蛋白质的化学修饰.ppt

6. 10% SDS
取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。
7. 10%过硫酸铵溶液（AP）
临用前现配。
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8．染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸）
考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000 ml。
• 0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x）
取5.98 g Tris，用1N HCl调至pH6.8，加水至 100 ml，4℃保存。
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5. 电极缓冲液（pH 8.3）
取 14.49 g甘氨酸，3.02 g Tris，加100 ml 10%SDS，加水至1 升，4℃保存。
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SDS的作用原理
SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白 质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改 变原有的空间构象。
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蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子， 所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而 消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。
并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越 多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS 复合物的电荷密度趋于一致。
▼样品浓缩效应
A. 分离胶的阻力（孔径小），浓缩作用 B. 缓冲液离子成分的不同 [（甘氨酸离子 （慢）氯离子（快）]，压缩作用 C .浓缩胶与分离胶之间pH值差（分离胶pH高，
调节慢离子的迁移率）
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▼分子筛效应 大分子运动慢，小分子运动快
▼电荷效应 带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢
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【器材】
蛋白质分子量测定
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蛋白质性质鉴定
蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术, 是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋 白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它 的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离 纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基 本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白 质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。
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【电泳】
在100 V的电压下电泳，当样品全部 进入分离胶时，加大电压至100 V，当溴 酚蓝达到胶底部，关闭电源。
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【染色】
从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻 板取出凝胶，放入染色液中染色30 min。
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蛋白质鉴定的主要参数
蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参 数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数， 归纳起来主要有以下几种。 (1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定（等电点） (3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体、肽谱、NC-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) (5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）
11．TEMED（四甲基乙二胺）
Tetramethylethylenediamine
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分离胶的浓度
12%
重蒸水 /ml
3.35
1.5M Tris-HCl(pH8.8) /ml 2.5
10%SDS /ml
0.1
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml
4.0
10%过硫酸铵 /μl
50
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
电泳仪、 垂直板电泳槽、 进样器、 乳头吸管、 50 ml小烧杯
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【试剂】 1．标准蛋白质：
18Βιβλιοθήκη • 30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29.2 g， 甲叉双丙烯酰胺0.8 g， 加水至100 ml，棕色瓶4℃保存。
• 1.5 mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液pH8.8（4x）
取18.15 g Tris， 用1M HCl调pH至 8.8，加水 至100 ml，4℃保存
总体积 /ml
10ml
浓缩胶的浓度 5%
重蒸水/ml
2.92
0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 1.25
10%SDS /ml
0.05
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 0.8
10%过硫酸铵 /μl
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TEMED /μl
5
总体积 /ml
5ml
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灌胶时要注意
催化剂不能加多了，加完催化剂要充分混匀， 且立即灌胶，
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SDS-PAGE 凝胶过滤层析 质谱 核磁共振
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一、SDS－PAGE 测定蛋白质的相对分子量
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【基本原理】
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率， 用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根 据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。
这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身 而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形 状有关。
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同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相 似，均是长椭圆状。
因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋 白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋 白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷 量无关。
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当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS 单位浓度大于1 mol/L时，这两者的结合是定 量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。
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组成
该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成 上层胶:浓缩胶(stacking or concentration gel)
浓 度 2-5%，缓冲液pH值为6.8 下层胶：分离胶(seperation or resolving gel)
浓 度 5-20%，缓冲液pH值为8.3
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特点
具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应：
9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）
甲醇（可用无水乙醇代替） 300 ml，冰乙酸70 ml， 补足水至1000 ml。
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10．样品缓冲液（2x）
H2O 2.4 ml，浓缩胶缓冲液1.0 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 3.2 ml，b-硫基乙醇0.4 ml，0.025%（W/V）溴 酚兰0.2 ml。
灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶 聚合。
灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿 胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。
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样品预处理
取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃加热 1～2分钟。
待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，然后将胶 板固定于电泳装置上，上下槽各加入电极缓冲液。
加样
用微量进样器加样。每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。