第四章-酶的提取与分离纯化汇总
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把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎
（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去
与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与
产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是 常数，用β表示，盐析方程式可改写为：
log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250
单层
肽聚糖 (40% ~ 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产 生两种现象：
1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
盐溶
盐析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
原因：
高盐 ：①与蛋白质分子争夺水
酶纯化的基本原则：
①建立一个方便灵敏的分析方法；
②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化 步骤；
③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避 免酶的变性。
第一节 细胞破碎
（一）细胞壁组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 Baidu Nhomakorabea成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
细菌
细菌
菌
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
⑴ 热变性
⑵ pH变性
⑶ 有机溶剂变性
举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：
收集
新鲜牛血 除血浆
离心
浮选
溶血
红细胞
干净红细胞
2％NaCl
去血红蛋白
溶血液 乙醇、氯仿
上清
分级沉淀 丙酮
热变性
沉淀物 70℃ SOD粗酶液
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终 饱和度不超过40％。
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法:搅拌;研磨 物理法：渗透压或温度突变 化学法：化学试剂改变细胞膜结构 生物法（酶解）：外加酶法或自溶法
第二节 酶的提取(extraction)
第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸复合沉淀法
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation)
1.原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点
2. 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点 相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如 盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有 一定的溶解度。
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
log S log S0 Ks I
I：离子强度 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。
②中和电荷
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同 盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白 质先后析出，称分段盐析。
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4
2) 调整盐浓度的方式
a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓 度又不太高时。
b. 添加固体硫酸铵
（四）复合沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性 沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎
（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去
与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与
产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是 常数，用β表示，盐析方程式可改写为：
log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250
单层
肽聚糖 (40% ~ 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产 生两种现象：
1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
盐溶
盐析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
原因：
高盐 ：①与蛋白质分子争夺水
酶纯化的基本原则：
①建立一个方便灵敏的分析方法；
②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化 步骤；
③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避 免酶的变性。
第一节 细胞破碎
（一）细胞壁组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 Baidu Nhomakorabea成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
细菌
细菌
菌
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
⑴ 热变性
⑵ pH变性
⑶ 有机溶剂变性
举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：
收集
新鲜牛血 除血浆
离心
浮选
溶血
红细胞
干净红细胞
2％NaCl
去血红蛋白
溶血液 乙醇、氯仿
上清
分级沉淀 丙酮
热变性
沉淀物 70℃ SOD粗酶液
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终 饱和度不超过40％。
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法:搅拌;研磨 物理法：渗透压或温度突变 化学法：化学试剂改变细胞膜结构 生物法（酶解）：外加酶法或自溶法
第二节 酶的提取(extraction)
第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸复合沉淀法
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation)
1.原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点
2. 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点 相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如 盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有 一定的溶解度。
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
log S log S0 Ks I
I：离子强度 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。
②中和电荷
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同 盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白 质先后析出，称分段盐析。
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4
2) 调整盐浓度的方式
a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓 度又不太高时。
b. 添加固体硫酸铵
（四）复合沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性 沉淀而不影响所需蛋白质的方法。