动物的克隆-1
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1950年Morgan等人经过大量研究设计的“199”培养液至今仍广泛 用于人及哺乳动物细胞的培养。
一、动物细胞培养
从动物机体中取出相关的组织，将它分散 成单个细胞，然后，放在适宜的培养液中，让 这些细胞生长和增殖。
一、动物细胞培养
1、动物细胞培养的条件
① 无菌、无毒环境 ② 营养：糖、氨基酸、促生长
1912年Carrel发现鸡胚浸出液对多种细胞生长有高度促进作用， 他将7天鸡胚心脏的组织块培养在血浆和鸡胚提取液的混合物中， 当细胞生长出晕后再把它分成两份进行培养，鸡胚细胞的培养连 续维持了34年之久。 Carrel使用的培养液，采用的无菌技术， 以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶)等都是对组织培养的重要贡献。
比较 项目
原理
结果
用途
植物组 织培养
动物细 胞培养
细胞的全 能性
细胞的增 殖
培育成 植株
培育成 细胞群
快速繁殖等
获得细胞的 产物或细胞
等
wenku.baidu.com
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性
融合前的处理
去除细胞壁
诱导融合的方法物理（离心、振动、 物理、化学方法
资料：用HAT培养基筛选得到杂交瘤细胞
单克隆抗体技术中人工诱导小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合后，细胞将以多种形式 出现，如脾细胞-瘤细胞、脾细胞-脾细胞、瘤细胞-瘤细胞、细胞多聚体、未融合的脾 细胞和瘤细胞等，其中只有脾细胞-瘤细胞的融合体是有用的。正常的脾细胞在培养 基中存活仅5-7天，无需特别筛选，细胞多聚体也容易死去，关键问题是要去除未融 合的瘤细胞。选择培养基具有3种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤 （aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基。这个培养基通 过抑制瘤细胞的核苷酸合成，达到去除未融合瘤细胞的目的。细胞有两条基本途径合 成嘌呤核苷酸，一条是从磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物开始，叶酸是重要 的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。另一 条途径是利用已存在的碱基，经特异的磷酸核糖转移酶催化合成核苷酸，如次黄嘌呤 经过次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）转变为嘌呤核苷酸。融合所用的瘤细胞是 选择出来的HGPRT缺陷细胞株，因此不能在HAT培养基中生长，而且不合成或不分 泌免疫球蛋白。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活 与繁殖并分泌抗体。用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活 性缺陷细胞的培养基。是含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全 培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合 成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨 髓杂交瘤细胞选择性培养基。
受精作用
细胞融合是正常的生命活动
(1)细胞融合技术的发展
Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中有多核的血细 胞存在。
1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物 细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学 融合法。
1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨 髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
因子、无机盐、微量元素、 动物血清等。 ③ 温度：一般与动物体温接近， 哺乳动物多以36.5±0.5为宜。 ④ 适宜的pH：多数细胞的最适 pH为7.2-7.4，CO2可以维持培 养液pH。一般为95%+5%的混 合气体。
2、动物细胞培养的过程
原代培养：从机体取 出后立即进行的细 胞培养。（P28）
20世纪80年代出现了电融合技术。
(2)动物细胞融合的过程
细胞融合 细胞杂交 （P31）
2、杂交瘤技术和单克隆抗体的制备过程
(1)什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生
特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
一个病原体有多个抗原，可以与多个 抗体特异结合
(2)传统的抗体制备技术：
抗原 反复注射
从血清中分离
动物
抗体
得到
特点：
产量低、 纯度低、 特异性差。
一个B淋巴细胞只产生一种特异性抗体
在体外，如果
克隆
单个B淋巴细胞
细胞群
产 生
化学性质单一、 特异性强的抗体 （单克隆抗体）
(3) 单克隆抗体的制备：
科勒 德国
米尔斯坦 英国
一个B淋巴细胞
一个骨髓瘤细胞 细胞杂交
1975年，两位科学家创 造性的工作解决了这一难 题。二人于1984年获得了 诺贝尔生理或医学奖
杂交瘤细胞
无限增殖、 产生大量的单克隆抗体
(3) 单克隆抗体的制备： 阳性孔
如何得到一个细胞的克隆？
3、单克隆抗体的应用
• 诊断和防治各种疾病。
• 研究抗原物质在细胞中的定位及其功能。
• 在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”， 治疗癌症。
位素的单抗
-----生物导弹
植物组织培养与动物细胞培养的比较
第二章 克隆技术
第三节 动物的克隆
动物克隆的技术基础是动物的细胞培养。
动物细胞和组织培养技术的发展
1885年Roux 用生理盐水培养鸡的神经板，发现它可在盐水中生 活一段时间。
1903年Jlly分别将皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，细胞存活 可达一周到一个月，并看到了细胞分裂。
1907年Harry为探讨神经纤维的真正来源，从蛙胚中分离出一部 分神经管，培养在一滴蛙的淋巴液中，成功地看到了神经纤维的 末端的生长，其中一根神经纤维在25分钟之内长到20微米，另一 根在50分钟内长到25微米，最长的达到了200微米。
电刺激）
（同左）
化学（聚乙二醇） 灭活的病毒
用途
获得杂种植株 制备单克隆抗体
资料：
（1）淋巴细胞合成DNA有D和S两条途径， 其中D途径能够被氨基喋呤阻断。但是一般 不分裂增殖。 （2）骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺陷型 细胞，其DNA合成过程只具有D途径，能被 氨基喋呤阻断。 （3）杂交瘤细胞则既可无限增殖，又具备 两条DNA合成途径。
传代培养：将细胞从 一个培养瓶分装到 多个培养瓶中继续 培养。 （P28）
细胞系 细胞株
一、动物细胞培养
3、动物细胞培养技术的应用
① 生产有价值的生物制品。 ② 检测有毒物质的毒性。 ③ 培养细胞用于生理、药理、病理研究为治疗和
预防疾病提供理论依据。
二、动物细胞融合与单克隆抗体 1、细胞融合与细胞杂交
一、动物细胞培养
从动物机体中取出相关的组织，将它分散 成单个细胞，然后，放在适宜的培养液中，让 这些细胞生长和增殖。
一、动物细胞培养
1、动物细胞培养的条件
① 无菌、无毒环境 ② 营养：糖、氨基酸、促生长
1912年Carrel发现鸡胚浸出液对多种细胞生长有高度促进作用， 他将7天鸡胚心脏的组织块培养在血浆和鸡胚提取液的混合物中， 当细胞生长出晕后再把它分成两份进行培养，鸡胚细胞的培养连 续维持了34年之久。 Carrel使用的培养液，采用的无菌技术， 以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶)等都是对组织培养的重要贡献。
比较 项目
原理
结果
用途
植物组 织培养
动物细 胞培养
细胞的全 能性
细胞的增 殖
培育成 植株
培育成 细胞群
快速繁殖等
获得细胞的 产物或细胞
等
wenku.baidu.com
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性
融合前的处理
去除细胞壁
诱导融合的方法物理（离心、振动、 物理、化学方法
资料：用HAT培养基筛选得到杂交瘤细胞
单克隆抗体技术中人工诱导小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合后，细胞将以多种形式 出现，如脾细胞-瘤细胞、脾细胞-脾细胞、瘤细胞-瘤细胞、细胞多聚体、未融合的脾 细胞和瘤细胞等，其中只有脾细胞-瘤细胞的融合体是有用的。正常的脾细胞在培养 基中存活仅5-7天，无需特别筛选，细胞多聚体也容易死去，关键问题是要去除未融 合的瘤细胞。选择培养基具有3种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤 （aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基。这个培养基通 过抑制瘤细胞的核苷酸合成，达到去除未融合瘤细胞的目的。细胞有两条基本途径合 成嘌呤核苷酸，一条是从磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物开始，叶酸是重要 的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。另一 条途径是利用已存在的碱基，经特异的磷酸核糖转移酶催化合成核苷酸，如次黄嘌呤 经过次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）转变为嘌呤核苷酸。融合所用的瘤细胞是 选择出来的HGPRT缺陷细胞株，因此不能在HAT培养基中生长，而且不合成或不分 泌免疫球蛋白。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活 与繁殖并分泌抗体。用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活 性缺陷细胞的培养基。是含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全 培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合 成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨 髓杂交瘤细胞选择性培养基。
受精作用
细胞融合是正常的生命活动
(1)细胞融合技术的发展
Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中有多核的血细 胞存在。
1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物 细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学 融合法。
1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨 髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
因子、无机盐、微量元素、 动物血清等。 ③ 温度：一般与动物体温接近， 哺乳动物多以36.5±0.5为宜。 ④ 适宜的pH：多数细胞的最适 pH为7.2-7.4，CO2可以维持培 养液pH。一般为95%+5%的混 合气体。
2、动物细胞培养的过程
原代培养：从机体取 出后立即进行的细 胞培养。（P28）
20世纪80年代出现了电融合技术。
(2)动物细胞融合的过程
细胞融合 细胞杂交 （P31）
2、杂交瘤技术和单克隆抗体的制备过程
(1)什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生
特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
一个病原体有多个抗原，可以与多个 抗体特异结合
(2)传统的抗体制备技术：
抗原 反复注射
从血清中分离
动物
抗体
得到
特点：
产量低、 纯度低、 特异性差。
一个B淋巴细胞只产生一种特异性抗体
在体外，如果
克隆
单个B淋巴细胞
细胞群
产 生
化学性质单一、 特异性强的抗体 （单克隆抗体）
(3) 单克隆抗体的制备：
科勒 德国
米尔斯坦 英国
一个B淋巴细胞
一个骨髓瘤细胞 细胞杂交
1975年，两位科学家创 造性的工作解决了这一难 题。二人于1984年获得了 诺贝尔生理或医学奖
杂交瘤细胞
无限增殖、 产生大量的单克隆抗体
(3) 单克隆抗体的制备： 阳性孔
如何得到一个细胞的克隆？
3、单克隆抗体的应用
• 诊断和防治各种疾病。
• 研究抗原物质在细胞中的定位及其功能。
• 在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”， 治疗癌症。
位素的单抗
-----生物导弹
植物组织培养与动物细胞培养的比较
第二章 克隆技术
第三节 动物的克隆
动物克隆的技术基础是动物的细胞培养。
动物细胞和组织培养技术的发展
1885年Roux 用生理盐水培养鸡的神经板，发现它可在盐水中生 活一段时间。
1903年Jlly分别将皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，细胞存活 可达一周到一个月，并看到了细胞分裂。
1907年Harry为探讨神经纤维的真正来源，从蛙胚中分离出一部 分神经管，培养在一滴蛙的淋巴液中，成功地看到了神经纤维的 末端的生长，其中一根神经纤维在25分钟之内长到20微米，另一 根在50分钟内长到25微米，最长的达到了200微米。
电刺激）
（同左）
化学（聚乙二醇） 灭活的病毒
用途
获得杂种植株 制备单克隆抗体
资料：
（1）淋巴细胞合成DNA有D和S两条途径， 其中D途径能够被氨基喋呤阻断。但是一般 不分裂增殖。 （2）骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺陷型 细胞，其DNA合成过程只具有D途径，能被 氨基喋呤阻断。 （3）杂交瘤细胞则既可无限增殖，又具备 两条DNA合成途径。
传代培养：将细胞从 一个培养瓶分装到 多个培养瓶中继续 培养。 （P28）
细胞系 细胞株
一、动物细胞培养
3、动物细胞培养技术的应用
① 生产有价值的生物制品。 ② 检测有毒物质的毒性。 ③ 培养细胞用于生理、药理、病理研究为治疗和
预防疾病提供理论依据。
二、动物细胞融合与单克隆抗体 1、细胞融合与细胞杂交