流式细胞术培训优秀课件

二.荧光检测
（1）空间立体激发结构
三轴垂直：高 精确度—2%的 荧光差别
探测光路聚焦
（2）散射光信号的产生
前向散射光：大小 侧向散射光：颗粒度
（3）PMT：光信号到电脉冲信号
高灵敏度 —50MESF
FL-H FL-A
FL-W
面积（A）：荧光总量 高度（H）：最大荧光强度 宽度（W）：细胞直径
（4）光学镜片
仪器校准和优化
目录
• （一）.流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用
• （二）.流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析
• （三）.制备和设计流式样本 一.样本制备和实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项
• （四）.流式细胞术的新发展
4
3
5 6 X 13 8
1/3
7 recip 9-22
Y 18 21 20
14 9-12
15 16 17
19 Ph 22
Chromomycin A3 GC
制备和设计流式样本
实验流程
制取单细胞悬浮液 荧光染色 上机检测
机械破碎，酶解消化，化 学解聚—去除碎步与团块
细胞吸收的荧光染料与其目 标分子含量成正比，荧光信 号强度与吸收的荧光染料分 子成正比
流式细胞术的功能特点与应用
一.流式细胞仪的功能特点
（1）流式细胞仪的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其他 粒子）以单个方式依次通过探测光束， 采集细胞被光照时产生的各种信号，然 后对信号进行处理，并能对多个参数进 行关联分析的一种仪器。
一.流式细胞仪的功能特点
（2）流式细胞仪与荧光显微镜类比
荧光显微镜 视野,静止,同时
2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。 （淋巴细胞>单核细胞>粒细胞） 荧光染料：fluorescein isothiocyanate (FITC).
• 信号收集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。 • 细胞数：10，000。
二维图：散点图
CD14 PE (log) 侧向散射光(linear)
流式细胞仪 单个,流动,依次
肉眼/CCD
PMT
多激发
同时多激发(激光)
（3）流式细胞仪的功能特点
多通道（多参数） 高通量 高灵敏度 定量 高精确度 细胞分选
二.流式细胞术的应用
（1） 几个著名的实际应用： ◇ HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数； ◇ 癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性； ◇ 器官移植：交叉配型； ◇ 分选人类染色体，建立遗传文库（genetic libraries）； ◇ 动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子； ◇ 人类体外受精； ◇ 造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别； ◇ 海洋、环境微生物研究，发现未知种属。
CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=粒细胞 (CD45<单核细胞)
前向散射光 (linear)
Hale Waihona Puke Baidu
CD14 PE CD14 PE
一维图：直方图
对比：
双参数的二维图 能提供更多信息
细 胞
数
CD45 FITC CD45 FITC
细胞数
细胞膜：表面糖分子、细 胞膜流动性和通透性、膜 融合和翻转、膜脂质构成、 细胞膜及线粒体膜电位 等。
、
细胞质：（1）Ca2+、 Na+、K+、H+ （2）信 号网络蛋白、各种抗 原、各类酶分子、细 胞骨架蛋白、荧光蛋 白（3）酶活、蛋白磷 酸化、乙酰化、甲基 化修饰等
无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等
流式细胞术培训
科技文献数量增长的一个简单统计
美国国立生物技术信息中心 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PUBMED 查询：检索关键词： flow cytometry 结果：
1980.1以前： 142 1980.1—1990.1: 9450 1990.1—2000.1: 33459. 2000.1—2005.1: 28850 2005.1—2009.4.15: 29495
• 经验性总结：细胞内几乎所有能够被荧 光染料标记的成分或某种变化都可以用 流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪原理简要
一.流体动力学聚焦
流动室
流体动力学聚焦
流速：10m/s 最大40m/s——高通量 20,000—200,000 cell/S
激光聚焦
流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞 被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精 确而稳定的轨道运动。
（2）DNA含量检测
高精确性—以及极小的 仪器误差（CV）！
BD FASCalibur
• 质量控制：
变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。
Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。
（3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell）
(4)染色体核型
Hoechst 33258 AT
2
1
（2）测量对象：颗粒尺度
（单细胞悬浮液）
当前流式细胞仪可测量颗粒大小 最小约0.2μm
电镜
光学 显微镜
人眼极限
0.1nm 1nm 10nm
100nm
1μm
10μm
100μm
1mm
原子氨基蛋白 病毒 支原体 细菌 酸质
红细胞 上皮细胞 植物细胞
（3）可测量的细胞参数
核酸分析： DNA、 RNA含量，DNA合 成、降解、断裂， 区分核酸单、双 链，测量端粒长 度、染色质结 构 、碱基构成。 染色单体分选。
二.细胞分选原理
●高通量 ●高纯度：可达99.9% ●可分选极少含量的细胞 ●多种分选方式
FACSVantage Diva 的模拟四路分选。
四.实例与数据分析
（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测
• 成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞 • 染色：单克隆抗体标记
1）CD14存在于单核细胞表面。 荧光染料： Phycoerythrin（PE）
（5）各色荧光信号分离
激光束
侧向散射光， 荧光
细胞
二色反光镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤光片 光电倍增管
多通道（多参数）
另一个参数：时间—连续 过程的检测
多激光激发：多通道（多参数）—6杆激光，17个荧光通道
（6）更先进的光信号收集和分离方式
八角反射式 信号收集系统
提高的灵敏度— (二色反光镜)反射~透 射:95%~80%