基因组DNA提取方法

1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。

3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。

再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。

（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。

12000rpm离心10min。

抽提两次。

（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。

1 2000rpm离心10min。

6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。

作PCR模板用。

细菌基因组DNA的微量提取法本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml 水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇三：操作1.5ml 对数生长期细菌细胞离心，5000rpm,1min沉淀溶于500μl TE缓冲液中混匀30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时100μl NaCL(5M) 混匀80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃10min（可不做）加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。

注意１，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。

2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。

对于菌体样品,通过此流程,•可以获得较为完整的DNA分子。

细菌总DNA的提取和鉴定【目的和要求】1. 学会CTAB法提取细菌总DNA。

2. 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。

【实验原理】DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。

CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。

DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。

【实验试剂和器材】（一）试剂：菌株（E.coli）；蛋白酶K（20mg/ml）；琼脂糖；标准DNA水解液1. 10%SDS2．酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）3. 异丙醇；70%乙醇4．LB培养基：蛋白胨10g, 酵母粉5g, NaCl 10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。

5．TE缓冲液：10mM Tris•HCl, 0.1mM EDTA (pH8.0)。

6．CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65℃使之溶解，然后室温保存。

7．TAE缓冲液（50×）(pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris, 57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。

电泳时稀释成1×浓度使用。

8．溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成9．0.5ug/ml 溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml, 取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5ug/ml。

（二）器材：锥形瓶（250ml），1.5ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪【实验方法】（一）细菌总DNA的提取1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20ul TE 缓冲液(含RNaseA﹤25ng/ml)中，准备电泳检测。

（二）琼脂糖凝胶电泳1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。

在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。

然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

2. 加样：取0.5-1 ug 左右的样品，体积为10-20ul，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。

同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。

3. 电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

4. 染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。

染液可反复多次使用。

5. 观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。

DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

【注意事项】1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。

溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

2. 倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。

细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。

1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

31) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。

3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。

再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。

（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。

12000rpm离心10min。

抽提两次。

（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。

1 2000rpm离心10min。

6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。

作PCR模板用。

4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。