第八章_反胶团萃取
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生化工程下游技术知识课件第八章反胶团萃取
反胶团萃取技术与其他分离技术的结合使用可以进一步提高分离效果和降低成本。
对生化工程的贡献
反胶团萃取技术的出现为生化工 程领域提供了一种新的分离纯化 手段，有助于提高产品的质量和
产量。
反胶团萃取技术可以应用于生物 医药、食品加工、环境保护等领 域，有助于推动相关产业的发展。
反胶团萃取技术还有助于促进生 化工程与其他学科的交叉融合，
反胶团萃取技术可用于细胞分离，根据细胞的不同性质实现细胞的分离和纯化。
细胞破碎
反胶团萃取也可用于细胞破碎，通过破坏细胞膜释放细胞内的内容物，用于下游 提取和纯化过程。
04 反胶团萃取的挑战与前景
反胶团萃取技术的局限性
适用范围有限
目前反胶团萃取技术主要适用于生物大分子物质的分离，对于小 分子物质的分离效果不佳。
促进相关领域发展
反胶团萃取技术的广泛应用将促进相关领域的发展，如生物制品的 分离纯化、药物制备等。
推动科技进步
反胶团萃取技术的发展将推动科技进步，为其他领域的技术创新提供 借鉴和启示。
05 结论
总结
反胶团萃取是一种有效的生化分离技术，具有高选择性、高回收率和低能耗等优点。
反胶团萃取在蛋白质、酶和其他生物分子的分离纯化方面具有广泛的应用前景。
推动学科发展。
对未来的影响
随着反胶团萃取技术的不断发展和完 善，其应用范围和应用领域将进一步 扩大。
反胶团萃取技术的深入研究将有助于 推动生化工程领域的技术创新和产业 升级，为人类社会的可持续发展做出 贡献。
反胶团萃取技术与其他技术的结合使 用将有助于解决一些传统分离方法难 以解决的问题，提高分离效果和降低 成本。
优化操作条件
通过实验研究，优化反胶 团萃取的操作条件，降低 对设备的要求，提高技术 的可操作性。
第八章---反胶束萃取
第二节 反胶团的形成
但即使当W值很大时，水池内水 的理化性质也不能与正常的水完全 相同，特别是在接近表面活性剂亲 水头的区域内。 见图8-3。
第二节 反胶团的形成
当蛋白质分子与反胶团直径相比大 得多时(例如，当相对分子质量超过 100－200kD)，难于溶解到反胶团中。 当反胶团的含水率W较低时，反胶 团水池内水的理化性质与正常水相 差悬殊。
中，用得最多的是阴离子表面活 性 剂 AOT(AerosolOT) ， 其 化 学 名为丁二酸－2－乙基己基磺酸 钠，结构式见图。
第二节 反胶团的形成
第二节 反胶团的形成
这种表面活性剂容易获得，其特 点是具有双链，极性基团较小、形 成反胶束时不需加助表面活性剂， 并且所形成的反胶束较大，半径为 170nm，有利于大分子蛋白质进入。
第二节 反胶团的形成
二、表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的
必要条件。 1、表面活性剂的组成
表面活性剂是由亲水憎油的极 性基团和亲油憎水的非极性基团两 部分组成的两性分子。
第二节 反胶团的形成
2、表面活性剂的种类 （1）阴离子表面活性剂； （2）阳离子表面活性剂； （3）非离子型表面活性剂。
第二节 反胶团的形成
与在水相中不同的是，非极 性溶剂内形成的表面活性剂聚集 体，其疏水性的非极性尾部向外， 指向非极性溶剂，而极性头向内， 与在水相中形成的微胶团方向相 反，因而称之为反胶团或反向胶 团
第二节 反胶团的形成
图 8-1 是 几 种 可 能 的 表 面 活 性 剂 聚 集体的微观构造。在反胶团中有一 个极性核心，。它包括由表面活性 剂极性端组成的内表面、平衡离子 和水。此极性核具有溶解极性物质 的能力，极性核溶解水后，就形成 了“水池”(water pool) 。
生物工程下游技术_第8章_反胶团萃取
反胶团溶液形成的条件和特性
3. 胶团、反胶团的形成
将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓 度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起 而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶 液中的胶束，称为胶团。 若将表面活性剂溶于 非极性的有机溶剂中， 并使其浓度超过临界胶 束浓度(CMC)，便会在 有机溶剂内形成聚集体， 这种聚集体称为反胶团。
反胶团溶液形成的条件和特性
4. 反胶团的制备
①注入法 ②相转移法 ③溶解法 5. 反胶团的含水率
W=C水/C表面活性剂
反胶束萃取蛋白质的基本原理
反胶团的溶解作用
由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白 质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。 因此反胶团萃取特别蛋适合白质类生物大分子。
基本概念
何谓胶团、反胶团 • 反胶团是指当油相中 表面活性剂的浓度超 过临界胶束浓度后,其 分子在非极性溶剂中 自发形成的亲水基向 内、疏水基向外的具 有极性内核(polarcore) 的多分子聚集体
基本概念
反胶团萃取
• 反胶团是表面活性剂分子溶 于非极性溶剂中自发形成的 聚集体 ,其中表面活性剂的 极性头朝内而非极性头朝外 与有机溶剂接触。胶团内可 溶解少量水而形成微型水池， 蛋白质进入微水持中，可随 反胶团转入有机溶剂，但不 与有机溶剂直接接触，反胶 团萃取就是利用这一特性进 行蛋白质分离的方法，反胶 团溶液是宏观上透明均一的 热力学稳定体系。
a
b
c
d
反胶团的溶解作用
反胶束萃取蛋白质的基本原理
影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机 溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 , 同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形 ,接着 两界面形成含有蛋白质的反胶团 ,然后扩散到有 机相中 ,从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条 件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) ,又可使蛋白 质从有机相中返回到水相中 ,实现反萃取过程。
反胶团萃取
静电相互作用： 反胶团萃取一般采用离子型表面活性剂制备反胶团相，其中 应用最多的是阴离子型表面活性剂AOT，阳离子型表面活性剂主 要有氯化三辛基甲铵和溴化十六烃基三甲胺等季铵盐。这些表面 活性剂所形成的反胶团内表面带有负电荷或正电荷。因此，当水 相pH值偏离蛋白质等两性电解质的等电点时，由于溶质带正电荷 (pH<pI)或负电荷(pH>pI)，与表面活性别发性强烈的静电相互作 用，影响溶质在反胶团相的溶解率，即在两相间的分配系数。理 论上，当溶质所带电荷与表面活性剂相反时，由于静电引力的作 用，溶质易溶于反胶团，溶解率或分配系数较大，反之，则不能 溶解到反胶团相中。
(2)反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水相中相似， 活性与pH的关系同样表现为钟状曲线。
3、反胶团溶解作用的推动力
生物分子溶解于AOT等离子型表面活性剂反胶团相的
主物分子间的空间相互作用；
3、疏水性相互作用。 这些因素对生物分子的溶解率(萃取率)都有重要影 响，其中静电相互作用是最主要的。
经验式推算：
式中右侧第一项为反胶团的水核直径，第二项 (2.4nm)为AOT分子长度的二倍。一般反胶团的W0不超过 40。因此，根据上式，利用AOT形成的反胶团水核直径 一般不超过12nm，可大致容纳一个直径为5—10nm的蛋 白质。当蛋白质分子与反胶团直径相比大得多时，则难 溶解于反胶团中。
2、反胶团的溶解作用
4、萃取及反萃取动力学
水相中的溶质加入反胶团相需经历三步传质过程： 通过表面液膜扩散从水相到达相界面； 在界面处溶质进入反胶团中； 含有溶质的反胶团扩散进入有机相。
反萃取操作中溶质亦经历相似的过程，只是方 向相反，在界面处溶质从反胶团内释放出来。
F:\临时\反胶团萃取.pdf
反胶团萃取
反胶团萃取1．研究背景传统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用。
但很难用于具有某些特殊性质的生化产品(如蛋白质、氨基酸等)的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。
20世纪80年代中期发展起来的反胶团萃取技术解决了这一难题。
所谓反胶团，是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)。
反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核中形成“水池”(water poo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质。
胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离生物物质的目的。
这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了巨大的应用潜力。
[1]2．文献综述2.1反胶团的形成[2]正向胶团(normal micelle)是表面活性剂分子在极性溶剂，如水中形成的一种亲水基团(头)朝外，而疏水基团(尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。
洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团，其非极性内棱可以溶解各种油污。
从而达到去污的效果。
与此相反，表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)，由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反，因此，称为反胶团。
示意图如图（2－1）。
图2－1 表面活性荆分子在非极性溶荆中形成的反胶目反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
反胶团萃取
反胶团萃取原理与过程
反胶团萃取原理与过程
关于反胶团溶解蛋白质的形式，目前有四种模型：
a、水壳模型：蛋白质 位于水池的中心，周围 存在的水层将其与反胶 团壁隔开；
反胶团萃取原理与过程
b、半岛模型：蛋白质 表面存在强烈疏水区， 该区直接与有机相接触；
c、蛋白质吸附于反胶 团内壁；
d、蛋白质疏水区与几 个反胶团的疏水尾发生 相互作用，被几个小反 胶团所“溶解”。
对于包含大蛋白分子的反胶团，其尺寸远大于“空核” 的反胶团，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只 能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作用 来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达到增强静电 作用的一条途径。
影响反胶团萃取蛋白质的主要因素
（2）离子强度对萃取率的影响
离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用 所决定的：
胶团与反胶团的形成
（3）溶解法：用反胶团溶
液与固体蛋白质粉末一起 搅拌使蛋白质进入反胶团。 该法所需时间较长，适用 于水不溶性蛋白质。 说明反胶团“水池”中的 水与普通水的性质有区别。
反胶团萃取原理与过程
反胶团萃取原理：
从宏观上看反胶团萃取，是有机相－水相间的分配萃 取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。 微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中的反胶 团微水相中的分配萃取。
（3）表面活性剂类型的影响
选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间 的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂。 （4）表面活性剂浓度的影响 增大表面活性剂的浓度可增加反胶团的数量，从而增大 对蛋白质的溶解能力。
影响反胶团萃取蛋白质的主要因素
（5）离子种类对萃取的影响
通常反胶团中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，极性基团的 电离程度愈大，反胶团内表面的电荷密度愈大，产生的反胶团也愈 大。
反胶团萃取
反胶团萃取原理
萃取过程： ① 蛋白质从水溶液主 体扩散到界面； ② 在界面形成包容蛋 白质的反胶团； ③ 含有蛋白质的反胶 束在有机相中扩散离 开界面。
二、蛋白质的溶解
反胶团溶解蛋白质的四种可能模型：
a 水壳模型
b
c
d
水壳模型
对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型。
许多实验数据均间接地证明了水壳模型的正确性:
随着Mr的增加，蛋白质分 子和胶团之间的立体性相 互作用增加，萃取率有下 降趋势。
蛋白质的Mr与(pH-pI)绝对 值呈线性关系
（2）添加无机盐的影响
添加无机盐会增加 溶液的离子强度， 能使静电性相互作 用变弱，一般情况 下萃取率下降。
添加无机盐的影响
无机盐对有机溶剂有脱水作用，反胶团的W减小， 使立体性相互排斥作用增大。
反胶团在许多方面的研究都很活跃
作为生物膜的简化模型；
作为显示酶类性质的一种模型进行基础性研究；
作为具有新型功能的疏水性反应场；
作为酶和微生物的一种新型的固定化方法；
作为微小型的生物反应器； 作为生理活性物质及生物活性大分子的特异性分 离场而进行的应用性研究。
反胶团萃取的优点
大多数CMC在0.1～1.0 mmol/L的范围内。
（2）反胶团含水率W
含水率(W)：指水和表面活性剂的浓度之比。
W = c水/c表
W对反胶团的大小以及反胶团内微水相的物理 化学性质影响很大。 W越大，反胶团的半径越大。
反胶团含水率W
反胶团“水池”中的水与普通的水在性质上有差异。 如，AOT反胶团
第八章反胶团萃取
在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要 6～8个水分子，而其他水分子则不受束缚， 可与普通水一样自由流动，所以当W＞16 时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度， 胶团内也形成双电层。
胶团变化示意图
反胶团的制备
1.液液接触法
即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的
有机相接触。
2.注入法
将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有
影响液膜萃取的操作参数
pH:对弱电解质，pH将影响其荷电形式
及不同电荷形式溶质的分率，从而影响 萃取率。
速度：对于支撑液膜，料液流速引起流
体力学的特性改变直接影响萃取率；对 于乳状液膜，搅拌速度影响乳化液的分 散和液膜的稳定性。
共存杂质
流动载体为离子交换萃取剂时，料液中 如果存在与目标分子带相同电荷的杂质时，由 于杂质的竞争会减小用于目标分子和供能离子 输送的载体量，引起目标分子通透性的下降。
反胶束萃取的原理： 疏
静电引力：主要是蛋白质的表面电荷
与反胶束内表面电荷（离子型表面活 性剂）之间的静电引力作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的 尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的 传质阻力。
反胶束萃取的原理：
凡是能够引起静电引力，能够促使反
胶束尺寸增大的因素均有利于提高分 配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面 活性剂种类和浓度等，通过因素优化， 实现选择性地萃取和反萃取。
液膜 料液 (W/O)/W型乳液液膜
②支撑液膜
支撑液膜是将固体膜浸在膜
溶剂(如有机溶剂中)使膜溶剂 液膜 充满膜的孔隙形成液膜。 支撑液膜分隔料液相和反萃 反 料 相,实现渗透溶质的选择性萃取。 萃 液 相 当液膜为油相时，常用的多 孔膜为聚四氟乙烯、聚乙烯和 聚丙烯等高疏水性膜。 与乳状液膜相比，支撑液膜 支撑液膜 结构简单，放大容易。
第八章反胶团萃取案例
水相的pH值 盐离子的种类和浓度 温度 蛋白质的分子量和浓度 表面活性剂
①水相的 pH值
pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表 面电荷上。 在 pH小于蛋白质的等电点(pI)时 ,蛋白质表 面带正电荷 ;大于等电点时 ,蛋白质带负电荷。 AOT是一种阴离子型表面活性剂 ,它所形成 的反胶团的内表面带负电荷。 当水溶液的 pH小于蛋白质的等电点时,两表 面异电荷的吸引力使蛋白质的萃取率接近 1 0 0 %。当pH大于pI时,溶菌酶萃取率急剧 下降,直到接近于零 。
溶解推动力
①静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活 性剂相反时,由于静电引力的作用, 溶质易溶于反胶团,溶解率或分配 系数较大,反之,则不能溶解到反胶 团相中
左图为pH值对不同蛋白质的溶解 率急剧变化,当pH＜pI ,即在带正 电荷的pH范围内蛋白质的溶解率 接近100%,说明静电相互作用对蛋 白质的反胶团萃取起决定性作用。
（2）反胶团的制备
① 注入法
② 相转移法
③ 溶解法
三、 生理活性物质的分离农缩
1、反胶团萃取原理
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂 相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 ,同邻近 的蛋白质分子发生静电吸引而变形 ,接着两界面形 成含有蛋白质的反胶团 ,然后扩散到有机相中 ,从 而实现了蛋白质的萃取。(可能机理） 改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) , 又可使蛋白质从有机相中返回到水相中 ,实现反萃 取过程。
用 AOT反胶团体系萃取血红蛋白时发现 , 蛋白质浓度高时,萃取率降低;而蛋白质浓 度低时,萃取率较高。
⑥表面活性剂
表面活性剂的类型 目前最常用的反胶团或微乳液是 AOT/异辛烷 体系。一是AOT形成的反胶团较大 ,有利于蛋 白质的萃取 ;二是AOT形成反胶团时不需加助 表面活性剂。 表面活性剂的浓度 当其它条件一定时 ,表面活性剂浓度也存在某 临界值。小于此临界值时 ,增大表面活性剂的 浓度可提高蛋白质的萃取率 ,大于临界值时 , 则无明显影响
①水相的 pH值
pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表 面电荷上。 在 pH小于蛋白质的等电点(pI)时 ,蛋白质表 面带正电荷 ;大于等电点时 ,蛋白质带负电荷。 AOT是一种阴离子型表面活性剂 ,它所形成 的反胶团的内表面带负电荷。 当水溶液的 pH小于蛋白质的等电点时,两表 面异电荷的吸引力使蛋白质的萃取率接近 1 0 0 %。当pH大于pI时,溶菌酶萃取率急剧 下降,直到接近于零 。
溶解推动力
①静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活 性剂相反时,由于静电引力的作用, 溶质易溶于反胶团,溶解率或分配 系数较大,反之,则不能溶解到反胶 团相中
左图为pH值对不同蛋白质的溶解 率急剧变化,当pH＜pI ,即在带正 电荷的pH范围内蛋白质的溶解率 接近100%,说明静电相互作用对蛋 白质的反胶团萃取起决定性作用。
（2）反胶团的制备
① 注入法
② 相转移法
③ 溶解法
三、 生理活性物质的分离农缩
1、反胶团萃取原理
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂 相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 ,同邻近 的蛋白质分子发生静电吸引而变形 ,接着两界面形 成含有蛋白质的反胶团 ,然后扩散到有机相中 ,从 而实现了蛋白质的萃取。(可能机理） 改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) , 又可使蛋白质从有机相中返回到水相中 ,实现反萃 取过程。
用 AOT反胶团体系萃取血红蛋白时发现 , 蛋白质浓度高时,萃取率降低;而蛋白质浓 度低时,萃取率较高。
⑥表面活性剂
表面活性剂的类型 目前最常用的反胶团或微乳液是 AOT/异辛烷 体系。一是AOT形成的反胶团较大 ,有利于蛋 白质的萃取 ;二是AOT形成反胶团时不需加助 表面活性剂。 表面活性剂的浓度 当其它条件一定时 ,表面活性剂浓度也存在某 临界值。小于此临界值时 ,增大表面活性剂的 浓度可提高蛋白质的萃取率 ,大于临界值时 , 则无明显影响
第八章反胶团萃取
反胶团萃取的工艺过程
前萃取 将目的蛋白质有选择性地从发酵液中转
移到反胶团溶液中。 后萃取 再用第二种水相溶液从反胶团中将该蛋
白质萃取出来。
影响反胶团萃取的因素
溶液的pH 溶液的离子强度 表面活性剂的浓度和种类 其他（有机溶剂、助表面活性剂、温
度）
反胶团萃取的应用
纯化和分离蛋白质、氨基酸、酶、多 肽等
迅速失活的问题； ④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接
从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； ⑤成本低，溶剂可反复使用等。
反胶团的形成
反胶团的构造
当向水溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的 浓度超过一定的数值时，形成正胶团。当向非极性 溶剂中加入一定量的表面活性剂时，会形成反胶团 或反向胶团。
蛋白质溶解方式示意图
反胶团萃取蛋白质的基本原理
是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反 胶团微水相中的分配萃取。
同时也是一个 浓缩操作。
改变水相条件 可实现反萃取。
反胶团萃取蛋白质的示意图
“水壳”模型（water-shell mode））
蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池 中的溶解，如图所示的四种可能。
液膜的种类
液膜根据其结构可分为多种，但具 体有实际应用价值的主要有三种：
①乳状液膜 ②支撑液膜 ③流动液膜
液膜萃取
定义
液膜是由水溶液或有机溶剂构 成的液体薄膜。利用液膜将与之不能 互溶的液体分隔开来，使其中一侧的 液体中的溶质选择性的透过液膜进入 另一侧，实现溶质之间的分离。
液膜萃取机理
单纯迁移
液膜：通常是由溶剂、表面活性剂
和添加剂制成的。溶剂构成膜基体； 表面活性剂起乳化作用，可以促进 液膜传质速度并提高其选择性；添 加剂用于控制膜的稳定性和渗透性。
第八章反胶团萃取资料
影响反胶团萃取生物分子, 尤其是极性 , 对反胶团的 形成和大小都有影响 , 常用的溶剂有 : 烷烃 类 ( 正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷、正 十二烷等 ) 、四氯化碳、氯仿等等。有时也 用添加助溶剂 , 如醇类 ( 正丁醇等 ) 来调节 溶剂体系的极性 , 改变反胶团的大小 , 增加 蛋白质的溶解度。
2
影响反胶团萃取生物分子的主要因素
3
助表面活性剂的影响 蛋白质的相对分子质量往往很大 , 超过 几万至几十万 , 使表面活性剂形成的反胶团 的大小不足以包容大的蛋白质 , 而无法实现 萃取。此时 , 加入一些非离子表面活性剂 , 使它们插入反胶团的结构中 , 就可以增大反 胶团的尺寸 , 溶解较大相对分子质量的蛋白 质。
反胶团的构造
当向非极性溶剂中加入表面活性剂时， 如表面活性剂的浓度超过一定的数值时， 在非极性溶剂中表面活性剂聚集成团，其 疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶 剂，而极性头向内，与在水相中行成的微 胶团方向相反，因而称为反胶团。
反胶团体系的分类
1、 单一表面活性剂反胶团体系 研究得最多的是阴离子型ＡＯＴ , 该体系结构简单和稳定 , 反胶团体积相对较大 , 适用于等电点较高的较小相对分子质 量蛋白质的分离 , 其次有ＤＯＬＰＡ ( 二油基磷酸 ) 。另一类 是阳离子表面活性剂 , 如ＣＴＡＢ(溴代十六烷基三甲铵) , Ｔ ＯＭＡＣ（氯化三辛基甲铵） , ＤＡＰ ( 十二烷基丙酸铵 ), Ｄ ＤＡＢ ( 二十二烷基二甲基溴化铵 ) 等。该体系适用于等电点 较低的较大相对分子质量蛋白质的分离。而非离子型表面活 性剂能构成更大的反胶团 , 但这类体系容易乳化。一般在使用 时无须加入助剂的表面活性剂具有多条中等长度的烷基尾和 一个较小的极性头 , 如ＡＯＴ , ＤＤＡＢ有二条疏水尾 , 而Ｔ ＯＭＡＣ有三条疏水尾。
生物分离工程-反胶团萃取
选择的原则： A: 有利于增强蛋白质和反胶束间的静电作用 B: 有利于增加反胶束的大小
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表 面活性剂AOT(Aerosol 0T)化学名为丁二酸—2—乙基己 基酯磺酸钠
（2）表面活性剂浓度的影响
增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增 大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高，会在 溶液中形成复杂的聚集体，增加反萃取的难度。应选择 一个最适的浓度。
（3）离子强度增强时，增大了离子向反胶束内“水池”的
迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被
盐析出来；
4，离子种类对萃取的影响
阳离子的种类如Mg2+，Na+，Ca2+，K+对萃取率 的影响主要体现在改变反胶束内表面的电荷密度上。 通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离 的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相 反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶束 内表面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。
dm0.3 W 02.4 (n)m
一般 W0 40， dm 12，可容纳一个直径为5~10 nm的蛋白质。当相对分子量大于100~200kD，难 于溶解在反胶团中。
反胶团的含水率W0与反胶团特性的关系： 以AOT为例： W06 ~ 8时，反胶团内微水相的水分子受表面活 性剂亲水基团的强烈束缚，表观黏度上升50倍， 疏水性也极高；
5 反胶束萃取用于蛋白质复性
反胶束萃取的一个非常吸引人的应用是使蛋白质复性。 重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中， 使它们从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过 程通常要在非常稀的溶液下操作，以避免部分复性中间 体的凝聚。有人用AOT／异辛烷反胶束溶液萃取变性的核 糖核酸酶，将负载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸 胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活 性完全恢复，最后由反萃液回收复性的、完全具有活性 的核糖核酸酶，总收率达到了50％。
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表 面活性剂AOT(Aerosol 0T)化学名为丁二酸—2—乙基己 基酯磺酸钠
（2）表面活性剂浓度的影响
增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增 大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高，会在 溶液中形成复杂的聚集体，增加反萃取的难度。应选择 一个最适的浓度。
（3）离子强度增强时，增大了离子向反胶束内“水池”的
迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被
盐析出来；
4，离子种类对萃取的影响
阳离子的种类如Mg2+，Na+，Ca2+，K+对萃取率 的影响主要体现在改变反胶束内表面的电荷密度上。 通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离 的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相 反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶束 内表面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。
dm0.3 W 02.4 (n)m
一般 W0 40， dm 12，可容纳一个直径为5~10 nm的蛋白质。当相对分子量大于100~200kD，难 于溶解在反胶团中。
反胶团的含水率W0与反胶团特性的关系： 以AOT为例： W06 ~ 8时，反胶团内微水相的水分子受表面活 性剂亲水基团的强烈束缚，表观黏度上升50倍， 疏水性也极高；
5 反胶束萃取用于蛋白质复性
反胶束萃取的一个非常吸引人的应用是使蛋白质复性。 重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中， 使它们从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过 程通常要在非常稀的溶液下操作，以避免部分复性中间 体的凝聚。有人用AOT／异辛烷反胶束溶液萃取变性的核 糖核酸酶，将负载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸 胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活 性完全恢复，最后由反萃液回收复性的、完全具有活性 的核糖核酸酶，总收率达到了50％。
反胶团萃取
• 反胶团“水池”的物理性能(大小、形状 等)及其中水的活度是可以用Wo的变化来调 节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶 或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是 所谓的位阻效应。
• 许多反胶团萃取的实验研究已经表明， 随着Wo的降低，反胶团直径减小，空间位 阻作用增大．蛋白质的萃取率也减少。
空间位阻效应也体现在蛋白质分子大小对 分配系数的影响上。在各种蛋白质等电点 处的反胶团萃取实验研究表明，随着蛋白 质分于量的增大，蛋白质的分配系数(溶解 率)下降。当相对分子质量超 表面活性剂分子的聚集使反胶团内形成极性核， 反胶团内溶解的水通常称为微水相或“水池”。 由于反胶团内存在“水池”，故可溶解氨基酸、 肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供适宜存 在的亲水微环境。
因此，“水池”的物理化学性质直接影响到反 胶团萃取的适用范围和效率。
• 当反胶团的含水率较低时，反胶团“水池” 内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，
2.5 Wo值
• 表征胶团大小较好的参数是Wo——水与 表面活性剂的摩尔比。用非极性溶剂中的 水浓度和表面活性剂浓度之比来表示:
Wo=[H20] / [表面活性剂]
Wo值的物理意义
• Wo值越大，反相微胶团内的水分含 量就越多，形成的反相微胶团的半径 就越大。能溶解水溶性成分的量就越 多。
• 因此，Wo值大小可以反映出反相微 胶团的大小和溶解能力。
反胶团的突出优点
• (1)有很高的萃取率和反萃取率并具 有选择性;
• (2)分离、浓缩可同时进行，过程简 便;
• (3)能解决蛋白质 (如胞内酶)在非细 胞环境中迅速失活的问题;
• (4)由于构成反胶团的表面活性剂往 往具有细胞破壁功效，因而可直接从完 整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶;
• 许多反胶团萃取的实验研究已经表明， 随着Wo的降低，反胶团直径减小，空间位 阻作用增大．蛋白质的萃取率也减少。
空间位阻效应也体现在蛋白质分子大小对 分配系数的影响上。在各种蛋白质等电点 处的反胶团萃取实验研究表明，随着蛋白 质分于量的增大，蛋白质的分配系数(溶解 率)下降。当相对分子质量超 表面活性剂分子的聚集使反胶团内形成极性核， 反胶团内溶解的水通常称为微水相或“水池”。 由于反胶团内存在“水池”，故可溶解氨基酸、 肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供适宜存 在的亲水微环境。
因此，“水池”的物理化学性质直接影响到反 胶团萃取的适用范围和效率。
• 当反胶团的含水率较低时，反胶团“水池” 内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，
2.5 Wo值
• 表征胶团大小较好的参数是Wo——水与 表面活性剂的摩尔比。用非极性溶剂中的 水浓度和表面活性剂浓度之比来表示:
Wo=[H20] / [表面活性剂]
Wo值的物理意义
• Wo值越大，反相微胶团内的水分含 量就越多，形成的反相微胶团的半径 就越大。能溶解水溶性成分的量就越 多。
• 因此，Wo值大小可以反映出反相微 胶团的大小和溶解能力。
反胶团的突出优点
• (1)有很高的萃取率和反萃取率并具 有选择性;
• (2)分离、浓缩可同时进行，过程简 便;
• (3)能解决蛋白质 (如胞内酶)在非细 胞环境中迅速失活的问题;
• (4)由于构成反胶团的表面活性剂往 往具有细胞破壁功效，因而可直接从完 整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶;
反胶团萃取
① 易于放大。Albertson证明分配系数仅与分离体积 有关,各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低, 这是 其他过程无法比拟的。这一点对于工业应用尤为有利。
② 分离迅速。双水相系统(特别是聚合物/无机盐系 统)分相时间短,传质过程和平衡过程速度均很快,因此相对 于某些分离过程来说,能耗较低,而且可以实现快速分离。
③ 条件温和。由于双水相的界面张力大大低于有机 溶剂与水相之间的界面张力,整个操作过程可以在室温下 进行,因而有助于保持生物活性和强化相际传质。既可以 直接在双水相系统中进行生物转化以消除产物抑制,又有 利于实现反应与分离技术的耦合。
④ 步骤简便。大量液体杂质能够与所有固体物质同 时除去,与其他常用的固液分离方法相比,双水相分配技术 可以省去1~2个分离步骤,使整个分离过程更为经济。
初期的双水相萃取过程仍以间歇操作为主。 近年来,在天冬酶、乳酸脱氢酶、富马酸酶与青霉 素酰化酶等多种产品的双水相萃取过程中均采用 了连续操作,有的还实现了计算机过程控制。这不 仅对提高生产能力,实现全过程连续操作和自动控 制,保证得到高活性和质量均一的产品具有重要意 义, 而且也标志着双水相萃取技术在工业生产的 应用正日趋成熟和完善。
1、吸附原理和吸附剂
(1)、吸附原理
吸附剂固体之所以能够吸附流体分子,是因为固体表 面上的质点处于力场不平衡状态, 固体表面具有过剩的能 即表面能,当固体与流体分子接触时,被吸附物质与固体之 间由于某种吸附力的作用使固体与流体混合物中的某些 组分产生吸附,从而降低了表面能。吸附过程所放出的热 量,称为该物质在固体表面的吸附热。
(3)、在生物转化、化学渗透释放和电泳等中引入双 水相分配,给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的 诞生提供了新的思路。
二、吸附
② 分离迅速。双水相系统(特别是聚合物/无机盐系 统)分相时间短,传质过程和平衡过程速度均很快,因此相对 于某些分离过程来说,能耗较低,而且可以实现快速分离。
③ 条件温和。由于双水相的界面张力大大低于有机 溶剂与水相之间的界面张力,整个操作过程可以在室温下 进行,因而有助于保持生物活性和强化相际传质。既可以 直接在双水相系统中进行生物转化以消除产物抑制,又有 利于实现反应与分离技术的耦合。
④ 步骤简便。大量液体杂质能够与所有固体物质同 时除去,与其他常用的固液分离方法相比,双水相分配技术 可以省去1~2个分离步骤,使整个分离过程更为经济。
初期的双水相萃取过程仍以间歇操作为主。 近年来,在天冬酶、乳酸脱氢酶、富马酸酶与青霉 素酰化酶等多种产品的双水相萃取过程中均采用 了连续操作,有的还实现了计算机过程控制。这不 仅对提高生产能力,实现全过程连续操作和自动控 制,保证得到高活性和质量均一的产品具有重要意 义, 而且也标志着双水相萃取技术在工业生产的 应用正日趋成熟和完善。
1、吸附原理和吸附剂
(1)、吸附原理
吸附剂固体之所以能够吸附流体分子,是因为固体表 面上的质点处于力场不平衡状态, 固体表面具有过剩的能 即表面能,当固体与流体分子接触时,被吸附物质与固体之 间由于某种吸附力的作用使固体与流体混合物中的某些 组分产生吸附,从而降低了表面能。吸附过程所放出的热 量,称为该物质在固体表面的吸附热。
(3)、在生物转化、化学渗透释放和电泳等中引入双 水相分配,给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的 诞生提供了新的思路。
二、吸附
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W越大，反胶团的半径越大
（2）反胶团的制备
① 注入法
② 相转移法
③ 溶解法
三、 生理活性物质的分离农缩
1、反胶团萃取原理
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂 相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 ,同邻近 的蛋白质分子发生静电吸引而变形 ,接着两界面形 成含有蛋白质的反胶团 ,然后扩散到有机相中 ,从 而实现了蛋白质的萃取。(可能机理） 改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) , 又可使蛋白质从有机相中返回到水相中 ,实现反萃 取过程。
案例二：
使用二级混合-分离型萃取流程，用TOMAC/0.1%辛醇-异辛烷的
溶液体系连续分离-淀粉酶，浓缩了17倍。(图)
案例三 ： 胞内酶的提取
作业：
第八章 反胶团萃取
1.概念：反胶团；反胶团的临界胶团浓度 2.反胶团萃取的优点有哪些？ 3.如何用反胶团萃取技术分离核糖核酸酶a、细胞色 素c和溶菌酶？
水
极性“头”
微胶团：水溶液中
表面活性剂的极
性头朝外，疏水 的尾部朝内，中 间形成非极性的 “核”
非极性的 “核”
非极性“尾”
非极性有 机溶剂
极性“头”
反胶团：
表面活性剂的极
性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核”
极性的“核” 反微团内溶解的水称为微水相或水池
非极性“尾”
第八章、反胶团萃取
一、概述
反胶团(Reversed Micelles)是两性表面活性剂 在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集
而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级
的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的， 并具热力学稳定的有序构造。
反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：
(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；
用 AOT反胶团体系萃取血红蛋白时发现 , 蛋白质浓度高时,萃取率降低;而蛋白质浓 度低时,萃取率较高。
⑥表面活性剂
表面活性剂的类型 目前最常用的反胶团或微乳液是 AOT/异辛烷 体系。一是AOT形成的反胶团较大 ,有利于蛋 白质的萃取 ;二是AOT形成反胶团时不需加助 表面活性剂。 表面活性剂的浓度 当其它条件一定时 ,表面活性剂浓度也存在某 临界值。小于此临界值时 ,增大表面活性剂的 浓度可提高蛋白质的萃取率 ,大于临界值时 , 则无明显影响
①水相的 pH值
pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表 面电荷上。 在 pH小于蛋白质的等电点(PI)时 ,蛋白质表 面带正电荷 ;大于等电点时 ,蛋白质带负电荷。 AOT是一种阴离子型表面活性剂 ,它所形成 的反胶团的内表面带负电荷。 当水溶液的 pH小于蛋白质的等电点时,两表 面异电荷的吸引力使蛋白质的萃取率接近1 0 0 %。当pH大于PI时,溶菌酶萃取率急剧下 降,直到接近于零 。
(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。
二、反胶团的形成
1、反胶团的构造： 在胶体化学中我们知道，如向水溶液中加入表面活性剂，
并使其浓度超过一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成
胶体或微胶团，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性 端向外指向水溶液，疏水性的非极性“尾”向内相互聚集在
一起。
(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等
保持活性。
反胶团萃取的优点
(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；
(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；
(3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失
活的问题； (4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功 效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白 质和酶；
所以可以根据pro间M的差别选择性对pro进行萃取分离。 ③疏水性相互作用 aa的疏水性各不相同, 研究表明, aa或肽的m随aa疏水性的增 大而增大 。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因 而影响其分配系数. 疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式 溶解。
2）反胶束萃取的影响因素
水相的pH值 盐离子的种类和浓度 温度 蛋白质的分子量和浓度 表面活性剂
阳离子表面活性剂
季铵盐Βιβλιοθήκη 非极性有机溶剂：环己烷，庚烷， 辛烷等
分离蛋白质时， 使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT。
2、反胶团的物理化学特性及制备
（1）反胶团的物理化学特性 ① 反胶团的临界胶团浓度 表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团的最小浓度 ② 反胶团含水率W W=C水/C表
四、 反胶团萃取的应用
分离蛋白质混合物； 浓缩α -淀粉酶； 从发酵液中提取胞外酶 ； 直接提取胞内酶； 用于蛋白质复性。
案例一：
通过三步分离操作分离了核糖核酸酶a、细胞色素c和溶
菌酶。 依据原理1 依据原理2
通过调节水相pH值和KCl浓度来实现三种蛋白质的分 离。在pH=9时，核糖核酸酶的溶解度很小，保留在 水相而与其他两种蛋白质分离；相分离后得到的反 胶团相（含细胞色素C和溶菌酶）与0.5 mol/L的KCl 水溶液接触后，细胞色素C被反萃取到水相，而溶菌 酶留在反胶团相；含溶菌酶的反胶团与2.0 mol/L KCl，pH值为11.5的水相接触后，将溶菌酶反萃至水 相中。
溶解推动力
①静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活 性剂相反时,由于静电引力的作用, 溶质易溶于反胶团,溶解率或分配 系数较大,反之,则不能溶解到反胶 团相中
左图为pH值对不同蛋白质的溶解 率急剧变化,当pH＜pI ,即在带正 电荷的pH范围内蛋白质的溶解率 接近100%,说明静电相互作用对蛋 白质的反胶团萃取起决定性作用。
②盐离子的种类
③盐浓度
W0
S&Pro Z
盐浓度
萃取率
④温度
温度是影响蛋白质萃取率的一个重要因素。一 般来说 ,温度的增加将使反胶团的含水量下降 , 因而不利于蛋白质的萃取。通过提高温度可以实 现蛋白质的反萃取。
⑤ 蛋白质分子量和浓度
蛋白质的分子量对其萃取率有较大影响。 例如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的分子 量分别为 14300、23300、35000 , AOT/ 异辛烷反胶团萃取它们的最大萃取率分别 约为 1 0 0 %、90 %、3 0 % ,表明分子量 越大的蛋白质越难萃取。
② 空间相互作用
A. 盐浓度增大对反
胶团相产生脱水效应, 含 水率W0随盐浓度的增大 而降低,反胶团直径减小, 空间排阻作用增大, pro 溶解下降。
B .在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取 实验研究表明: 随着M增大, pro的分配系数(m, 溶解率)下降。 表明随M增大, 空间排阻作用增大, pro的溶解率降低.
2、蛋白质的溶解
a、水壳模型：蛋白质位于水
池的中心，周围存在的水层将 其与反胶团壁隔开；
b、半岛模型：pro表面存在
强烈疏水区，该区直接与有机 相接触；
c、pro吸附于反胶团内壁； d、pro疏水区与几个反胶团的
疏水尾发生相互作用，被几个 小反胶团所“溶解”。
3、反胶团萃取
1）分离场-分离物质的相互作用
当向非极性溶剂中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定 数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与 在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极 性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反， 因而称之为反胶团或反向胶团。
构成反胶团的表面活性剂种类：
阴离子表面活性剂
AOT