(PAH)，
多酚，氨基甲酸酯 等

多环芳烃（PAH）
H3C CH3 CH3 CH3
食品、饮料
食品中的毒素；例
OH
如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基 酸

CH3
维生素
O
O H3C NH O
O

样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
1.改变容量因子 K’
谱图
①
① ① 4 0 / 6 0
5 0 / 5 0 ②
③
②② ③ ③
6 0 / 4 0
2.改变分离因子Α

通过改变流动相改变α，同样强度的不同溶剂
梯度平衡时间的影响（一）
10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复
梯度平衡时间的影响（二）
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟
平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的 变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化 不大因而大于这个时间时，平衡充足。

分离(制备)时要了解哪方面的情况？
要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?

使用文献方法注意点
色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相

是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
液相色谱的方法开发
方法开发的过程
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认
第一步干什么?

想办法得到各种信息
AU
0.010
0.005
0.000
0.022 0.020 0.018 AU 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006
二极管矩阵检测 器是在1982年首 度出现的
7.00
2.00
2.193
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50 Minutes
5.00
5.50
6.00
6.50

通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性

调节柱长度改变柱效及分离速度
请 记 住 ∶
每 次 改 变 一 个 参 数
反相色谱的方法开发

开发过程实例

色谱条件∶


色谱柱：C18，4.6mm×15mm 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐 弱 流速：1ml/min
O
生物技术及制药
O O CH3 O
O
CH3
CH3
黄曲霉毒素
氨基甲酸酯类杀虫剂
光电二极管矩阵（PHOTO DIODE ARRAY）
Photo Diode Array
简称：PDA或DAD
PDA检测器 － 特点
三维水平的吸光度检测器
0.032 0.030
4.310 6.448
0.015
0.028 0.026 0.024
－ 非特异性

任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质 中与真空中的速度之比值
S R
吸光度（ABSORBANCE UV/VIS）检测

目前实验室中最流行的选择
多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中
50%是多波长，25%是PDA）
测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大

注意色谱柱的规格：内径、柱长
需要调整流速、进样量
注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）

选择HPLC检测器
对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性 关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与 浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可 能与其最佳水平有较大的差距