分子克隆和质粒载体构建服务(精)
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建目的基因克隆引物设计pcr质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液pcr上述菌液pcr有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。
一、原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取两个装有液体培养基的3ml试管（视情况而定），向每根试管中加入40-100μL菌株，摇匀过夜。
2、提质粒（也就是载体）按照质量增强颗粒试剂盒中的说明操作（根据情况在洗脱的最后一步再清洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂量（单位：UL）质粒所需内切酶10反应缓冲液2限制性内切酶1h2o7所需将加好的ep管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4.电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收凝胶：使用琼脂糖和缓冲液逐个制备凝胶。
切割凝胶后，回收目标产物，并具有纯化目标产物的功能；试验凝胶：琼脂糖和缓冲液按1:2的比例制备。
以测试目标波段是否与预期一致。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的dna溶液纯化；产物纯化是将较纯的dna溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5.载体与靶基因的连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
同源重组构建质粒原理
同源重组构建质粒原理
同源重组构建质粒原理是广泛应用的一种分子克隆技术，它是通过以一种支配者DNA （终受者）为被复制的物质，把它和稳定地选择自模板DNA（发起者）结构共同复制到新的DNA支配者中去来实现的，从而制备出一条含有模板DNA内容的载体，也就是质粒。
在这种构建质粒原理中，主要涉及到三个部分：基因组工程技术、质粒形成技术和载体技术，所有这些技术合一起来完成目标基因的表达。
在基因组工程技术里，利用保守酶以及脱氧核糖核酸酶将目标基因从来源物种中分离出来，并通过基因改造、基因重组来获得理想基因。
质粒形成技术是一种以DNA结合胞嘧啶为主的构建技术，大体来说，它主要是把所需要的基因引物酶及基因改造材料结合在一起形成质粒。
载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。
此外，在构建质粒过程中，还会加入一些酶，比如胞嘧啶去氧核糖核酸酶等，来有效促进和加强复制过程中质粒，协助把复制后的DNA片段定位与模板DNA上，形成可合成的质粒。
通过上述步骤，就可以把特定的基因克隆到所需的质粒中，从而完成对基因的表达分析，以及下一步的功能分析。
同源重组构建质粒原理在分子克隆技术中占有不可替代的重要地位，是决定新型载体能否稳定表达基因的关键技术。
质粒载体的构建
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
CRISPR protocol2-质粒构建和建系
CRISPR/Cas9系统操作说明-2 ---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢病毒载体，cas9和sgRNA 表达框在同一各载体上。
而且Cas9的C 端带有FLAG 融合标签，载体包含Puromycin 抗性基因，适合建系。
验证sgRNA 活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。
构建非常方便。
说明lentiCRISPR v2https:///52961/☐克隆gDNA 使用BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的filler 片段，便于confirm 酶切成功并利于载体回收；☐BsmBI 的位点是，酶切之后不需要CIP 脱磷也不会自连！☐Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB 或者Immunostaining；☐EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；☐载体带有Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
☐gDNA 设计方法和原则请参考上第一篇“CRISPR/Cas9系统操作说明”，链接如下：☐对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo 末端和pX330不同，请注意设计；☐怕大家看不懂，举个例子说明（克隆小白千万注意oligo 的方向）：gDNA 设计说明载体克隆说明☐Backbone的酶切体系同上一篇文章（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）；☐Oligo的退火条件也参考上一篇文章（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考））仅作参考病毒包装体系☐包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish ，6x106293T ）☐转染条件：用细胞转染试剂lipofiter （超便宜且好用）（汉恒生物，/cn/products/item/36，（或者lipo2000）DNA/lipofiter=1 μg ：2.5 μl☐收集48hr 和72hr 病毒上清，待用。
无缝克隆——让载体构建更简单
让载体构建更easy，分子克隆其实可以ze么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2、可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4、体系反应时间仅需20min，快速反应。
那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。
唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
图1：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式1）质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
2）质粒PCR法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。
图2.PCR法线性化载体示意图。
在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段2、PCR获取目的片段。
设计的引物５’端需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段）；图3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
分子生物学实验教材(精)
分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。
超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
质粒构建流程
质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术，它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。
在本文中，我们将介绍质粒构建的基本流程，希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。
第一步，设计引物。
质粒构建的第一步是设计引物。
引物是一小段单链DNA，它们的序列与目标DNA的两端相互补。
在构建质粒时，我们需要设计两对引物，分别用于扩增目标DNA的两端。
引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果，因此需要仔细选择引物的序列，确保其具有高度的特异性和稳定性。
第二步，PCR扩增。
设计好引物后，接下来就是进行PCR扩增。
PCR是一种体外合成DNA的方法，通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。
在PCR反应中，我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合，然后进行一系列的温度循环，最终得到目标DNA的扩增产物。
第三步，酶切和连接。
获得PCR产物后，接下来需要进行酶切和连接。
酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子，从而得到特定的DNA片段。
在质粒构建中，我们通常会选择两种不同的限制性内切酶，分别用于酶切目标DNA和质粒载体。
然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接，形成重组质粒。
第四步，转化和筛选。
最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中，然后进行筛选。
转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内，使其在细胞内进行复制和表达。
然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选，筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。
总结。
质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术，它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。
通过本文的介绍，相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。
当然，质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。
希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。
分子克隆方法
分子克隆方法分子克隆方法1. 什么是分子克隆方法？分子克隆方法是生物学研究中一种常用的技术手段，用于复制和制造DNA分子的方法。
通过该方法，可以在体外将感兴趣的DNA分子复制出来，进而进行相关实验研究。
2. 常用的分子克隆方法质粒克隆方法质粒克隆方法是最常用的分子克隆方法之一，它基于质粒的特性，利用限制酶和DNA连接酶等酶将感兴趣的DNA片段插入到质粒中。
质粒克隆方法的步骤主要包括：DNA片段和质粒进行限制性酶切，将目标片段插入到质粒中，转化到宿主细胞中进行培养和筛选。
基因组克隆方法基因组克隆方法是利用克隆载体将目标基因组片段进行复制和传递的方法。
与质粒克隆不同的是，基因组克隆方法不只复制目标基因，还包括其上下游调控区域。
此方法通常用于研究基因在整个基因组上的调控和相互作用。
PCR扩增克隆方法PCR扩增克隆方法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术将目标DNA 片段进行扩增和复制。
该方法无需使用质粒或克隆载体，通过合成引物选择性地扩增目标片段，并通过PCR产物进行后续实验研究。
异源克隆方法异源克隆方法是将源自不同物种的DNA片段进行复制和克隆的方法。
通过异源克隆，可以将其他物种的有用基因导入到宿主细胞中，从而实现特定的功能或性状改良。
3. 应用领域分子克隆方法在生物学研究中有广泛的应用。
常见的应用领域包括：•基因工程研究：利用克隆方法可以构建基因工程菌株，用于生产蛋白质、表达外源基因等。
•分子医学研究：克隆方法可以用于研究疾病相关基因、制备基因诊断试剂等。
•植物育种研究：通过克隆方法可以改良植物性状、提高产量和抗病性等。
•生物药物研发：利用克隆方法可以生产和研究重组蛋白质、抗体等生物药物。
分子克隆方法是一种重要的生物学研究技术，它通过复制和制造DNA分子，为生物学研究提供了有力的工具。
质粒克隆、基因组克隆、PCR扩增克隆和异源克隆是常用的分子克隆方法。
在基础研究和应用研究中，分子克隆方法在各个领域都有重要的应用价值。
分子克隆和质粒载体构建服务(精)
2、提供外源DNA的来源及背景资料。DNA来源包括:PCR扩增产物; RT -PCR扩增产物;从其它质粒上酶切得到的DNA片段等。
3、提供DNA片段的电泳照片,并请标明Marker有浓度。
4、提供载体来源与背景资料。
5、注明克隆使用的酶切位点以及是否需要平端连接等。
实验结果:
1、相关的实验说明和相关的酶切图片。
2、测序的结果。
3、构建好的载体和菌液各一份。
4、如有鉴定的客户提供PCR鉴定图片。
相关材料说明:
1、对于实验材料中涉及病原体等危险材料不接受。
2、实验中涉及的碱基序列请以EMAIL的形式发到我中心。
3、实验中的使用载体要尽量提供背景资料:(质粒大小,抗性,拷贝数,多克隆位点等如果是商品化载体,请您提供生产厂家及标准名称;如果所提供载体是您自己构建的请注明大体结构情况。
4、提供常用的如(氨苄青霉素,氯霉素,卡那霉素以外的抗生素。
5、提供的引物如果为干品,请标注具体的OD数,如果是液体态,请标明浓度。
6、可以用甘油菌和穿刺菌形式邮寄菌体。(最好同时提供相应的质粒;如果提供质粒,则质粒的量最好在4ug以上;如果提供的是PCR产物,则PCR产物量最好在5u以上(最好附上电泳图
7、用于提取RNA/DNA的材料要新鲜。采样时应首先在液氮中速冻,保存在-80度的冰箱中,使用干冰运输。
4提供常用的如氨苄青霉素氯霉素卡那霉素以外的抗生素5提供的引物如果为干品请标注具体的od数如果是液体态明浓度6可以用甘油菌和穿刺菌形式邮寄菌体
分子克隆和质粒载体构建服务
简介:
分子克隆和质粒载体构建服务
—— pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
分子克隆技术
载体特征： 1.能自主复制的复制子 2.可供筛选的遗传标记 3.适当大小的分子量 4.合适的限制性内切酶位点，方 便外源基因的插入 5.在受体细胞中高效复制
TA克隆的idea最初来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合 酶在PCR产物的3`末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种 特性与模板无关。之后，invitrogen公司发明了TA克隆技术， 并拥有全球TA cloning商标的专利权。线性化的T载体在3` 末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
分子克隆中的关键技术： DNA分子的分离和富集技术；DNA分子的切割与连接技术； 载体构建技术；大肠杆菌转化技术； 重组DNA分子的筛选和鉴定技术
分子克隆的基本步骤： 1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆 5.克隆基因、克隆基因的表达
分子克隆技术
分子克隆（molecular cloning）
又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术
克隆（Clone） 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆 指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体
（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子 （重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达， 即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。
大肠杆菌转化体系的 建立：感受态菌制备
经氯化钙处理的大肠 杆菌能够摄r)重组 质粒DNA及双抗性转 化大肠杆菌细胞的获得。
2.真核动物非洲爪蟾 的基因在原核细胞中 转录
意义：1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主 细胞中进行繁殖克隆的关键问题；2.质粒分子 可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿 主细胞；3.真核细胞的基因可被转移到原核细 胞中进行克隆及表达。
分子克隆技术
Transformation
Culture in the medium containing antibiotic
E.Coli without vector die
E.Coli with vector grow
PCR
RT-PCR RTase
基因克隆需要一些工具酶。
Taq DNA Pol
Target DNA fragment
获取目的基因片段的几种方法：
（一）体外扩增法
1、DNA聚合酶链式反应（PCR）
2、逆转录-PCR（RT-PCR）NA的体外扩增 1、PCR
基本程序：
模板的变性 引物的退火 新链的延伸
如何利用PCR技术获得目的基因片段？
1、确定目的基因
G C T T A A A A T T C G
nick
Annealing
G A A T T C C T T A A G
nick
Sealed
T4 DNA ligase
Sealed
G A A T T C C T T A A G
T4 DNA连接酶连接单链切口：
应用T4 DNA连接酶时需注意的问题：
（1）低温操作。连接酶对温度非常敏感，很容 易失活。 （2）连接时，可根据厂家的建议选择最佳温度 和时间，一般16oC连接需要12-16小时。
CT……….. GA………. CC……….. GG………. GATCC…. G….
…..A …..TTCGA
…..G …..CTTAASticky endAGCTT…. A….
AATTC…. G….
有两种粘性末端：
1）5-端突出的粘性末端
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。
由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。
质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。
目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。
根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。
由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。
质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。
通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。
分子克隆技术构建流程
分子克隆技术构建流程一、目的基因的获取。
咱得先把要克隆的那个基因搞到手呀。
这就好比是要找一个特别的小宝贝。
有时候这个基因是从生物体的基因组里来的，那就得像个探险家一样，在那巨大的基因库里面去挖掘它。
可以用一些方法，像是从细胞里提取出DNA，然后再用各种酶去把我们想要的那段基因切下来。
还有的时候呢，这个基因是人工合成的，就像是自己动手捏一个小玩偶一样，按照我们知道的基因序列，一点点把它拼出来。
二、载体的选择。
接下来就该给我们的目的基因找个“小房子”啦，这个“小房子”就是载体。
载体的种类可不少呢。
就像住房子有不同的户型一样，有质粒载体，这是比较常用的一种，它就像个小公寓，结构简单又好用。
还有噬菌体载体，感觉就像是个小飞船，能带着基因在细菌的世界里遨游。
选择载体的时候呀，得看看这个载体能不能装下我们的目的基因，就像挑房子得看空间够不够大一样。
而且还得看这个载体在宿主细胞里好不好生存，就像我们挑房子还得看周围环境适不适合居住。
三、目的基因与载体的连接。
四、重组DNA导入宿主细胞。
组合好的这个带有目的基因的载体，就得送进宿主细胞这个“大社区”里啦。
这就像送一个小包裹一样。
如果宿主细胞是细菌的话，就可以用转化的方法，就像给细菌开个小后门，让重组DNA偷偷溜进去。
要是宿主细胞是真核细胞呢，那就可能得用转染的方法啦，就像用个小快递员把包裹送进去。
这个过程可不能马虎，要是送不进去，前面的努力可就白费啦。
五、筛选阳性克隆。
进了宿主细胞之后呢，可不能乱套了。
我们得把那些成功接纳了重组DNA的细胞找出来，这就是筛选阳性克隆。
可以利用载体上带有的一些特殊标记，就像给那些正确的小包裹贴个小标签一样。
比如说有的载体带有抗生素抗性基因，那我们就可以在培养基里加上这种抗生素，那些没有接纳重组DNA的细胞就会死掉，只有接纳了的才能存活下来。
这样就像大浪淘沙一样，把我们想要的细胞给筛选出来啦。
分子克隆技术虽然听起来很复杂，但就像做一场有趣的游戏一样，每一步都有它的乐趣和挑战呢。
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1、相关的实验说明和相关的酶切图片。
2、测序的结果。
3、构建好的载体和菌液各一份。
4、如有鉴定的客户提供PCR鉴定图片。
分子克隆和质粒载体构建服务
简介:
分子克隆和质粒载体构建服务
—— pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
测序实验流程:
分子克隆的相关载体:DNA片段的克隆需要合适的载体,载体或是质粒,或是噬菌体,或是病毒,通常大多经过人工改造。作为载体必须具备两条件:一是该载体在细胞内必须能自主复制,即必须具备复制原点;二是该载体必须具备适合的酶切位点,且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条,保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆,载体上常有筛选标记,如对抗菌素的抗性,某些基因产物的显色反应等。【晶莱生物】
服务要ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ:
1、以Email等形式告知我们服务的主要目的及具体要求。
2、提供外源DNA的来源及背景资料。DNA来源包括:PCR扩增产物; RT -PCR扩增产物;从其它质粒上酶切得到的DNA片段等。
3、提供DNA片段的电泳照片,并请标明Marker有浓度。
4、提供载体来源与背景资料。
5、注明克隆使用的酶切位点以及是否需要平端连接等。
5、提供的引物如果为干品,请标注具体的OD数,如果是液体态,请标明浓度。
6、可以用甘油菌和穿刺菌形式邮寄菌体。(最好同时提供相应的质粒;如果提供质粒,则质粒的量最好在4ug以上;如果提供的是PCR产物,则PCR产物量最好在5u以上(最好附上电泳图
7、用于提取RNA/DNA的材料要新鲜。采样时应首先在液氮中速冻,保存在-80度的冰箱中,使用干冰运输。
相关材料说明:
1、对于实验材料中涉及病原体等危险材料不接受。
2、实验中涉及的碱基序列请以EMAIL的形式发到我中心。
3、实验中的使用载体要尽量提供背景资料:(质粒大小,抗性,拷贝数,多克隆位点等如果是商品化载体,请您提供生产厂家及标准名称;如果所提供载体是您自己构建的请注明大体结构情况。
4、提供常用的如(氨苄青霉素,氯霉素,卡那霉素以外的抗生素。