流式细胞术培训优秀课件
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流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
流式原理培训ppt课件
直方图 ( Histogram ):
横坐标是散射光或荧光相对强弱，纵坐标代表细胞数
散点图： 每一个点代表一个细胞，横纵轴各代表一个参数
等高线图 ： 同一条线上的细胞数目相等，越靠里的曲线说明细胞数 目越多 密度图：点密度越大的地方，细胞数越多
三维图
小结 FSC/SSC/ FL 荧光抗体选择原则 对照设置（荧光补偿）
荧光信号
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，燃料吸收光子跃
迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，以光的形式释放。这
种发出的光成为荧光。
荧光通道
–散射光通道: FSC和SSC通道； –荧光通道 • 通道命名方式： –以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、
FL3等。
藻红蛋白
多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
荧光抗体的选择
根据流式细胞仪选择抗体
根据抗原表达强弱合理选择抗体
• 不同荧光素强度有所不同 • 高表达的抗原可不用太“亮”的荧光染料， “亮”的荧光染料分配给表达低的抗原
选择荧光波谱见光谱重叠小的染料进行组合，同时正确的调
散射光信号
FSC和 SSC 当颗粒通过聚焦光束时，激光向各个方向散射。与激光 束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂 直的称侧向角散射光信号（SSC）。
FSC：反应细胞大小和活力
SSC：反应细胞内部颗粒度和精细结构变化
FSC/SSC的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
同型对照
• 非特异性染色 – 抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； – 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。 – 实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; – 同型对照：相同剂量未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并 标记FITC。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
《流式细胞技术》PPT课件
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34
CBA(Cytometric Bead Array)
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35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
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作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
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淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
ppt课件
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
《流式细胞术的原理》PPT课件
光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕： 细胞相对大小及其外表积 侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射 光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称 为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在 激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发 态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记 胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂， 如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。 〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二.细胞分选原理
●高通量 ●高纯度：可达99.9% ●可分选极少含量的细胞 ●多种分选方式
FACSVantage Diva 的模拟四路分选。
四.实例与数据分析
（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测
• 成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞 • 染色：单克隆抗体标记
1）CD14存在于单核细胞表面。 荧光染料： Phycoerythrin（PE）
（5）各色荧光信号分离
激光束
侧向散射光， 荧光
细胞
二色反光镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤光片 光电倍增管
多通道（多参数）
另一个参数：时间—连续 过程的检测
多激光激发：多通道（多参数）—6杆激光，17个荧光通道
（6）更先进的光信号收集和分离方式
八角反射式 信号收集系统
提高的灵敏度— (二色反光镜)反射~透 射:95%~80%
（2）测量对象：颗粒尺度
（单细胞悬浮液）
当前流式细胞仪可测量颗粒大小 最小约0.2μm
电镜
光学 显微镜
人眼极限
0.1nm 1nm 10nm
100nm
1μm
10μm
100μm
1mm
原子氨基蛋白 病毒 支原体 细菌 酸质
红细胞 上皮细胞 植物细胞
（3）可测量的细胞参数
核酸分析： DNA、 RNA含量，DNA合 成、降解、断裂， 区分核酸单、双 链，测量端粒长 度、染色质结 构 、碱基构成。 染色单体分选。
（2）DNA含量检测
高精确性—以及极小的 仪器误差（CV）！
BD FASCalibur
• 质量控制：
变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。
Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。
（3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell）
(4)染色体核型
Hoechst 33258 AT
2
1
4
3
5 6 X 13 8
1/3
7 recip 9-22
Y 18 21 20
14 9-12
15 16 17
19 Ph 22
Chromomycin A3 GC
制备和设计流式样本
实验流程
制取单细胞悬浮液 荧光染色 上机检测
机械破碎，酶解消化，化 学解聚—去除碎步与团块
细胞吸收的荧光染料与其目 标分子含量成正比，荧光信 号强度与吸收的荧光染料分 子成正比
流式细胞术的功能特点与应用
一.流式细胞仪的功能特点
（1）流式细胞仪的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其他 粒子）以单个方式依次通过探测光束， 采集细胞被光照时产生的各种信号，然 后对信号进行处理，并能对多个参数进 行关联分析的一种仪器。
一.流式细胞仪的功能特点
（2）流式细胞仪与荧光显微镜类比
荧光显微镜 视野,静止,同时
流式细胞术培训
科技文献数量增长的一个简单统计
美国国立生物技术信息中心 / PUBMED 查询：检索关键词： flow cytometry 结果：
1980.1以前： 142 1980.1—1990.1: 9450 1990.1—2000.1: 33459. 2000.1—2005.1: 28850 2005.1—2009.4.15: 29495
流式细胞仪 单个,流动,依次
肉眼/CCD
PMT
多激发
同时多激发(激光)
（3）流式细胞仪的功能特点
多通道（多参数） 高通量 高灵敏度 定量 高精确度 细胞分选
二.流式细胞术的应用
（1） 几个著名的实际应用： ◇ HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数； ◇ 癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性； ◇ 器官移植： ◇ 动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子； ◇ 人类体外受精； ◇ 造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别； ◇ 海洋、环境微生物研究，发现未知种属。
仪器校准和优化
CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=粒细胞 (CD45<单核细胞)
前向散射光 (linear)
CD14 PE CD14 PE
一维图：直方图
对比：
双参数的二维图 能提供更多信息
细 胞
数
CD45 FITC CD45 FITC
细胞数
目录
• （一）.流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用
• （二）.流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析
• （三）.制备和设计流式样本 一.样本制备和实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项
• （四）.流式细胞术的新发展
细胞膜：表面糖分子、细 胞膜流动性和通透性、膜 融合和翻转、膜脂质构成、 细胞膜及线粒体膜电位 等。
、
细胞质：（1）Ca2+、 Na+、K+、H+ （2）信 号网络蛋白、各种抗 原、各类酶分子、细 胞骨架蛋白、荧光蛋 白（3）酶活、蛋白磷 酸化、乙酰化、甲基 化修饰等
无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等
2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。 （淋巴细胞>单核细胞>粒细胞） 荧光染料：fluorescein isothiocyanate (FITC).
• 信号收集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。 • 细胞数：10，000。
二维图：散点图
CD14 PE (log) 侧向散射光(linear)
二.荧光检测
（1）空间立体激发结构
三轴垂直：高 精确度—2%的 荧光差别
探测光路聚焦
（2）散射光信号的产生
前向散射光：大小 侧向散射光：颗粒度
（3）PMT：光信号到电脉冲信号
高灵敏度 —50MESF
FL-H FL-A
FL-W
面积（A）：荧光总量 高度（H）：最大荧光强度 宽度（W）：细胞直径
（4）光学镜片
• 经验性总结：细胞内几乎所有能够被荧 光染料标记的成分或某种变化都可以用 流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪原理简要
一.流体动力学聚焦
流动室
流体动力学聚焦
流速：10m/s 最大40m/s——高通量 20,000—200,000 cell/S
激光聚焦
流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞 被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精 确而稳定的轨道运动。