利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法_余庆
石家庄地区新生儿Citrin蛋白缺乏症串联质谱筛查结果分析
DOI:10.12280/gjszjk.20200585贾立云，封纪珍，王熙，马翠霞，封露露【摘要】目的：明确Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区活产新生儿中的患病率，进一步分析其致病基因突变情况。
方法：采用串联质谱技术对石家庄地区2014年1月—2019年12月出生的160061例新生儿进行血氨基酸水平检测，对疑似患儿进行基因检测。
结果：160061例新生儿中，筛查阳性患儿20例，经SLC25A13基因检测，确诊1例；另1例患儿筛查阴性，于不足1个月因皮肤黄染加重入院，查血串联质谱，显示瓜氨酸和甲硫氨酸升高，尿有机酸结果示4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸升高，此例患儿筛查呈现假阴性。
Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区的患病率为2/160061。
基因确诊的1例患儿为SLC25A13基因复合杂合突变，突变位点分别为c.1021+1G>A、c.851_854delTATG，其中c.1021+1G>A在人类基因突变数据库中未见报道。
结论：串联质谱技术应用于新生儿疾病筛查可及早发现Citrin蛋白缺乏症患儿；部分患儿筛查呈现假阴性；Citrin蛋白缺乏症在石家庄地区新生儿中的患病率2/160061；发现了1种SLC25A13基因新突变位点。
【关键词】新生儿筛查；尿素循环障碍，先天性；串联质谱法；突变；Citrin蛋白缺乏症Newborn Screening for Citrin Deficiency by Tandem Mass Spectrometry in Shijiazhuang JIA Li-yun,FENG Ji-zhen,WANG Xi,MA Cui-xia,FENG Lu-lu.Newborn Disease Screening and Treatment Center,Shijiazhuang Maternity&Child Healthcare Hospital,Shijiazhuang050000,ChinaCorresponding author:FENG Ji-zhen,E-mail:****************【Abstract】Objective:To determine the prevalence of citrin protein deficiency in neonates in Shijiazhuang,and further analyze the mutations of pathogenic genes.Methods:A total of160061newborns in Shijiazhuangfrom January2014to December2019were detected for blood amino acid levels by tandem mass spectrometry(MS/MS),and the genetic testing were performed for suspected infants.Results:Among the160061newborns,20cases were screened as positive cases,including1case confirmed the diagnosis with SLC25A13gene testing;and1case that was false negative in newborn screening.The latter child patient was admitted to the hospital due toyellowish skin aggravated in less than1month.The blood tandem mass spectrometry showed that citrulline andmethionine were elevated.The results of urine organic acids showed that4-hydroxyphenyllactic acid and4-hydroxyphenylpyruvic acid were both significantly increased.The prevalence of citrin protein deficiency inShijiazhuang is2/160061.The gene testing showed that one case was a compound heterozygous mutation ofSLC25A13gene.The mutation sites were c.1021+1G>A and c.851_854delTATG.There was no report of c.1021+1G>A in the human gene mutation database.Conclusions:The application of tandem mass spectrometry inneonatal disease screening can detect the citrin protein deficiency as early as possible.Some newborn patients maybe false negative screening;the gene testing is helpful for the diagnosis of citrin protein deficiency.The prevalenceof citrin deficiency in Shijiazhuang area is2/160061.In this paper,we reported a novel mutation site ofSLC25A13gene.【Keywords】Neonatal screening；Urea cycle disorders，inborn；Tandem mass spectrometry；Mutation；Citrindeficiency（ＪＩｎｔＲｅｐｒｏｄＨｅａｌｔｈ蛐ＦａｍＰｌａｎ，2021，40：182-184）·论著·基金项目：河北省医学科学研究重点课题（20191423）作者单位：050000石家庄市妇幼保健院新生儿疾病筛查诊治中心通信作者：封纪珍，E-mail：****************Citrin蛋白缺乏症是一类常染色体隐性遗传病，由SLC25A13基因突变所致，引起肝细胞线粒体Citrin蛋白功能不足，导致机体代谢紊乱[1]。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
高效液相色谱—串联质谱法在葡萄中的吡效隆和赤霉素测定中的应用
分析与检测吡效隆、赤霉素是一种植物生长调节剂，最常见于农业生产之中，使用之后能够使得果品变得膨大[1]。
现今很多的研究，更加侧重于研究赤霉素、吡效隆的机理以及使用，但是却少见吡效隆和赤霉素在果蔬残留中的相关检测[2]。
本文分析在对葡萄进行吡效隆、赤霉素的测定之中，将高效液相色谱—串联质谱法应用所取得的效果，作出的研究如下。
1 检验1.1 仪器设备以及实验试剂本次实验选用了高分离度快速液相色谱系统（型号为：AGLIENT RLC1200）、METTLER TOLEDO 公司生产的电子天平、IKA公司生产的涡旋混合器、安捷伦科技公司生产的三重串联四极杆质谱仪（型号为：6410B）、内切式均浆机、离心机、超声波仪器以及OA公司生产的氮吹仪等设备。
而实验试剂中，选用了德国公司生产的浓度超过98%的吡效隆和赤霉素，乙腈、甲酸、甲酸铵以及甲醇均为美国天地试剂公司生产的色谱纯，费罗门公司生产的SPE 小柱，葡萄样品购于农贸市场。
1.2 配置溶液取10 mg的吡效隆和赤霉素，吡效隆通过乙腈进行溶解，其定容为100 mL。
赤霉素通过体积为1︰1、浓度为0.1%的甲酸水溶液—乙腈进行溶解，其定容为100 mL，标准储备液为100 mg/L。
通过体积为4︰1、浓度为0.1%的甲酸水溶液—乙腈进行逐级稀释，配合成100.0、20.0、10.0、50.0、5.0 μg/L以及2.0 μg/L的混合溶液。
1.3 对样品进行处理将100 g葡萄样品通过果汁机进行破碎，破碎后取5 g的样品，将5 g样品加入5 mL的（体积为4︰1，浓度为0.1%）甲酸水溶液—乙腈之中，进行1 min的匀浆，通过超声进行8min的提取，之后在10 000 r/min的条件下进行5 min的离心，取5 mL的上清液。
通过5 mL的乙腈将SPE小柱进行活化，然后在取5 mL浓度为0.1%的甲酸水溶液进行平衡。
将5 mL的上清液过SPE小柱，通过5 mL浓度为0.1%的甲酸水溶液进行淋洗之后将其抽干。
超高效液相色谱–串联质谱法同时测定蔬菜中阿维菌素和氟吡菌酰胺的残留
超高效液相色谱–串联质谱法同时测定蔬菜中阿维菌素和氟吡菌酰胺的残留作者：陈丽霞许丽建陈歆彭黎旭来源：《热带作物学报》2021年第01期摘要：为建立同时测定蔬菜中阿维菌素和氟吡菌酰胺残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，采用乙腈高速匀浆提取蔬菜样品中的阿维菌素和氟吡菌酰胺，利用无水硫酸镁和PSA吸附剂进行净化，在UPLC-MS/MS的正离子电离和多反应离子监测模式下进行测定。
结果表明，阿维菌素和氟吡菌酰胺的检出限分别为1.0、0.2 µg/kg;在0.005～0.200 mg/L浓度范围内，其线性相关系数均大于0.999。
阿维菌素和氟吡菌酰胺在3个试验水平（0.01、0.02和1.0 mg/kg）的添加回收率分别为83%～106%和90%～108%，相对标准偏差分别在0.5%～5.2%和1.2%～8.4%。
本方法前处理过程快速简单，仪器分析灵敏度好，方法准确度高，可用于蔬菜样品中阿维菌素和氟吡菌酰胺农药残留量的检测分析。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱;蔬菜;阿维菌素;氟吡菌酰胺;残留中图分类号：S481.8 文献标识码：AAbstract： To determine the residues of abamectin and fluopyram in vegetable samples， a method was established using the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The vegetable samples were extracted with acetonitrile and purified with MgSO4 and PSA adsorbents. The target compounds were separated by a C18 UPLC column， then detected by electro-spray ionization （ESI+） and multiple reaction monitoring （MRM） mode. Quantification was performed by peak area external standard methods using matrix-matched calibration curves. In the range of 0.005 to 0.200 mg/L with good linear relationships， the correlation coefficients were better than 0.999. The limit of detection （LOD） of abamectin and fluopyram was 1.0 and 0.2µg/kg， respectively. At 0.01 to 1.0 mg/kg spiked levels for vegetable samples， the recovery of abamectin was between 83% and 106%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 0.5% to 5.2%; the recovery of fluopyram was between 90% and 108%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 1.2% to 8.4%. This method is simple， quick， accurate， and could be applied to the determination of the four pesticides residues in vegetable samples.Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; vegetable; abamectin; fluopyram; residueDOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.034阿维菌素（abamectin）是一种大环内酯类广谱杀菌剂，主要从链霉菌的发酵产物中分离得到，对昆虫和螨类具有较好的触杀和胃毒作用，在农业生产中使用较广[1-3]。
2021年基于生物质谱数据鉴定单核苷酸变异的生物信息学方法
基于生物质谱数据鉴定单核苷酸变异的生物信息学方法在肽段鉴定领域，图谱库搜索是一种有望取代序列数据库搜索的鉴定策略，下面是搜集的一篇探究生物质谱数据鉴定单核苷酸变异的，欢迎阅读参考。
单核苷酸变异(singlenucleotidevariations,SNVs)是由DNA序列上单个碱基变异产生的,包括碱基的缺失、插入、转换及颠换等.SNVs是基因组序列变异的主要形式[1],同时也是生物体生理和病理变异的遗传基础[2].从遗传学的角度看,SNVs既可以存在于具有遗传性的生殖细胞中,也可以存在于不具有遗传性的体细胞中.其中,只有位于基因编码区的SNVs能够影响蛋白的编码.位于编码区的SNVs可以分为3类:(ⅰ)同义SNVs,不改变相应的氨基酸种类;(ⅱ)无义SNVs,突变成为终止 ___子,提早结束编码;(ⅲ)非同义SNVs(nonsynonymousSNVs,nsSNVs),改变氨基酸的种类.nsSNVs能够改变蛋白的结构、功能、表达以及亚细胞定位等[3],进而对多种遗传性的特征、疾病以及癌症等产生影响[4~9],如人类耳垢的类型[6]、腋窝的气味[7]、癌症与肿瘤的发生[8]、阿尔茨海默病[9]以及镰刀形红细胞贫血症[10]等.因此,对SNVs展开研究可以揭示出基因与表型多样性和基因与疾病间的关系,并且有可能研发出治疗疾病的新方法.目前,全基因组关联研究(genome-wideassociationstu ___s,GWAS)[11]虽然在基因变异与表型多样性的研究中产出了许多能够用来解释特异性疾病分子途径的结果,但是仍然难以对绝大部分具有复杂特征的分子机制以及SNVs与复杂疾病表型间的关系进行解释[12].在这种情况下,对突变蛋白的研究提供了另一种了解基因型与表型间关联的方法[13].由SNVs引起的单个氨基酸的变异称为单氨基酸变异(singleaminoacidvariations,S ___s),因此S ___s是SNVs在蛋白水平上的表现.对S ___s的研究,有助于了解基因型与表型间的关系,进而从本质上了解基因是怎样在蛋白水平上影响生物体的生命过程的[14].目前,基于串联质谱的鸟枪法蛋白质组学(shotgunproteomics)技术由于其自动化、高通量、高灵敏度和高分辨率等特点,已成为大规模蛋白质研究的主要方法.序列数据库搜索算法由于具有较高的可靠性以及灵敏度而成为当今鸟枪法蛋白质组学中蛋白鉴定的主要生物信息学方法.然而,通常蛋白质数据库在构建时为了减小数据库的冗余程度,往往有意压缩对S ___s信息的收录(如Swiss-Prot数据库[15,16],IPI数据库[17]等),从而使得常用的数据库搜索策略不能有效地鉴定出样本中的氨基酸突变信息.为此,研究人员提出了一系列鉴定突变蛋白的方法,如构建包含有突变信息的蛋白质数据库、构建相似性图谱库等.在基于串联质谱进行S ___s鉴定时,可以采用与蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTMs)鉴定[18]相同的方法,这是因为肽段的突变和修饰在质谱图中的表现都是质量迁移,如甲硫氨酸(Met)氧化与丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)在质量上都是增加16Da[19],所以鉴定PTMs的算法和流程通常也能够鉴定S ___s(如Bonanza算法[20]).虽然PTMs和S ___s的质谱鉴定方法非常相似,但由于其上的差别,在实际的鉴定策略中有所不同.(ⅰ)PTMs的种类远比S ___s要多,鉴定PTMs所需的搜索空间一般会比鉴定S ___s 所需的大,在质量控制方面具有更大的挑战;(ⅱ)蛋白水平的S ___s 大部分是从基因组或转录组延续过来的,充分利用SNVs的数据能大大降低搜索空间,从而得到更可靠的结果.因此在计算方法与策略方面,S ___s和PTMs的鉴定具有一定的相似性,也有其独有的特点.本文从序列数据库搜索算法、序列标签搜索算法以及图谱库搜索算法3个大方面,详细地介绍了目前基于生物质谱数据鉴定S ___s 的各种生物信息学方法,并分析了各种突变鉴定方法的不足之处,最后介绍了基于生物质谱的S ___s鉴定研究现状及其发展方向.当前基于生物质谱的S ___s鉴定算法都是由常规鉴定算法改进而来的,因此根据常规串联质谱鉴定算法中对数据库的依赖程度以及使用的数据库种类,可以将基于生物质谱的S ___s鉴定算法分为3大类(表1):(ⅰ)完全依赖序列数据库的搜索算法,即基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法.此算法利用前体离子质量从序列数据库中筛选出候选肽段,然后将候选肽段的理论图谱与目标图谱进行比对,从而鉴定出样品中的突变肽段;(ⅱ)将从头测序算法(denovo)与序列比对结合的算法,即基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法.此算法首先通过denovo测序算法推导出目标图谱中的肽序列标签(peptidesequen ___tags,PSTs),然后利用PSTs过滤数据库筛选出候选肽段,最后结合PSTs对理论谱图与目标图谱进行比较打分,从而鉴定出样品中的突变肽段;(ⅲ)依赖于图谱库的搜索算法,即基于图谱库的氨基酸突变鉴定算法.此算法将实验图谱与图谱库中的一致性图谱进行比对,从而鉴定出样品中的突变肽段.这3类方法和策略在实施过程中各有其优劣(表1),相互之间暂无法替代,因此在不同的目的下各有其适用性.1.1基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法,根据不同的数据库构建方法可以细分为3类:(ⅰ)基于穷举法的氨基酸突变鉴定算法,即通过枚举数据库中氨基酸残基的所有可能突变种类进行突变肽段的鉴定;(ⅱ)结合已知氨基酸突变信息对突变肽段进行鉴定,即结合当前变异数据库(如dbSNP数据库[21]、CO ___IC数据库[22]等,表2列举了常用的氨基酸与基因突变数据库)中的变异信息构建数据库进行突变肽段的鉴定;(ⅲ)基于样本特异性的数据库鉴定突变肽段,即结合样本数据中可能存在的突变肽段信息构建数据库进行突变肽段的鉴定.以下将对这3种方式进行逐一详细地说明.(1)基于穷举法的氨基酸突变鉴定算法.在序列数据库搜索中,最早对突变肽段进行鉴定的自动化方法是穷举法,此方法不仅原理简单而且理论上能够鉴定出样品中所有可能的突变肽段.这类算法的大体步骤是:通过穷举法罗列出所有可能的突变肽段序列,然后用常规鉴定方法进行比对打分筛选出最有可能的突变肽段序列.此类算法的代表有SEQUEST-SNP算法[27]和Siprosv2.0算法[18]等.Gatlin等人[27]在2000年,利用改进的SEQUEST算法(SEQUEST-SNP)率先实现了利用自动化的数据库搜索对突变肽段进行鉴定.此方法特点在于动态生成所有可能的核苷酸突变序列,将其翻译成肽段并构建成一个数据库用于对突变肽段的鉴定.此后,通过穷举蛋白序列中所有可能的氨基酸突变进行肽段突变鉴定的方法在Mascot[28]和X!Tandem[29]相继采用.xx年,Hyatt和Pan[18]提出了不受数据库约束的穷举法突变肽段鉴定算法Siprosv2.0,此算法通过肽段产生模块和肽段打分模块实现对CPU和内存效率的优化以应对穷举法产生的大数据库.理论上,穷举法能够鉴定出样品中所有的突变肽段,但肽段中的每一个氨基酸残基都有18种可能的突变,因此利用此方 ___大大增加搜索空间[18,24],延长搜索时间,并且会增加假阳性风险从而降低结果的灵敏度.(2)结合已知氨基酸突变信息对突变氨基酸进行鉴定.为了避免穷举法引起搜索空间过大的问题,一些团队提出结合已知的编码SNVs信息或是与疾病等有关的突变信息构建蛋白质数据库,以减小突变肽段的搜索范围.此类数据库的代表有MSIPI[17]和MS-CanProVar[24]等.xx年,Schandorff等人[17]将一些dbSNP数据库[21]的编码SNP(singlenucleotidepolymorphi ___)以及与IPI(theinternationalproteinindex)数据库中数据有冲突的序列等整合到IPI数据库[30]中构建了质谱友好型的变异数据库MSIPI.其质谱友好型体现在,在保留原始IPI条目完整性的基础上,将后加的肽段序列附加到原有序列中,用不代表任何氨基酸的字母"J"将原始条目与附加肽段区分开来,并且将在原始条目的表头信息中加入附加肽段信息.同年,Bunger等人[31]也利用dbSNP数据库中人类基因变异信息构建变异蛋白质数据库K-SNPdb,并构建相应的常规数据库.然后对分开搜库结果进行比对打分,筛选出高可信的变异肽段.Li等人[24]在xx年基于人类癌症蛋白质变异数据库CanProVar[32]构建了一个MS-CanProVar数据库,此数据库中不仅包含了dbSNP数据库中的编码的SNP信息,还包括了CO ___IC[22]和OMIM[23]等数据库中与癌症相关的体细胞变异信息.除了自定义构建突变数据库以外,氨基酸突变信息也被一些在线平台收录、整合,如Swiss-Var[33],SysPIMP[34]和RAId_DbS[35]等.Swiss-Var ___搜集的是Swiss-Prot数据库[36]中突变肽段的信息,主要为用户提供Swiss-Prot数据库中的突变肽段信息及其与疾病间的关系.SysPIMP主要用于鉴定与人类疾病有关的突变肽段序列,它的数据主要OMIM数据库中等位基因突变信息、蛋白质突变数据库(protei ___utationdatabase,PMD)[37]以及Swiss-Prot数据库中与人类疾病和多态性有关的序列信息.而在RAId_DbS数据库中不仅整合了S ___s与疾病的信息,同时也收录了PTMs与疾病有关的信息.xx年,Mathivanan等人[25]提出的iMASp策略即是利用现有的突变信息对突变肽段进行鉴定.这种策略利用了分步搜索的方法,即是第一次通过常规搜索鉴定出样本中的常规蛋白,第二次利用突变数据库对第一次没有鉴定出的质谱图进行搜索鉴定样品中的突变肽段.相比穷举法,结合已知氨基酸突变信息对突变氨基酸进行鉴定的方法虽然在一定程度上缩小了搜索空间,但在数据库中添加的上万条突变肽段序列绝大部分不会在样品数据集中出现.因此,这种方法并没有十分有效地规避假阳性升高以及鉴定结果灵敏性降低的缺点[14].(3)基于样本特异性的数据库鉴定突变肽段.除了直接利用公共数据库中的突变数据外,利用DNA/RNA等信息提供的样本特异性突变构建的数据库能更好地贴合实际样本数据,提高鉴定效率.目前利用样本特异性鉴定突变肽段的方法有2种:两次搜索数据库的方法以及利用转录组数据构建数据库的方法.两次搜索数据库的方法与iMASp策略中所使用的分步搜索以及Mascot和X!Tandem中的容错搜索相似,不同的地方在于两次搜索数据库中所使用的突变数据库依赖于样本特异性的DAN/RAN信息,而iMASp策略中的突变数据库是整合所有已知的蛋白突变信息,不具有样本特异性;Mascot和X!Tandem则是对第一次搜索所得的蛋白序列进行穷举从而鉴定出突变或修饰肽段.Chernobrovkin等人[38]提出的二次迭代法以及Su等人[39]构建样本特异性突变数据库的策略都是样本特异性的两次搜索方法的代表.另一种方法是利用转录组数据构建样本特异性数据库用于突变肽段的鉴定.相对于利用公共的突变数据库,利用转录组数据构建蛋白质数据库可以由样品转录组数据直接推导样本中可能存在的蛋白及其突变序列并由其构建数据库[40].用此方法构建的数据库所包含的蛋白质信息更加接近样品中真实信息,因此这种无偏性的数据库能高效地鉴定出样品中存在的突变序列[16,41].由于转录组数据十分庞大,在现有的计算能力下要想利用转录组数据构建数据库就必须要对转录组数据进行压缩.xx年,Edwards[16]提出了一个压缩表达序列标签(expressedsequen ___tags,ESTs)数据的策略,实现了利用EST 数据库进行常规化的肽段序列和变异位点的鉴定.此压缩策略的特点在于选用某种方法来表示肽段,确保绝大多数的重复肽段序列被消除,并且不影响肽段序列的鉴定.随着下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术的出现,RNA测序(RNA-sequecing,RNA-Seq)的成本越来越低[14],并且克服了EST测序存在的克隆偏性和高花费等缺点[42],因此利用RNA-Seq数据构建样本特异性数据库逐渐受到人们的重视.Wang等人[41]在xx年提出了一个利用RNA-Seq数据构建样本特异性数据库的策略,此策略通过两步来实现:(ⅰ)利用一个经验性的RPKM(readsperkilobasespermillionreads)值排除不表达或低表达基因以减小数据库中的条目;(ⅱ)将由RNA-Seq数据鉴定得来的高可靠性SNVs的相应肽段添加到数据库中,以寻找变异肽段.此后,Wang和Zhang[43]为生成自定义RNA-Seq数据库编写了R程序包customProDB,能够生成含有突变、插入、缺失等变异肽段的RNA-Seq数据库.xx年,Sheynk ___n等人[14]实践了Wang和Zhang[43]的方法,利用Jurkat细胞系的RNA-Seq数据构建一个自定义的变异蛋白质数据库,并成功地应用在Jurkat细胞系的质谱数据突变鉴定中.同年,Woo等人[44]在尽量不影响鉴定结果灵敏性的基础上,将秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的RNA-Seq数据压缩了近1000倍,并利用此数据库成功地鉴定到了新型蛋白.由于并不是所有的样本都同时拥有蛋白质数据和RNA-Seq数据,因此,Wang和Zhang[43]利用64个大肠癌的RNA-Seq数据构建了一致性蛋白质数据库,并成功地将此数据库应用在蛋白鉴定中.样本特异性的数据库,特别是利用RNA-Seq数据构建的样本数据库不仅能够有效地缩减搜索空间,而且能够鉴定出样品中所有已知类型的蛋白种类以及新型的变异肽段序列.随着计算方法的不断改进,通过RNA-Seq数据对样本进行突变肽段的鉴定方法有望成为常规的突变鉴定方法.(4)基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法的缺点.在鉴定突变肽段的方法中,虽然通过构建含有突变信息的序列数据库鉴定突变肽段的方法是目前被最广泛采用的方法,但它的缺点也是不容忽视的.(ⅰ)除了利用穷举法构建的突变数据库以外,利用其他方法构建的突变数据库对突变信息包含得都不够全面,如公共数据库通常会有意忽略对变异数据的收录,而样本特异性数据库为了减小搜索空间通常也会去除低表达的蛋白质;(ⅱ)序列数据搜索中,当图谱中的碎裂信息不够完整、信噪比较低时,搜索引擎就不能将候选肽段正确地区分开[45],因而会增加假阳性的概率.为了避免序列数据库的上述缺点,提出了其他鉴定突变肽段的方法,如序列标签算法、图谱库搜索算法等.1.2基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法相比序列数据库搜索算法利用肽段母离子质量从数据库中筛选候选肽段,序列标签算法利用denovo测序算法推导的PSTs能够更有效地过滤数据库,减少候选肽段的数目以缩小搜索空间,使得更复杂和计算更密集的方法能够应用到对候选肽段的突变打分算法中[45],从而提高了突变鉴定结果的灵敏性并且减少了结果中的假阳性率.下面从序列标签搜索算法与denovo测序算法之间的关系以及当前结合PSTs进行氨基酸突变鉴定的主流工具两个方面对序列标签算法鉴定突变氨基酸进行介绍.(1)序列标签搜索算法与denovo测序算法.相比序列数据库搜索算法,denovo算法在对质谱图进行氨基酸序列推导时不依赖蛋白质数据库,因此它在鉴定氨基酸突变方面有独特的优势[45~47].当前使用denovo测序算法的代表性工具有SHERENGA[48],PEAKS[49~51]以及PepNovo[52]等.这些工具所使用的算法都是通过生成前缀残基质量图谱(prefixresidue ___ssspectra)重构整个图谱进行肽段序列推导的,因此这些算法对质谱图的质量具有较高的要求[45].但通过诱导碰撞解离(collision-indu ___ddissociation,CID)产生的串联图谱中不可避免地含有不完整的碎裂离子系列、噪音离子和精度较差的碎裂离子质量,这使得denovo算法常常产生一些不确定的序列区域,导致denovo算法通常只能准确地推导出肽段序列中的部分序列[46].因此,结合denovo算法鉴定的部分肽段序列进行数据库搜索的序列标签算法应运而生,这种算法不仅可以利用denovo推导出的PSTs作为筛选候选肽段时的过滤指标,有效地减少搜索空间,而且可以通过改变PSTs与候选肽段匹配的打分算法,提高对突变肽段的鉴定效率.(2)结合肽序列标签的氨基酸突变鉴定算法.最早结合PSTs进行数据库搜索的方法是由Mann和Wilm[53]在1994年提出的,此方法不仅能有效地对常规图谱进行鉴定,而且能够鉴定出带有突变或修饰图谱的肽段序列.当前结合肽序列标签对氨基酸突变进行鉴定的算法或程序有GutenTag程序[54],Opensea工具[55],SPIDER程序[56,57],InsPecT搜索引擎[45],DirecTag算法[58]以及MoDa算法[59]等.鉴定突变氨基酸常用的序列标签软件及其网址见表3.GutenTag是由Yates实验室 ___出来的能够自动推导+2电荷母离子串联图谱PSTs用于数据库搜索的算法,其特点是利用碎片离子峰强度经验模型并结合相邻氨基酸和碎片离子的相对质量对肽段碎裂的影响推导PSTs,之后用多个PSTs进行搜库,同时放宽对PST两端质量匹配的限制,从而能够有效地进行突变肽段的鉴定.但由于GutenTag算法没有考虑同源突变或修饰,所以此算法只能对数据库中已存在的突变序列进行鉴定,并且由于在打分方面存在漏洞[55],所以鉴定出来的结果中存在较高的假阳性.在GutenTag算法发表后的第2年,Searle等人[55]首次将序列标签算法的思想应用于非限制翻译后修饰,并提出了基于质量的序列比对算法工具Opensea.Opensea的特点是利用基于质量的宽度优先的算法("breadth-firstsearch"algorithm)鉴定出突变位点或修饰位点.但宽度优先的算法是一种贪婪的匹配算法,并且在Opensea中没有考虑在一个位点上同时存在denovo的测序错误和同源突变的情况,所以它不能保证最终结果的可靠性.SPIDER方法与Opensea工具有相似的序列标签算法思想,但与Opensea不同的是,它能够在一个位置上同时考虑denovo的测序错误和同源突变的情况,并且利用动态规划算法进行比对打分.SPIDER算法已被整合进PEAKS软件中,专门用来对突变肽段和跨物种的同源性肽段进行鉴定.在GutenTag算法推出后,Pevzner实验室迅速推出了InsPecT序列标签算法搜索引擎[45],它是最早实现规模化鉴定翻译后修饰肽段的搜索工具,现在仍然被广泛使用.InsPect搜索引擎推导PSTs的算法的特点在于利用改进的denovo算法推导出PSTs作为过滤器缩小候选肽段的范围,并利用树状快速搜索方法(fasttree-basedsearch)找出与PSTs匹配的候选肽段,用基于动态规划算法(dynamicprogramming)的图谱比对方法鉴定修饰肽段,并在打分算法中考虑肽段的碎裂模式.在推导PSTs时,InsPecT需要构建前缀残基质量图,而DirecTag算法则是直接利用串联图谱的质核比值和峰强度信息对可能的标签进行打分.由于DirecTag只能用来推导PSTs,因此其团队后续 ___了TagRecon算法[47]并将DirecTag,TagRecon 和IDPicker工具[60]整合成鉴定突变和修饰肽段的流程,其大致过程为:(ⅰ)利用DirecTag生成PSTs;(ⅱ)TagRecon利用PSTs对常规数据库进行候选肽段过滤,并且定位数据集中的突变或修饰肽段;(ⅲ)利用IDPicker工具对鉴定结果进行质量控制并且装配成蛋白.此流程算法在xx年由Abraham等人[19]在鉴定胡杨树(Populus)单氨基酸多态性的实验中被成功地使用.目前序列标签算法都依赖于denovo测序构建PSTs,但是由denovo 算法测出的肽片段往往存在部分构建错误的序列[56].MoDa算法[59]在搜索候选肽段时,由于采用序列标签链算法(ta___hainalgorithm)[61],能有效地避免由denovo测序引起的错误匹配.在MoDa算法中,将序列标签算法和动态规划算法结合,同时利用多条序列标签与候选肽段进行比对,找出存在质量差的位点,然后利用基于动态规划算法的图谱比对算法找出最佳的肽段序列.此方法能够大规模地鉴定出存在多个修饰位点或突变位点的肽段.(3)基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法面临的问题.基于肽段序列标签的氨基酸突变序列鉴定算法虽然能够有效地利用PSTs过滤数据库,弥补denovo测序算法的测序错误并且提高对突变或修饰肽段鉴定的效率和准确性,但目前已有的PSTs算法仍然存在着许多不足,如在GutenTag算法中没有考虑同源突变或修饰,所以不能鉴定出数据库中不存在的突变序列,而在Opensea软件中没有考虑到突变位点的出现可能是由denovo的测序错误引起的等.但是图谱质量是限制序列标签算法的主要因素,因为低能CID碎裂模式通常很难将质量相同或相近的碎裂离子区分开来,如亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)和谷氨酰胺(Gln)以及苯丙氨酸(Phe)和氧化的甲硫氨酸(Met)等[46].近年来,随着电子转移解离(electrontransferdissociation,ETD)和高能碰撞解离(high-energycollisionindu ___ddissociation,HCD)的出现,越来越多的比CID质谱图质量高的、含有丰富的碎裂离子信息的.高精度质谱图被产出,这些高精度的质谱图能更好地适用于序列标签算法,提高其准确性.1.3基于图谱库搜索的氨基酸突变鉴定算法在肽段鉴定领域,图谱库搜索是一种有望取代序列数据库搜索的鉴定策略[62].相比序列数据库搜索策略,图谱库搜索策略有以下优点:(ⅰ)直接利用图谱库中每一张真实图谱的各种不同的特征信息进行比对,如碎片离子峰的峰强度信息、碎裂模式等,使图谱比对算法具有更高的灵敏性;(ⅱ)能够在一个更小、更精确的搜索空间内进行搜索,可以比序列搜索速度快好几个数量级;(ⅲ)能够轻松地鉴定出图谱库中已存在的变异肽段[63].对于依赖于图谱库搜索的蛋白突变鉴定来讲,目前最大的限制图谱库的覆盖范围,尤其是对突变和修饰肽段图谱的包含[63,64].由于在相似的条件下,肽段的图谱具有可再生性[65]并且相似序列的肽段通常能够产生相似的质谱图[20,66],因此一批利用图谱库中已收录的肽段图谱来扩大图谱库对肽段的覆盖范围,以实现对氨基酸突变进行鉴定的算法或工具应运而生.目前常用的图谱搜索软件及其网址见表4.在蛋白质组学中,图谱库搜索概念早在1998年就由Yates等人[70]率先提出,但由于质谱仪通量不高、生物质谱数据缺乏以及质谱数据的自动化分析方法不完善等[71]原因使得图谱库搜索策略发展缓慢.直到最近10年,随着质谱和计算机技术的快速发展,鉴定出的肽段图谱匹配对(peptidespectrum ___tch,P ___)的数目与日俱增,图谱库搜索策略才逐渐被应用到大规模数据集和数据库中.最近,图谱库搜索策略更是被用于发掘样品中的突变肽段.要用图谱搜索策略来鉴定样品中的突变肽段,就必须要扩大图谱库对突变肽段的覆盖范围.目前用于扩大图谱库覆盖范围的算法有pMatch[63]、半经验算法[72,73]以及Ji等人[66]提出的相似性算法等.pMatch在构建图谱时,利用肽段已知的实验图谱和理论图谱混合构建图谱,用来缓冲由修饰或突变氨基酸残基引起的肽段碎裂模式的变化[64].由Hu等人[72]在xx年提出的半经验方法通过利用图谱库中已收录的P___s构建突变肽段的质谱图以扩大对突变肽段的覆盖范围.这种算法把图谱库中图谱对应的肽段序列替换为相应的突变肽段序列,并将突变肽段的碎裂离子的质核比值替换到图谱中.xx年,Ji等人[66]提出的相似性算法通过利用相似序列肽段的图谱来推断目标肽段的图谱,以达到扩充图谱库的覆盖范围的目的.这种算法的特点是,通过加权K邻近相似算法[66](weightedK-nearestneighbormethod)和支持向量机(supportvector ___chine,SVM)[74],利用与目标肽段序列相似且长度相等的肽段的图谱来精确地预测目标肽段序列的优势碎裂离子(如b,y离子类型以及其中性丢失离子类型等)的峰强度,并且利。
基于液相色谱—串联质谱的氨基酸代谢组学方法研究黄芪注射液治疗脑缺血
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基于液相色谱—串联质谱的氨基酸代谢组学方法研究黄芪注射液治疗脑缺血
作者：吴宏伟高健李韶菁等
来源：《分析化学》2013年第03期
摘要：建立了基于液相色谱串联质谱技术的氨基酸代谢组学分析方法。
选用Diamonsil
C18色谱柱，乙腈0.1%甲酸为流动相，梯度洗脱，三重四级杆质谱检测器，MRM扫描方式，12 min内对血浆中12种氨基酸进行定量分析。
应用本方法对脑缺血模型和黄芪注射液的治疗作用做出评价。
通过偏最小二乘判别分析统计发现，脑缺血12 h，其血浆中的氨基酸代谢表达存在显著差异，结合载荷图及VIP值确定丝氨酸、天冬氨酸、甘胺酸等7种脑缺血生物标识物；采用黄芪注射液治疗后，从得分图上可以看到氨基酸代谢的轨迹发生了较大变化；与脑缺血模型组比较，丝氨酸、天冬氨酸、甘胺酸等生物标识物均向正常水平趋近。
关键词：氨基酸代谢组；液相色谱串联质谱；脑缺血；黄芪注射液。
质谱技术在现代生物科学领域中的应用
质谱技术在现代生物科学领域中的应用（学院：生命科学与技术学院系别：生物工程专业班级：0902 姓名：刘佳）【摘要】随着科技的进步，现代生物学成为了科学家们的研究热点，研究的重心也由最初的细胞水平转移到蛋白质、分子、基因水平。
因此质谱技术成为了现代生物学领域必不可少的研究手段。
本文简要综述了质谱技术在蛋白质结构鉴定、蛋白质组学、后基因时代、抗原表位等研究中的应用。
【关键词】质谱技术蛋白质组学抗原表位Application of Mass-Spectrometric Technique in ModernBiological Terms^(ACADEMY: Life Science and Technology DEPARTMENT: Bioengineering CLASS:0902 NAME: Jia Liu)【Abstract】 With the progress of technology, modern biological has been a research hotspot, it now focuses on protein level, molecular level and genetic level from original cellular level. Thus, Mass-Spectrometric Technique becomes a requisite research measure in modern biological. This paper makes a brief summary of application of Mass-Spectrometric Technique in protein structure identification, proteomics, postgenomic era, epitope etc.【Key words】 Mass-Spectrometry proteomics epitope1.1引言}众所周知，21世纪被科学家及众多学者称为生命科学的世纪，随着科技的不断进步，在生物学领域不断的深入研究，人们看到了生物学对于人类社会以及整个生物界的影响都是巨大的，因此各国也加快了对生物学领域的研究。
超高效液相色谱串联质谱法同时测定腰果中8种氨基甲酸酯类农药
锥 孔 电 压
（ ） Ｖ
碰 接 能 量
（ Ｖ） ｅ
涕 灭威
２． ７９
１ ．３ ６６ Ｏ
１ １ １ １
５ ５
２ ２
涕 灭 威 砜
８ ２Ｏ ６． １． ６３ １ ８． Ｏ ４ ２
涕 灭 威 亚 砜
１． ３１
１１ ２ ６． Ｏ １ ６． Ｏ ５ ２
１ ２ 标 准 溶 液 的 配 制 ．
力ｌ ］ ２ 。因此 ， 时 测 定 该 类 农 药 的 母体 及 其 代 谢 。 同
产 物在腰 果 中的残 留量 有着 非常 重要 的意义 。 食 品 中氨基 甲酸酯 类农 药残 留量 的分析 方法 国 内外 均 有很 多 报 道 ， 主要 有 高 效 液 相 色谱 （ Ｌ ＨＰ Ｃ） 法 【 、 相色谱 （ ） ７］ 气相 色谱 一质谱 （ — ４ 气 ］ ＧＣ 法［ 、 ＧＣ ＭＳ 法 ［ ＿ ） ９ 以及 高效 液 相 色 谱 一 谱 （ Ｌ —ＭＳ ｌ 质 ＨＰ Ｃ ） 法 口 。本 文采 用 ＵＰ Ｃ “ 等 Ｌ —ＭＳ ＭＳ法 测 定 腰 果 ／ 中 ８ 常见 的氨 基 甲酸酯 类 农 药 残 留量 ， 种 分析 速 度 较常规 的 Ｌ — ／ Ｃ ＭＳ ＭＳ方法要 快 ５倍 以上 ， 灵敏 度 、
表 ２ 各 目标 化 合 物 的 线 性 范 围 、 归 方 程 、 关 系数 、 出 限 与 定量 下 限 回 相 检
１ 实 验 部 分
１ １ 仪 器 与 试 剂 ．
Ｗａｅｓ ６ ５高效 液相 色 谱 仪 （ 国 Ｗａｅｓ ｔｒ ９ ２ 美 ｔｒ 公
司） 配 备荧 光 检 测 器 （ 国 Ｗａｅｓ公 司） 氮 吹仪 ， 美 ｔｒ ；
１ ３ 样 品 制 备 ．
高效液相色谱-串联质谱法检测腰果中的黄曲霉毒素
高效液相色谱-串联质谱法检测腰果中的黄曲霉毒素毕瑞锋;范志先;付萌【摘要】A method for the determination of four aflatoxins in cashew using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed. The sample was extracted with methanol-water (8:2, v/v) solution, followed by a cleanup procedure with Florisil column. The target compounds were eluted using 5 mL acetone-water-formic acid (96: 3.5:0.5, v/v/v) solution. The eluate was dried under N2, then dissolved in 1 mL methanol. Four aflatoxins were separated in MGC18 column (100 mm ×3. 0 mm, 3 μm) adopting a gradient program within 15 min. A triple quadrupole mass spectrometry equipped with an electros-pray ionization source operated in the positive ion mode was used to detect the aflatoxins. The good correlation coefficients ( r2 ＞ 0. 997 ) of the four aflatoxins were obtained within their respective linear ranges. The limits of detection (S/N = 3) were between 0. 009 μg/kg and 0.04 μg/kg, and the limits of quantification (S/N - 10) were between 0.03μg/kg and 0. 12 μg/kg. The recoveries were in a range of 63. 0% -78. 5% with the relative standard deviations (RSDs) varied from 2. 8% to 9. 1%. The validation results meet the requirements of trace assay. Matrix effects were estimated and the signal suppression/enhancement ranged from 88. 8% to 99. 4%. The results indicate that the developed method is simple, fast, accurate, and can be applied for the determination of fours aflatoxins in cashew.%建立了腰果中4种黄曲霉毒素的高教液相色谱-串联质谱检测方法(HPLC-MS/MS).样品用甲醇-水(8:2,v/v)溶液提取后用弗罗里硅土柱净化,5 mL丙酮-水-甲酸溶液(96:3.5:0.5,v/v/v)洗脱,氮吹至干,1 mL甲醇定容；在资生堂MG C18色谱柱(100mmx3.0mm,3μm)上梯度洗脱分离,然后采用电喷雾离子化三重四极杆串联质谱测定.实验结果表明,4种黄曲霉毒素在各自的线性范围内峰面积与其质量浓度线性关系良好,相关系数(r2)大于0.997;检出限(信噪比为3)为0.009～0.04μg/kg,定量限(信噪比为10)为0.03～0.12μg/kg;平均回收率为63.0％～78.5％,相对标准偏差为28％～91％,均符合痕量分析的要求.评价了基质效应,信号抑制/增强值为88.8％～99.4％,说明净化后的基质效应较小.该方法简单快速、准确可靠,可用于腰果中黄曲霉毒素的检测.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2011(029)012【总页数】5页(P1155-1159)【关键词】高效液相色谱-串联质谱法;黄曲霉毒素;腰果【作者】毕瑞锋;范志先;付萌【作者单位】青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;诺安检测服务有限公司,山东青岛266002;青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;诺安检测服务有限公司,山东青岛266002【正文语种】中文【中图分类】O658黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是高温潮湿环境下黄曲霉及寄生曲霉产生的次级代谢物，具高毒性和致癌作用，主要作用部位是人和动物的肝脏。
超高效液相色谱
超高效液相色谱 串联质谱同时测定首乌藤中13种成分作者：罗益远刘娟秀王锋刘训红王胜男华愉教兰才武来源：《中国中药杂志》2016年第08期[摘要]建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）同时测定首乌藤中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜芦醇）、蒽醌（大黄素、大黄素甲醚、大黄素8βD葡萄糖苷、芦荟大黄素）、黄酮（表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素）及酚酸（没食子酸）等13种成分的方法。
采用Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）色谱柱，流动相为水（含01%甲酸）乙腈，梯度洗脱，柱温35 ℃，流速025 mL·min-1，采用电喷雾离子源（ESI），多反应离子监测（MRM）扫描方式进行检测。
采用TOPSIS法对13种成分进行分析评价。
结果13种成分在一定浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数大于0991 5，精密度、重复性和稳定性良好；加样回收率在9524%～1023%，RSD均小于5%。
TOPSIS分析显示广州产的样品综合质量较好。
所建立的方法准确、专属性、重复性较好，可用于首乌藤中多元功效物质或指标成分的同时测定，为首乌藤药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。
[关键词]首乌藤；UPLCMS/MS；二苯乙烯类；蒽醌；黄酮；酚酸；同时测定[Abstract]A comprehensive analytical method based on UPLCMS/MS was developed for the simultaneous determination of thirteen components including three stilbenes （stilbeneglucoside，polydatin， resveratrol）， four anthraquinones （emodin， physcion，emodin8βDglucopyranoside， aloeemodin）， five flavonoids （epicatechin， rutin， hyperoside，astragalin，quercetin） and one phenolic acid （gallic acid） in Polygoni Multifori CaulisThe separation was carried out on a Waters BEH C18 column（21 mm×100 mm，17 μm）with gradient elution of acetonitrilewater （01% acetic acid） at a flow rate of 025 mL·min-1， and column temperature was 35 ℃ The target compounds were analyzed by multiple reaction monitoring （MRM） mode TOPSIS analysis ware performed to evaluate the samples from different areas and commercial herbs according to the contents of thirteen components The correlation coefficients of all the calibration curves were higher than 0991 5 The average recoveries ranged from 9524% to 1023%， and the relative standard deviations were less than 5% The result of TOPSIS analysis showed that the comprehensive quality of Polygoni Multifori Caulis sample from Guangzhou was better The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances， which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Polygoni Multifori Caulis[Key words]Polygoni Multifori Caulis； UPLCMS/MS； stilbenes； anthraquinones；flavonoids； phenolic acids； simultaneous determinationdoi：10.4268/cjcmm20160818首乌藤为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥藤茎，具有养血安神、祛风通络的功效，临床用于治疗失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛、皮肤瘙痒[1]，已被列入卫生部公布的可用于保健食品的物品名单，其改善睡眠的主要有效成分为蒽醌类、黄酮类[23]。
超高效液相色谱_串联质谱法快速检_省略_喹诺酮类_四环素族抗生素药物残留_刘正才
超高效液相色谱 - 质谱联用仪(配有电喷雾离子源 ESI 及 Mass.1ynx4.0 数据处理软件)、固相萃取装置、 OASIS HLB 固相萃取小柱(3ml，60mg)、Acquity UPLC BEH C18 柱(55mm × 2.1mm，1.7μm) Waters 公司；离 心机 美国 Beckman Coulter 公司；高速组织捣碎机 德 国 IKA 公司；涡旋混合器 上海医科大学仪器厂； MilliQ 纯水系统 Millipore 公司；0.22μm 微孔滤膜。 1.3 仪器条件
食品科学
※分析检测
测，单类兽药残留检测存在耗时耗力、低效率等弊端，目 前世界上很多国家都在重点研究多类残留的同时检测[12-13]。 本实验拟根据磺胺类、喹诺酮类以及四环素族抗生素的 结构特点，参考各类药物已有的提取、净化方法，通 过日常检测的反复试验和验证，在原有检测方法上加以 改进，以期探索出一套能同时提取和检测三类抗生素的 快速检测方法，以实现对生物样品中低含量、多组分 抗生素的同时测定。
LIU Zheng-cai，YANG Fang，YU Kong-jie，LI Yao-ping，LIN Yong-hui，ZHANG Qiong，LIU Su-zhen (Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)
Simultaneous Determination of Qunolones, Sulfonamides and Tetracyclines Residues in Eel Using Solid Phase Extraction (SPE) and Ultra-performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS-MS)
串联质谱氨基酸代谢产物信号_理论说明
串联质谱氨基酸代谢产物信号理论说明1. 引言1.1 概述氨基酸是构成生物体蛋白质的基本组成单元，同时也参与着细胞代谢和能量转化等多种重要生理过程。
氨基酸代谢产物信号通过串联质谱技术的分析和解读，可以为我们揭示氨基酸代谢途径、疾病发生机制以及药物效果评估等方面提供重要线索。
1.2 文章结构本文将围绕串联质谱氨基酸代谢产物信号展开讨论，共分为五个主要部分。
引言部分作为本文的开篇，介绍了研究背景和意义，并对接下来各节的内容进行简单概括。
第二部分将详细介绍质谱技术及其在氨基酸代谢研究中的应用，以强调该技术在该领域的重要性。
第三部分将探讨氨基酸代谢产物信号生成机制，并介绍相关的理论模型和解释。
然后，在第四部分中，我们将探讨串联质谱的分析方法以及实验设计中需要注意的事项。
最后，通过总结和对比分析主要研究发现，我们在第五部分提出了结论及展望，包括研究存在的局限性、改进方向以及未来研究方向和应用前景展望。
1.3 目的本文旨在系统阐述串联质谱氨基酸代谢产物信号的理论和实践，并通过深入探讨氨基酸代谢产物信号的生成机制、质谱技术的应用以及实验设计等方面，为相关领域的研究者提供参考。
同时，我们也将指出当前研究中存在的不足之处，并提出未来研究的发展方向和应用前景展望。
通过本文的撰写，我们希望推动氨基酸代谢产物信号研究的进一步发展，为生命科学领域做出更深入的贡献。
2. 串联质谱氨基酸代谢产物信号理论说明:2.1 质谱技术简介质谱是一种常用的分析技术，可用于研究化合物的结构、组成以及其在化学和生物学过程中的变化。
其中，串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）是一种特殊的质谱技术，能够提供更加详细和准确的分析结果。
在串联质谱中，通过将多级离子选择装置与质谱仪连接，并使用多级离子反应器（collision cell），可以进一步分解和筛选质荷比（m/z）比较小的碎片离子。
2.2 氨基酸代谢产物信号的重要性氨基酸是生命体中重要的有机物之一，在细胞代谢中发挥着关键作用。
质谱 氨基酸突变热点 方法学
质谱氨基酸突变热点方法学
质谱是一种用于分析化合物的技术，它通过测量分子的质量来确定其结构和组成。
在生物化学领域，质谱技术被广泛应用于分析蛋白质和氨基酸的结构与功能。
氨基酸突变热点是指蛋白质序列中发生频繁突变的氨基酸位置，这些位置可能对蛋白质的功能和稳定性产生重要影响。
而方法学则是指研究这些问题所采用的方法和技术。
在质谱分析中，常用的方法包括质谱仪、质谱图谱解析和质谱数据库比对。
质谱仪可以将样品中的分子离子化并测量其质荷比，从而得到分子的质量信息。
质谱图谱解析则是利用质谱仪得到的数据进行分析，以确定样品中的分子结构和组成。
质谱数据库比对则是将实验得到的质谱数据与已知的质谱数据库进行比对，从而确定样品中的化合物。
在研究氨基酸突变热点时，科学家们通常会利用质谱技术来分析蛋白质样品中氨基酸的序列和突变情况。
通过质谱分析，他们可以确定蛋白质中氨基酸的位置和突变类型，进而研究这些突变对蛋白质结构和功能的影响。
此外，质谱技术还可以用于分析蛋白质修饰，如磷酸化、甲基化等修饰对蛋白质功能的影响。
总的来说，质谱技术在研究氨基酸突变热点方面发挥着重要作用，通过质谱分析，科学家们可以深入了解蛋白质分子的结构和功能，为生物医学和生物技术领域的研究提供重要的数据支持。
2019-2020学年余庆中学高三生物下学期期末试卷及答案
2019-2020学年余庆中学高三生物下学期期末试卷及答案一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。
每小题只有一个选项符合题目要求。
1. S基因是果蝇染色体上的白眼基因，在该基因中插入一个碱基对引起了果蝇眼色的变化。
下列相关叙述正确的是（）A.该变异可导致染色体上基因的排列顺序发生变化B.在高倍显微镜下可看到该基因序列的改变C.S基因突变后嘌呤碱基和嘧啶碱基比例发生变化D.突变后的基因是S基因的等位基因2. 现提供可配制斐林试剂的溶液：甲液（0.1g/mL的NaOH溶液）．乙液（0.05g/mL的CuSO4溶液）以及蒸馏水，如果充分利用上述试剂及必需的实验用具，可灵活地鉴别出下列哪些物质？（）①葡萄糖①蔗糖①胃蛋白酶（化学本质是蛋白质）①RNAA. ①①B. ①①C. 只有①D. ①①①①3. 科学的发展离不开科学家们的卓越贡献。
下列有关说法不正确的是A.鲁宾和卡门证明光合作用产生的氧气来自水，运用了放射性同位素标记法B.沃森和克里克研究DNA分子的结构时，运用了模型建构的方法C.罗伯特森通过光学显微镜的观察，提出了生物膜“蛋白质一脂质一蛋白质”的三层结构D.孟德尔通过豌豆杂交试验，提出了分离定律和自由组合定律，运用了假说一演绎法4. 现用一对纯合灰鼠杂交,F1都是黑鼠,F1中的雌雄个体相互交配,F2体色表现及比例为黑①灰①白=9①6①1。
下列叙述正确的是()A.控制小鼠体色基因的遗传遵循自由组合定律B.若F1与白鼠杂交,后代表现为黑鼠①灰鼠①白鼠=2①1①1C.F2灰鼠中能稳定遗传的个体占1/2D.F2黑鼠有2种基因型5. 某同学在做“绿叶中色素的提取和分离”实验时，为了确定无水乙醇、CaCO3和SiO2的作用，进行了4组实验来验证，4组实验结果如图所示，第①组是进行了正确操作的对照组。
下列针对实验结果的相关分析不正确的是A.①可能是由于未加CaCO3而得到的实验结果B.①可能是由于用水取代了无水乙醇而得到的实验结果C.①可能是由于未加SiO2而得到的实验结果D.绿叶中的色素都能够溶解在层析液中，四种色素的溶解度相同6. 下列关于人体内环境的叙述，正确的是（）A.细胞内液与外液共同构成机体的内环境B.胰腺合成并分泌的物质均进入内环境C.因毛细血管通透性增大引起的组织水肿现象发生在内环境中D.内环境的变化不一定会引起机体的自动调节活动7. 一株杂合的红花豌豆进行自花传粉,共结出10粒种子,9粒种子长成的植株开红花,第10粒种子长成的植株开红花的概率是()A.9/10B.3/4C.1/2D.1/48. 下列有关糖类的叙述，错误的是（）A.糖类可以简写为（CH2O）B.白糖属于单糖C.淀粉的水解产物是还原糖D.虾和蟹的外壳中都含有多糖9. 芦苇是我国主要的造纸原料，使用下面哪种激素可以使其增产（）A. 生长素B. 乙烯C. 赤霉素D. 细胞分裂素10. 如图表示生态系统中的食物网，相关叙述正确的是（）A.该食物网中共有6条食物链B.该食物网中的所有生物构成生物群落C.蝗虫和老鼠在不同食物链中都属于同一营养级D.若老鼠全部死亡消失，对狼的影响比对猫头鹰显著11. 脱落酸（ABA）与赤霉素（GA）对种子的休眠、萌发具有重要调控作用。
液相色谱串联质谱法测定辐照鱼酱中多种氨基酸及同分异构体
液相色谱串联质谱法测定辐照鱼酱中多种氨基酸及同分异构体邵宏宏;相兴伟;王琦;周向阳;周秀锦;沈飚;傅谧妮【摘要】建立了液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定鱼酱中辐照相关的多种氨基酸及同分异构体的分析方法,并建立了辐照鱼酱检测方法.样品通过盐酸水解,采用Waters Sunfire C18柱,0.1％甲酸溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,正离子(ESI+)模式可快速有效分离及准确测定辐照鱼酱中的对酪氨酸(p-Tyrosine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)及其辐照特异性产物间酪氨酸(m-Tyrosine)和邻酪氨酸(o-Tyrosine)的含量.在10～500 μg/L范围内,所测氨基酸及同分异构体的线性相关系数为0.9985～0.9998,回收率为75.1％～104.5％,相对标准偏差小于8.9％.方法适用于对含蛋白质鱼酱中辐照相关的多种氨基酸和其同分异构体的测定,从而对其是否经过辐照进行准确鉴定.%A credible HPLC-MS/MS method for determination of isomers of Tyrosine and Phenylalanine is established to identify the irradiated fish paste.The sample is dissolved with hydrochloric acid.The separation is achieved on Waters Sunfire C18 column by mobile phase of methanol and 0.1％ formic acid for gradient elution.The positive ion (ESI+) mode can be used for rapid and effective separation and accurate determination of the content of p-Tyrosine,Phenylalanine and m-Tyrosine and o-Tyrosine in the irradiated specific products.In the range of 10～500 μg/L,the linear correlation coefficient of the measured amino acids and isomers is 0.9985～0.9998,the relative standard deviation is less than 8.9％.The method is suitable for the determination of a variety of amino acids and their isomers related to irradiation in protein-containing fish paste,so as to accurately identify whether they are irradiated.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2017(042)012【总页数】6页(P141-146)【关键词】辐照;鱼酱;氨基酸;同分异构体;液相色谱串联质谱【作者】邵宏宏;相兴伟;王琦;周向阳;周秀锦;沈飚;傅谧妮【作者单位】舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000;浙江省海洋开发研究院,浙江舟山316000;舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000;舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000;舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000;舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000;舟山出入境检验检疫局,浙江舟山316000【正文语种】中文【中图分类】TS264.2食品辐照可有效控制食品中食源性病原体，减少微生物负载和虫害，抑制生理过程和延长货架期，被广泛应用于食品加工和贮存领域[1]。
液相色谱-串联质谱法测定水稻中生长素及其氨基酸结合物
液相色谱-串联质谱法测定水稻中生长素及其氨基酸结合物曹赵云;马有宁;陈铭学;牟仁祥;胡秀芳【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2011(30)12【摘要】建立了同时测定水稻中吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)及其7种氨基酸结合物的液相色谱-串联质谱( HPLC - MS/MS)检测方法.样品在4℃下于80％甲醇中浸提12 h后,经混合阴离子交换反相固相萃取(MAX)净化,以5 mmol/L的甲酸铵溶液和甲醇为流动相,在C18柱上进行液相色谱分离,电喷雾正离子模式下用三重四极杆质谱仪多反应监测方式测定.对水稻根、茎、叶和籽粒4种基质分别进行加标回收实验,9种分析物的平均加标回收率为75％～ 106％,RSD为3.6％～15.2％,方法检出限(S/N=3)为0.01 ～25 μg/kg.方法准确、灵敏,能满足水稻中9种生长素及其结合物在其生理水平的测定.%A liquid chromatography - tandem mass spectrometric ( LC - MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of indole-3-butyric acid (IB A) , indole-3-acetic acid (IAA) and its 7 amino acid conjugates including IAA - Asp, IAA - Ala, IAA - Val, IAA - Tip, IAA -Leu, IAA - He and IAA - Phe in rice. The sample was extracted with 80% methanol for 12 h at 4 ℃. The extract was cleaned up on an Oasis MAX cartridge (60 mg x3 mL) , and eluted with methanol contained 0. 5% formic acid. 9 analytes were separated on a C18 column (1.8 |xm, 100 mm x 2. 1 mm I. D. ) using 5 mmol/L ammonium formate (A) - acetonitrile ( B) as mobile phase by gradient elution. The analytes were detected by positive-ion electrospray ionization - mass spectrometryunder multiple reaction monitoring( MRM) mode. The recoveries of 9 analytes from the matrixes of root, sheath, leaf and seed in rice tissue ranged from 75% to 106% with relative standard deviations (RS-Ds) of 3. 6% -15.2%. The detection limits(S/7V = 3) ranged from 0. 01 |xg/kg to 25|xg/kg. The method was sensitive and reliable, and could meet the requirements for quantification of auxins and their amino acid conjugatesin rice at the physiological level.【总页数】6页(P1419-1424)【作者】曹赵云;马有宁;陈铭学;牟仁祥;胡秀芳【作者单位】浙江理工大学生命科学学院,浙江杭州310018;中国水稻研究所农业部稻米及制品质量监督检验测试中心,浙江杭州310006;中国水稻研究所农业部稻米及制品质量监督检验测试中心,浙江杭州310006;中国水稻研究所农业部稻米及制品质量监督检验测试中心,浙江杭州310006;中国水稻研究所农业部稻米及制品质量监督检验测试中心,浙江杭州310006;浙江理工大学生命科学学院,浙江杭州310018【正文语种】中文【中图分类】O657.63;S963.732【相关文献】1.液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中大豆苷元及其葡萄糖苷酸结合物 [J], 仇峰;陈笑艳;钟大放2.超高效液相色谱串联质谱法测定豆类食品中的游离神经递质类氨基酸 [J], 罗葵;宋学英3.超高效液相色谱–串联质谱法测定马铃薯中8种必需氨基酸 [J], 莫日根;杜艳;吕娟;王宁;朱叶青4.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛心浸粉中7种氨基酸的含量 [J], 周刚;候海玲;李鹏飞;纪紫薇;郝美玲5.超高效液相色谱串联质谱法测定豆类食品中的游离神经递质类氨基酸 [J], 罗葵;宋学英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
液相色谱-串联质谱法测定徽州毛豆腐中18种氨基酸
液相色谱-串联质谱法测定徽州毛豆腐中18种氨基酸作者：郝玉玲盛新颖武文文徐雅芫程江华张雷来源：《食品安全导刊》2023年第10期摘要：本文建立了徽州毛豆腐中18种氨基酸快速检测的方法，样品以沸水浸提，以液相色谱-串联质谱法测定。
结果显示，该方法在9 min内可完成所有氨基酸的分离，检出限为2.44～6.36 μg·kg-1，定量限为8.05～20.99 μg·kg-1，加标回收率在83.60%～101.20%，相对标准偏差在0.27%～2.61%。
该方法具有分析速度快、重复性好等优点。
关键词：氨基酸；液相色谱-串联质谱；徽州毛豆腐Determination of 18 Amino Acids in Huizhou Maotofu by Liquid Chromatography Tandem Mass SpectrometryHAO Yuling1， SHENG Xinying1*， WU Wenwen1， XU Yayuan2， CHENG Jianghua2，ZHANG Lei3（1.Anhui Kebo Product Testing and Research Institute Co.， Ltd.， Hefei 230001， China;2.Institute of Agricultural Products Processing， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China;3.Anhui Institute of Food and Drug Inspection， Hefei 230021， China）Abstract： This article establishes a rapid detection method for 18 amino acids in Huizhou Maotofu. The samples are extracted with boiling water and determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The results showed that the method could complete the separation of allamino acids within 9 minutes， with a detection limit of 2.44～6.36 μg·kg-1， a quantification limit of 8.05～20.99 μg·kg-1， an spiked recovery rate of 83.60%～101.20%， and a relative standard deviation of 0.27%～2.61%. This method has the advantages of fast analysis speed and good repeatability.Keywords： amino acids; liquid chromatography tandem mass spectrometry; Huizhou Maotofu徽州毛豆腐因其长毛和口感独特等特征，成为我国著名的素食佳肴。
液相色谱-串联质谱法测定植物油中阿维菌素和甲维盐残留
液相色谱-串联质谱法测定植物油中阿维菌素和甲维盐残留寿林飞;张文童;虞淼;梁赤周
【期刊名称】《浙江农业科学》
【年(卷),期】2013(000)012
【摘要】建立了测定植物油中阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐残留量的液相色谱-串联质谱法.植物油样品用二氯甲烷稀释,经氨基固相萃取柱净化,洗脱液经氮气吹干后定容,液相色谱-串联质谱法分析阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐.结果表明,添加浓度为0.01 ～0.05 mg·kg-1,植物油中阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐添加回收率为76.6％～93.5％,相对标准偏差(n=5)为2.7％～9.0％,阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的方法检出限分别为0.002和0.000 3 mg· kg-1,定量限分别为0.005和0.001 mg· kg-1.
【总页数】3页(P1651-1653)
【作者】寿林飞;张文童;虞淼;梁赤周
【作者单位】浙江省农药检定管理所,浙江杭州310021;南通市白蚁防治所,江苏南通226001;浙江省农药检定管理所,浙江杭州310021;浙江省农药检定管理所,浙江杭州310021
【正文语种】中文
【中图分类】S481+.8
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中国科学: 生命科学2014年 第44卷 第11期: 1113 ~ 1124SCIENTIA SINICA Vitae 引用格式: 余庆, 吴松锋, 马洁, 等. 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 1113–1124Yu Q, Wu S F, Ma J, et al. Bioinformatics algorithms for identification of amino acid mutations in tandem mass spectrometry. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 1113–1124, doi: 10.1360/N052014-00099《中国科学》杂志社SCIENCE CHINA PRESS评 述利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法余庆①②, 吴松锋②③, 马洁②③, 朱云平②③*, 舒坤贤①*① 重庆邮电大学生物信息学研究所, 重庆 400065;② 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206; ③ 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850 * 联系人, E-mail: zhuyunping@; shukx@收稿日期: 2014-03-05; 接受日期: 2014-04-22; 网络版发表日期: 2014-09-17国家自然科学基金(批准号: 21105121, 21275160)、国家高技术研究发展计划(批准号: 2012AA020409, 2012AA020201)和北京市自然科学基金(批准号: 5122013)资助项目 doi: 10.1360/N052014-00099摘要 氨基酸突变能够改变蛋白的结构和功能, 影响生物体的生命过程. 基于串联质谱的鸟枪法蛋白质组学是目前大规模研究蛋白质组学的主要方法, 但是现有的质谱数据鉴定流程为了提高鉴定结果的灵敏度往往会有意压缩数据库中的氨基酸突变信息. 因此, 如何挖掘数据中的氨基酸突变信息成为当前质谱数据鉴定的一个重要部分. 当前应用于氨基酸突变鉴定的串联质谱鉴定方法大致可以分为3大类: 基于序列数据库搜索的方法、基于序列标签搜索的算法以及基于图谱库搜索的算法. 本文首先详细介绍了这3种氨基酸突变鉴定算法, 并分析了各种方法的特点和不足, 然后介绍了氨基酸突变鉴定的研究现状和发展方向. 随着基于串联质谱的蛋白质组学的不断发展, 蛋白序列中的氨基酸突变信息将被更好地解析出来, 从而得以深入探讨由氨基酸突变引起的蛋白结构和功能改变, 为揭示氨基酸突变的生物学意义奠定基础.关键词 氨基酸突变 串联质谱鸟枪法蛋白质组学 氨基酸突变鉴定单核苷酸变异(single nucleotide variations, SNVs)是由DNA 序列上单个碱基变异产生的, 包括碱基的缺失、插入、转换及颠换等. SNVs 是基因组序列变异的主要形式[1], 同时也是生物体生理和病理变异的遗传基础[2]. 从遗传学的角度看, SNVs 既可以存在于具有遗传性的生殖细胞中, 也可以存在于不具有遗传性的体细胞中. 其中, 只有位于基因编码区的SNVs 能够影响蛋白的编码. 位于编码区的SNVs 可以分为3类: (ⅰ) 同义SNVs, 不改变相应的氨基酸种类; (ⅱ) 无义SNVs, 突变成为终止密码子, 提早结束编码; (ⅲ) 非同义SNVs(nonsynonymous SNVs, nsSNVs), 改变氨基酸的种类. nsSNVs 能够改变蛋白的结构、功能、表达以及亚细胞定位等[3], 进而对多种遗传性的特征、疾病以及癌症等产生影响[4~9], 如人类耳垢的类型[6]、腋窝的气味[7]、癌症与肿瘤的发生[8]、阿尔茨海默病[9]以及镰刀形红细胞贫血症[10]等. 因此, 对SNVs 展开研究可以揭示出基因与表型多样性和基因与疾病间的关系, 并且有可能研发出治疗疾病的新方法. 目前, 全基因组关联研究(genome- wide association studies, GWAS)[11]虽然在基因变异与余庆等: 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法1114表型多样性的研究中产出了许多能够用来解释特 异性疾病分子途径的结果, 但是仍然难以对绝大部分具有复杂特征的分子机制以及SNVs 与复杂疾病表型间的关系进行解释[12]. 在这种情况下, 对突变蛋 白的研究提供了另一种了解基因型与表型间关联的方法[13].由SNVs 引起的单个氨基酸的变异称为单氨基酸变异(single amino acid variations, SAVs), 因此SAVs 是SNVs 在蛋白水平上的表现. 对SAVs 的研究, 有助于了解基因型与表型间的关系, 进而从本质上了解基因是怎样在蛋白水平上影响生物体的生命过程的[14]. 目前, 基于串联质谱的鸟枪法蛋白质组学(shotgun proteomics)技术由于其自动化、高通量、高灵敏度和高分辨率等特点, 已成为大规模蛋白质研究的主要方法. 序列数据库搜索算法由于具有较高的可靠性以及灵敏度而成为当今鸟枪法蛋白质组学中蛋白鉴定的主要生物信息学方法. 然而, 通常蛋白质数据库在构建时为了减小数据库的冗余程度, 往往有意压缩对SAVs 信息的收录(如Swiss-Prot 数据 库[15,16], IPI 数据库[17]等), 从而使得常用的数据库搜索策略不能有效地鉴定出样本中的氨基酸突变信息. 为此, 研究人员提出了一系列鉴定突变蛋白的方法, 如构建包含有突变信息的蛋白质数据库、构建相似性图谱库等.在基于串联质谱进行SAVs 鉴定时, 可以采用与蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)鉴定[18]相同的方法, 这是因为肽段的突变和修饰在质谱图中的表现都是质量迁移, 如甲硫氨酸(Met)氧化与丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)在质量上都是增加16 Da [19], 所以鉴定PTMs 的算法和流程通常也能够鉴定SAVs(如Bonanza 算法[20]). 虽然PTMs 和SAVs 的质谱鉴定方法非常相似, 但由于其来源上的差别, 在实际的鉴定策略中有所不同. (ⅰ) PTMs 的种类远比SAVs 要多, 鉴定PTMs 所需的搜索空间一般会比鉴定SAVs 所需的大, 在质量控制方面具有更大的挑战; (ⅱ) 蛋白水平的SAVs 大部分是从基因组或转录组延续过来的, 充分利用SNVs 的数据能大大降低搜索空间, 从而得到更可靠的结果. 因此在计算方法与策略方面, SAVs 和PTMs 的鉴定具有一定的相似性, 也有其独有的特点.本文从序列数据库搜索算法、序列标签搜索算法以及图谱库搜索算法3个大方面, 详细地介绍了目前基于生物质谱数据鉴定SAVs 的各种生物信息学方法, 并分析了各种突变鉴定方法的不足之处, 最后介绍了基于生物质谱的SAVs 鉴定研究现状及其发展 方向.1 氨基酸突变鉴定的算法当前基于生物质谱的SAVs 鉴定算法都是由常规鉴定算法改进而来的, 因此根据常规串联质谱鉴定算法中对数据库的依赖程度以及使用的数据库种类, 可以将基于生物质谱的SAVs 鉴定算法分为3大类(表1): (ⅰ) 完全依赖序列数据库的搜索算法, 即基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法. 此算法利用前体离子质量从序列数据库中筛选出候选肽段, 然后将候选肽段的理论图谱与目标图谱进行比对, 从而鉴定出样品中的突变肽段; (ⅱ) 将从头测序算法(de novo )与序列比对结合的算法, 即基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法. 此算法首先通过de novo 测序算法推导出目标图谱中的肽序列标签(peptide sequence tags, PSTs), 然后利用PSTs 过滤数据库筛选出候选肽段, 最后结合PSTs 对理论谱图与目标图谱进行比较打分, 从而鉴定出样品中的突变肽段; (ⅲ) 依赖于图谱库的搜索算法, 即基于图谱库的氨基酸突变鉴定算法. 此算法将实验图谱与图谱库中的一致性图谱进行比对, 从而鉴定出样品中的突变肽段. 这3类方法和策略在实施过程中各有其优劣(表1), 相互之间暂无法替代, 因此在不同的目的下各有其适用性.1.1 基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法, 根据不同的数据库构建方法可以细分为3类: (ⅰ) 基于穷举法的氨基酸突变鉴定算法, 即通过枚举数据库中氨基酸残基的所有可能突变种类进行突变肽段的鉴定; (ⅱ) 结合已知氨基酸突变信息对突变肽段进行鉴定, 即结合当前变异数据库(如dbSNP 数据 库[21]、COSMIC 数据库[22]等, 表2列举了常用的氨基酸与基因突变数据库)中的变异信息构建数据库进行突变肽段的鉴定; (ⅲ) 基于样本特异性的数据库鉴定突变肽段, 即结合样本数据中可能存在的突变肽段信息构建数据库进行突变肽段的鉴定. 以下将对这3种方式进行逐一详细地说明.中国科学: 生命科学 2014年 第44卷 第11期1115表1 氨基酸突变鉴定的算法类别优点不足基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法 现有的蛋白突变序列信息相对比较丰富, 覆盖度比较广; 理论上能够鉴定到所有可能的突变肽段依赖于数据库所包含的信息; 搜索空间较大、灵敏度较低基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法 能够有效地过滤数据库, 降低搜索空间; 具有较强的处理能力和用于突变肽段鉴定的潜能 依赖de novo 算法以及过滤算法 基于图谱库的氨基酸突变鉴定算法利用图谱的真实信息; 有较高的灵敏度图谱库的覆盖范围小; 图谱搜索引擎对图谱的解析度较低表2 常用氨基酸及基因突变数据库数据库 数据库简介 网址 参考文献COSMIC 收录和展示体细胞突变的信息和相关细节, 以及与人类癌症有关的信息/cancergenome/projects/cosmic/ [22]OMIM 收录遗传疾病、表型与人类基因, 主要关注遗传变异与表型间的关系/omim/ [23] MS-CanProVar收录各个数据库中有关癌症的蛋白变异数据和dbSNP 数据库中的编码SNVs/canprovar/ [24] HPMD 收录各个大型数据库中的蛋白突变信息/HPMD [25] HGMD 收集已知的与人类遗传疾病有关的基因变异信息/ac/index.php [26] dbSNP收录各种变异基因的信息/snp/ [21](1) 基于穷举法的氨基酸突变鉴定算法. 在序列数据库搜索中, 最早对突变肽段进行鉴定的自动化方法是穷举法, 此方法不仅原理简单而且理论上能够鉴定出样品中所有可能的突变肽段. 这类算法的大体步骤是: 通过穷举法罗列出所有可能的突变肽段序列, 然后用常规鉴定方法进行比对打分筛选出最有可能的突变肽段序列. 此类算法的代表有SEQUEST-SNP 算法[27]和Sipros v2.0算法[18]等. Gatlin 等人[27]在2000年, 利用改进的SEQUEST 算法(SEQUEST-SNP)率先实现了利用自动化的数据库搜索对突变肽段进行鉴定. 此方法特点在于动态生成所有可能的核苷酸突变序列, 将其翻译成肽段并构建成一个数据库用于对突变肽段的鉴定. 此后, 通过穷举蛋白序列中所有可能的氨基酸突变进行肽段突变鉴定的方法在Mascot [28]和X!Tandem [29]相继采用. 2012年, Hyatt 和Pan [18]提出了不受数据库约束的穷举法突变肽段鉴定算法Sipros v2.0, 此算法通过肽段产生模块和肽段打分模块实现对CPU 和内存效率的优化以应对穷举法产生的大数据库. 理论上, 穷举法能够鉴定出样品中所有的突变肽段, 但肽段中的每一个氨基酸残基都有18种可能的突变, 因此利用此方法会大大增加搜索空间[18,24], 延长搜索时间, 并且会增加假阳性风险从而降低结果的灵敏度.(2) 结合已知氨基酸突变信息对突变氨基酸进行鉴定. 为了避免穷举法引起搜索空间过大的问题, 一些团队提出结合已知的编码SNVs 信息或是与疾病等有关的突变信息构建蛋白质数据库, 以减小突变肽段的搜索范围. 此类数据库的代表有MSIPI [17]和MS-CanProVar [24]等. 2007年, Schandorff 等人[17]将一些来自dbSNP 数据库[21]的编码SNP(single nucleotide polymorphism)以及与IPI(the international protein index)数据库中数据有冲突的序列等整合到IPI 数据库[30]中构建了质谱友好型的变异数据库MSIPI. 其质谱友好型体现在, 在保留原始IPI 条目完整性的基础上, 将后加的肽段序列附加到原有序列中, 用不代表任何氨基酸的字母“J”将原始条目与附加肽段区分开来, 并且将在原始条目的表头信息中加入附加肽段信息. 同年, Bunger 等人[31]也利用dbSNP 数据库中人类基因变异信息构建变异蛋白质数据库K-SNPdb, 并构建相应的常规数据库. 然后对分开搜库结果进行比对打分, 筛选出高可信的变异肽段. Li 等人[24]在2011年基于人类癌症蛋白质变异数据库CanProVar [32]构建了一个MS-CanProVar 数据库, 此数据库中不仅包含了dbSNP 数据库中的编码的SNP 信息, 还包括了COSMIC [22]和OMIM [23]等数据库中与癌症相关的体细胞变异信息.除了自定义构建突变数据库以外, 氨基酸突变信息也被一些在线平台收录、整合, 如Swiss-Var [33],余庆等: 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法1116SysPIMP [34]和RAId_DbS [35]等. Swiss-Var 网站搜集的是Swiss-Prot 数据库[36]中突变肽段的信息, 主要为用户提供Swiss-Prot 数据库中的突变肽段信息及其与疾病间的关系. SysPIMP 主要用于鉴定与人类疾病有关的突变肽段序列, 它的数据主要来源于OMIM 数据库中等位基因突变信息、蛋白质突变数据库(protein mutation database, PMD)[37]以及Swiss-Prot 数据库中与人类疾病和多态性有关的序列信息. 而在RAId_DbS 数据库中不仅整合了SAVs 与疾病的信息, 同时也收录了PTMs 与疾病有关的信息.2012年, Mathivanan 等人[25]提出的iMASp 策略即是利用现有的突变信息对突变肽段进行鉴定. 这种策略利用了分步搜索的方法, 即是第一次通过常规搜索鉴定出样本中的常规蛋白, 第二次利用突变数据库对第一次没有鉴定出的质谱图进行搜索鉴定样品中的突变肽段. 相比穷举法, 结合已知氨基酸突变信息对突变氨基酸进行鉴定的方法虽然在一定程度上缩小了搜索空间, 但在数据库中添加的上万条突变肽段序列绝大部分不会在样品数据集中出现. 因此, 这种方法并没有十分有效地规避假阳性升高以及鉴定结果灵敏性降低的缺点[14].(3) 基于样本特异性的数据库鉴定突变肽段. 除了直接利用公共数据库中的突变数据外, 利用DNA/RNA 等信息提供的样本特异性突变构建的数据库能更好地贴合实际样本数据, 提高鉴定效率. 目前利用样本特异性鉴定突变肽段的方法有2种: 两次搜索数据库的方法以及利用转录组数据构建数据库的方法. 两次搜索数据库的方法与iMASp 策略中所使用的分步搜索以及Mascot 和X!Tandem 中的容错搜索相似, 不同的地方在于两次搜索数据库中所使用的突变数据库依赖于样本特异性的DAN/RAN 信息, 而iMASp 策略中的突变数据库是整合所有已知的蛋白突变信息, 不具有样本特异性; Mascot 和X!Tandem 则是对第一次搜索所得的蛋白序列进行穷举从而鉴定出突变或修饰肽段. Chernobrovkin 等人[38]提出的二次迭代法以及Su 等人[39]构建样本特异性突变数据库的策略都是样本特异性的两次搜索方法的代表.另一种方法是利用转录组数据构建样本特异性数据库用于突变肽段的鉴定. 相对于利用公共的突变数据库, 利用转录组数据构建蛋白质数据库可以由样品转录组数据直接推导样本中可能存在的蛋白及其突变序列并由其构建数据库[40]. 用此方法构建的数据库所包含的蛋白质信息更加接近样品中真实信息, 因此这种无偏性的数据库能高效地鉴定出样品中存在的突变序列[16,41]. 由于转录组数据十分庞大, 在现有的计算能力下要想利用转录组数据构建数据库就必须要对转录组数据进行压缩. 2007年, Edwards [16]提出了一个压缩表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据的策略, 实现了利用EST 数据库进行常规化的肽段序列和变异位点的鉴定. 此压缩策略的特点在于选用某种方法来表示肽段, 确保绝大多数的重复肽段序列被消除, 并且不影响肽段序列的鉴定. 随着下一代测序(next generation sequencing, NGS)技术的出现, RNA 测序(RNA- sequecing, RNA-Seq)的成本越来越低[14], 并且克服了EST 测序存在的克隆偏性和高花费等缺点[42], 因此利用RNA-Seq 数据构建样本特异性数据库逐渐受到人们的重视. Wang 等人[41]在2012年提出了一个利用RNA-Seq 数据构建样本特异性数据库的策略, 此策略通过两步来实现: (ⅰ) 利用一个经验性的RPKM (reads per kilo bases per million reads)值排除不表达或低表达基因以减小数据库中的条目; (ⅱ) 将由RNA-Seq 数据鉴定得来的高可靠性SNVs 的相应肽段添加到数据库中, 以寻找变异肽段. 此后, Wang 和Zhang [43]为生成自定义RNA-Seq 数据库编写了R 程序包customProDB, 能够生成含有突变、插入、缺失等变异肽段的RNA-Seq 数据库. 2013年, Sheynkman 等人[14]实践了Wang 和Zhang [43]的方法, 利用Jurkat 细胞系的RNA-Seq 数据构建一个自定义的变异蛋白质数据库, 并成功地应用在Jurkat 细胞系的质谱数据突变鉴定中. 同年, Woo 等人[44]在尽量不影响鉴定结果灵敏性的基础上, 将秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans )的RNA-Seq 数据压缩了近1000倍, 并利用此数据库成功地鉴定到了新型蛋白. 由于并不是所有的样本都同时拥有蛋白质数据和RNA-Seq 数据, 因此, Wang 和Zhang [43]利用64个大肠癌的RNA-Seq 数据构建了一致性蛋白质数据库, 并成功地将此数据库应用在蛋白鉴定中. 样本特异性的数据库, 特别是利用RNA-Seq 数据构建的样本数据库不仅能够有效地缩减搜索空间, 而且能够鉴定出样品中所有已知类型的蛋白种类以及新型的变异肽段序列. 随着计算方法的不断改进, 通过RNA-Seq 数据对样本进行突变肽段的鉴定方法有望成为常规的突变鉴定方法.中国科学: 生命科学 2014年 第44卷 第11期1117(4) 基于序列数据库搜索的氨基酸突变鉴定算法的缺点. 在鉴定突变肽段的方法中, 虽然通过构建含有突变信息的序列数据库鉴定突变肽段的方法是目前被最广泛采用的方法, 但它的缺点也是不容忽视的. (ⅰ) 除了利用穷举法构建的突变数据库以外, 利用其他方法构建的突变数据库对突变信息包含得都不够全面, 如公共数据库通常会有意忽略对变异数据的收录, 而样本特异性数据库为了减小搜索空间通常也会去除低表达的蛋白质; (ⅱ) 序列数据搜索中, 当图谱中的碎裂信息不够完整、信噪比较低时, 搜索引擎就不能将候选肽段正确地区分开[45], 因而会增加假阳性的概率. 为了避免序列数据库的上述缺点, 提出了其他鉴定突变肽段的方法, 如序列标签算法、图谱库搜索算法等.1.2 基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法 相比序列数据库搜索算法利用肽段母离子质量从数据库中筛选候选肽段, 序列标签算法利用de novo 测序算法推导的PSTs 能够更有效地过滤数据库, 减少候选肽段的数目以缩小搜索空间, 使得更复杂和计算更密集的方法能够应用到对候选肽段的突变打分算法中[45], 从而提高了突变鉴定结果的灵敏性并且减少了结果中的假阳性率. 下面从序列标签搜索算法与de novo 测序算法之间的关系以及当前结合PSTs 进行氨基酸突变鉴定的主流工具两个方面对序列标签算法鉴定突变氨基酸进行介绍.(1) 序列标签搜索算法与de novo 测序算法. 相比序列数据库搜索算法, de novo 算法在对质谱图进行氨基酸序列推导时不依赖蛋白质数据库, 因此它在鉴定氨基酸突变方面有独特的优势[45~47]. 当前使用de novo 测序算法的代表性工具有SHERENGA [48], PEAKS [49~51]以及PepNovo [52]等. 这些工具所使用的算法都是通过生成前缀残基质量图谱(prefix residue mass spectra)重构整个图谱进行肽段序列推导的, 因此这些算法对质谱图的质量具有较高的要求[45]. 但通过诱导碰撞解离(collision-induced dissociation, CID)产生的串联图谱中不可避免地含有不完整的碎裂离子系列、噪音离子和精度较差的碎裂离子质量, 这使得de novo 算法常常产生一些不确定的序列区域, 导致de novo 算法通常只能准确地推导出肽段序列中的部分序列[46]. 因此, 结合de novo 算法鉴定的部分肽段序列进行数据库搜索的序列标签算法应运而生, 这种算法不仅可以利用de novo 推导出的PSTs 作为筛选候选肽段时的过滤指标, 有效地减少搜索空间, 而且可以通过改变PSTs 与候选肽段匹配的打分算法, 提高对突变肽段的鉴定效率.(2) 结合肽序列标签的氨基酸突变鉴定算法. 最早结合PSTs 进行数据库搜索的方法是由Mann 和Wilm [53]在1994年提出的, 此方法不仅能有效地对常规图谱进行鉴定, 而且能够鉴定出带有突变或修饰图谱的肽段序列. 当前结合肽序列标签对氨基酸突变进行鉴定的算法或程序有GutenTag 程序[54], Opensea 工具[55], SPIDER 程序[56,57], InsPecT 搜索引 擎[45], DirecTag 算法[58]以及MoDa 算法[59]等. 鉴定突变氨基酸常用的序列标签软件及其网址见表3.GutenTag 是由Yates 实验室开发出来的能够自动推导+2电荷母离子串联图谱PSTs 用于数据库搜索的算法, 其特点是利用碎片离子峰强度经验模型并结合相邻氨基酸和碎片离子的相对质量对肽段碎裂的影响推导PSTs, 之后用多个PSTs 进行搜库, 同时放宽对PST 两端质量匹配的限制, 从而能够有效地进行突变肽段的鉴定. 但由于GutenTag 算法没有考虑同源突变或修饰, 所以此算法只能对数据库中已存在的突变序列进行鉴定, 并且由于在打分方面存在漏洞[55], 所以鉴定出来的结果中存在较高的假阳性.在GutenTag 算法发表后的第2年, Searle 等人[55]首次将序列标签算法的思想应用于非限制翻译后修饰, 并提出了基于质量的序列比对算法工具Opensea. Opensea 的特点是利用基于质量的宽度优先的算法(“breadth-first search” algorithm)鉴定出突变位点或修表3 鉴定氨基酸突变常用的序列标签软件及其下载地址软件名称 网址 参考文献GutenTag /downloads.php [54] SPIDER /peaks/features/spider.html [56,57]DirecTag+TagRecon+IDPicker ./software.php [47,58,60]InsPecT /Software.html [45]余庆等: 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法1118饰位点. 但宽度优先的算法是一种贪婪的匹配算法, 并且在Opensea 中没有考虑在一个位点上同时存在de novo 的测序错误和同源突变的情况, 所以它不能保证最终结果的可靠性. SPIDER 方法与Opensea 工具有相似的序列标签算法思想, 但与Opensea 不同的是, 它能够在一个位置上同时考虑de novo 的测序错误和同源突变的情况, 并且利用动态规划算法进行比对打分. SPIDER 算法已被整合进PEAKS 软件中, 专门用来对突变肽段和跨物种的同源性肽段进行鉴定.在GutenTag 算法推出后, Pevzner 实验室迅速推出了InsPecT 序列标签算法搜索引擎[45], 它是最早实现规模化鉴定翻译后修饰肽段的搜索工具, 现在仍然被广泛使用. InsPect 搜索引擎推导PSTs 的算法的特点在于利用改进的de novo 算法推导出PSTs 作为过滤器缩小候选肽段的范围, 并利用树状快速搜索方法(fast tree-based search)找出与PSTs 匹配的候选肽段, 用基于动态规划算法(dynamic programming)的图谱比对方法鉴定修饰肽段, 并在打分算法中考虑肽段的碎裂模式. 在推导PSTs 时, InsPecT 需要构建前缀残基质量图, 而DirecTag 算法则是直接利用串联图谱的质核比值和峰强度信息对可能的标签进行打分. 由于DirecTag 只能用来推导PSTs, 因此其团队后续开发了TagRecon 算法[47]并将DirecTag, TagRecon 和IDPicker 工具[60]整合成鉴定突变和修饰肽段的流程, 其大致过程为: (ⅰ) 利用DirecTag 生成PSTs; (ⅱ) TagRecon 利用PSTs 对常规数据库进行候选肽段过滤, 并且定位数据集中的突变或修饰肽段; (ⅲ) 利用IDPicker 工具对鉴定结果进行质量控制并且装配成蛋白. 此流程算法在2013年由Abraham 等人[19]在鉴定胡杨树(Populus )单氨基酸多态性的实验中被成功地使用.目前序列标签算法都依赖于de novo 测序构建PSTs, 但是由de novo 算法测出的肽片段往往存在部分构建错误的序列[56]. MoDa 算法[59]在搜索候选肽段时, 由于采用序列标签链算法(tag chain algorithm)[61], 能有效地避免由de novo 测序引起的错误匹配. 在MoDa 算法中, 将序列标签算法和动态规划算法结合, 同时利用多条序列标签与候选肽段进行比对, 找出存在质量差的位点, 然后利用基于动态规划算法的图谱比对算法找出最佳的肽段序列. 此方法能够大规模地鉴定出存在多个修饰位点或突变位点的肽段.(3) 基于序列标签的氨基酸突变鉴定算法面临的问题. 基于肽段序列标签的氨基酸突变序列鉴定算法虽然能够有效地利用PSTs 过滤数据库, 弥补de novo 测序算法的测序错误并且提高对突变或修饰肽段鉴定的效率和准确性, 但目前已有的PSTs 算法仍然存在着许多不足, 如在GutenTag 算法中没有考虑同源突变或修饰, 所以不能鉴定出数据库中不存在的突变序列, 而在Opensea 软件中没有考虑到突变位点的出现可能是由de novo 的测序错误引起的等. 但是图谱质量是限制序列标签算法的主要因素, 因为低能CID 碎裂模式通常很难将质量相同或相近的碎裂离子区分开来, 如亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)和谷氨酰胺(Gln)以及苯丙氨酸(Phe)和氧化的甲硫氨酸(Met)等[46]. 近年来, 随着电子转移解离(electron transfer dissociation, ETD)和高能碰撞解离(high-energy collision induced dissociation, HCD)的出现, 越来越多的比CID 质谱图质量高的、含有丰富的碎裂离子信息的高精度质谱图被产出, 这些高精度的质谱图能更好地适用于序列标签算法, 提高其准确性.1.3 基于图谱库搜索的氨基酸突变鉴定算法在肽段鉴定领域, 图谱库搜索是一种有望取代序列数据库搜索的鉴定策略[62]. 相比序列数据库搜索策略, 图谱库搜索策略有以下优点: (ⅰ) 直接利用图谱库中每一张真实图谱的各种不同的特征信息进行比对, 如碎片离子峰的峰强度信息、碎裂模式等, 使图谱比对算法具有更高的灵敏性; (ⅱ) 能够在一个更小、更精确的搜索空间内进行搜索, 可以比序列搜索速度快好几个数量级; (ⅲ) 能够轻松地鉴定出图谱库中已存在的变异肽段[63]. 对于依赖于图谱库搜索的蛋白突变鉴定来讲, 目前最大的限制来源于图谱库的覆盖范围, 尤其是对突变和修饰肽段图谱的包含[63,64]. 由于在相似的条件下, 肽段的图谱具有可再生性[65]并且相似序列的肽段通常能够产生相似的质谱图[20,66], 因此一批利用图谱库中已收录的肽段图谱来扩大图谱库对肽段的覆盖范围, 以实现对氨基酸突变进行鉴定的算法或工具应运而生. 目前常用的图谱搜索软件及其网址见表4.在蛋白质组学中, 图谱库搜索概念早在1998年就由Yates 等人[70]率先提出, 但由于质谱仪通量不高、生物质谱数据缺乏以及质谱数据的自动化分析。