定量PCR加样操作流程
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
荧光定量PCR操作流程
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
荧光定量PCR实验标准操作 SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、实验目的通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析。
二、实验准备：1. 进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR 操作实验室需紫外灯照射15 分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
2. 进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染。
3. 实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
4. 准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR 实验操作的耗材（要求无菌）1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml 离心管，用于荧光定量PCR 操作的试剂: 荧光定量PCR Master Mix、H2O，DNA 或cDNA 模板（注意必须在配制完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）.5. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
6. 实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、实验步骤：1. 荧光定量PCR MIX 的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix 按照20uL反应体系内容如下：Primer F: 0.8ul(0.4uM)Primer R: 0.8ul(0.4uM)2×TB Green Premix: 10ulROX: 0.4ulH2O: 6ulMIX Total: 18ulMIX配制通常准备10%冗余量。
2. MIX 配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA 小心加入装有反应液体的反应管内：DNA/cDNA Template: 2ul(<100ng)荧光定量PCR 反应总体积：20ul.3. 模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4. 严格按照荧光定量PCR 仪的操作手册启动仪器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR 扩增程序、荧光定量PCR 样品孔信息），保存文件，最好以日期及样品名称命。
pcr定量检测流程
pcr定量检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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②核酸提取：使用磁珠法、酚-氯仿法或盐析法等，从样本中提取纯化的DNA 或RNA，严格控制操作以防核酸降解和污染。
③试剂准备：配置PCR反应液，包括模板核酸、特异性引物、荧光探针、dNTPs、缓冲液及热稳定DNA聚合酶等。
④加样与封管：将配置好的反应液精确加入反应管中，每管含有所需的所有反应组分，密封管盖以防污染。
⑤仪器设置：在实时荧光定量PCR仪上设定实验参数，包括循环次数、退火温度、延伸时间和荧光采集模式等。
⑥循环扩增：仪器自动执行PCR循环过程，包括高温变性、适温退火和中温延伸，每次循环使靶序列呈指数扩增。
⑦荧光检测：在每次循环的延伸阶段，仪器实时监测荧光信号强度，代表扩增产物的累积。
⑧数据分析：通过仪器软件分析荧光信号随循环数增加的变化，计算Ct值（循环阈值），依据标准曲线定量原始模板量。
⑨结果判定：根据Ct值与已知标准品的比较，得出样本中靶基因的绝对或相对定量结果，判断阴阳性或表达水平。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量pcr操作流程
荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术。
它可以有效地扩增DNA片段，具有极高的精确度，广泛应用于分子生物学、遗传学和病原学等领域。
本文将介绍荧光定量PCR的操作流程。
首先，要准备所需的试剂和仪器。
PCR反应所需的试剂包括DNA 模板、双链引物、PCR酶、dNTPs等，而仪器则包括PCR微量热循环仪、荧光检测仪等。
其次，将所需试剂按一定比例配置，并分装到PCR微量热循环仪的反应液体中。
然后，将液体加到PCR微量热循环仪的反应槽中，设定温度及时间，以完成PCR扩增反应。
最后，将扩增产物稀释，用荧光检测仪进行定量检测，并计算扩增倍数，从而完成荧光定量PCR的操作步骤。
总之，荧光定量PCR技术是一种常用的分子生物学技术。
它可以有效地扩增DNA片段，有助于深入探究DNA序列，从而为分子生物学、遗传学和病原学等领域的研究发现提供重要线索。
完成荧光定量PCR操作的步骤包括准备试剂和仪器、配置反应液体、PCR扩增反应、定量检测和计算扩增倍数等。
定量PCR加样操作流程
QPS-201加样流程和Step One Plus仪器的仪器操作要准备的东西：1.八排管和盖子2.96孔细胞培养板3.移液器：10ul,20ul,100ul,200ul。
4.枪头10ul,20ul,100ul,200ul或者300ul。
5.200ul和600ul的PCR管。
6.试剂：QPk-201，上下游引物，cDNA，去RNA酶的PCR水7.注意事项：A.引物的储存浓度100nm，工作浓度：5-10nmol,引物要过量，上下游引物要先混匀在一起，然后再加。
内参actin和目标基因的引物都要混匀。
混匀后的引物可用半个月，用时要反复混匀，水样的东西混20下，油状的（酶）东西至少要混30下。
B.试剂配总管用，cDNA和酶mix配一管，引物和水配一管。
混匀之后，再分别加到管子里。
为什么试剂要配总管呢？cDNA模板量很少，所以加多加少对实验影响很大，酶加10ul，样多，少量的东西要想混匀，必须放在大量的东西里这样再去混匀，就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。
C.内参和目标基因都要跑3个复孔，取平均值，差异CT值要在0.5之内，如果Ct值>0.5，结果就不可信，要重新再做。
（一）QPk-201加样流程：用QPk-201做样品体系是20ul的。
cDNA :2ulPCR水：6ul上下游引物共：2ul酶MIX：10ul一共是20ul体系。
把cDNA :2ul和酶mix：10ul共12ul配一管。
把引物：2ul和水6ul共8ul配一管。
以下以样品为例，加样流程如下：目标基因STOB1，样品六个，编号：1,2,3,C5，C6，C7内参基因actin目标基因STOB1STOB1STOB1内参ActionActionAction如何计算是关键：6个样品，每个样品配一管，再分6次加，但是要考虑都损失，所以要多加10%的量，以避免最后没得加了。
cDNA和酶配一管：cDNA:2×6×1.1=13.2ul酶Mix:10×6×1.1=66ul，在总管里吹打30次混匀，取12ul。
定量PCR的实验流程及注意事项
定量PCR的实验流程及注意事项一、实验流程：1. Primer设计：为了进行定量PCR实验，需要设计一对与目标DNA 或RNA序列特异性结合的引物。
确保引物的特异性和互补性，通过使引物的浓度相等可以最大限度地提高PCR反应的扩增效率。
2.模板DNA或RNA提取：从细胞或组织中提取目标DNA或RNA。
可以使用商业化的DNA/RNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
注意保持样品的完整性，避免污染和降解。
3.RNA逆转录（如果需要）：如果目标是RNA，则需要使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。
通常，使用逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
4. qPCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包含引物、模板DNA或cDNA、酶（如Taq DNA聚合酶、逆转录酶等）和反应缓冲溶液。
同时还可以加入SYBR Green等荧光染料或探针以实现实时监测PCR反应的进行。
5.PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，如温度和时间等。
通常情况下，PCR反应会进行多个循环，每个循环包括退火、延伸和变性三个步骤。
6.实时检测PCR反应：在PCR反应过程中，使用实时荧光检测系统实时监测PCR产物的积累。
根据荧光信号变化的阈值周期数（Ct值），可以推断出目标DNA或RNA的初始浓度。
7.标准曲线构建：通过使用已知浓度的目标DNA或RNA来构建标准曲线。
将标准曲线与待测样品的Ct值进行比较，可以计算出目标物浓度。
8.数据分析：根据标准曲线和待测样品的Ct值，计算出目标物的相对或绝对浓度。
可以使用专业的数据分析软件对实验结果进行统计分析和解释。
二、注意事项：1.特异性引物设计：确保引物与目标DNA或RNA的特异性结合，避免引物与非目标序列的扩增。
2.制备PCR反应的质量控制：采用无菌、无核酸污染的试剂和实验环境，避免引入杂质干扰PCR反应。
3.避免PCR反应产物的污染：使用专门用品和设备进行PCR实验，避免引入外源性DNA或RNA。
4.逆转录反应的标准化：如果进行RNA定量PCR，应尽量标准化逆转录反应的条件，以获得准确的cDNA模板。
qpcr的操作流程
qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
下面将介绍qPCR的操作流程。
1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。
确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。
2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。
确保核酸的质量符合实验要求。
3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。
4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。
包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。
确保反应体系的配比准确。
5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。
根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。
6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。
确保数据的准确性和可靠性。
7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。
判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。
总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。
通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
96孔板荧光定量pcr加样技巧
96孔板荧光定量pcr加样技巧
1.准备样品：将需要检测的DNA或cDNA样品冻存或提取干净，在使用前进行稀释。
2.准备PCR反应体系：按照实验室的标准制备好PCR反应体系，加入引物、荧光探针和DNA聚合酶等试剂。
3.在96孔板中加入PCR反应体系：按照实验需要的样品量和反应体系量，在96孔板中加入适当的体积PCR反应体系。
4.加入样品：用多道移液器或单通道移液器分别加入稀释好的样品和负对照样品，确保每个样品或对照物都加入到了正确的位置。
5.加盖并旋紧：在反应体系和样品加入完成后，最好使用96孔板封口膜或强力透明胶贴将板盖起来并旋紧，以防止样品反应后溢出。
6.放入PCR仪中嵌板运行：将加好反应体系的96孔板放入PCR仪中进行测试。
7.数据分析：通过PCR仪检测数据，利用数据分析软件进行定量PCR 数据的分析和解释。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。
可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃60min ，70℃10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
荧光定量PCR操作流程总结
荧光定量PCR操作流程一、RNA提取准备物品：无RNA酶大中小枪头；一套枪；trizol试剂；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；DEPC水；氯仿；75%DEPC乙醇；异丙醇等1、1mLTrizol样品加200uL氯仿，用力晃动15s2、冰上静置5min3、4℃12000rpm 离心15min4、小心吸取上清水相400-500uL至新的无酶EP管5、按照体积1:1加异丙醇，颠倒混匀6、置于冰上30min7、4℃12000rpm 离心10min8、倒掉上清，加入500uL75%DEPC乙醇，轻弹管底使RNA沉淀漂起9、4℃12000rpm 离心5min10、吸上清弃掉，尽量吸干净11、12000rpm 离心5min12、吸上清弃掉，尽量吸干净，开盖超净台内凉置5min13、每管加20uLDEPC水溶解，弹管底使溶解混匀14、56℃助溶10min15、置于冰上测RNA浓度（Gen5 核酸检测执行）16、擦手纸蘸蒸馏水擦RNA浓度检测板加样孔，再用擦镜纸擦干17、1234孔各加2uLDEPC水，检测，本底为绿色即可继续测样本（2uL）18、依次按编号加入2uL样本，软件关闭后重新打开，选择样本检测19、批准出结果260/280=1.8-2则样品合格二、反转录qPCR准备物品：无RNA酶大中小枪头；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；RTmix；DEPC水1、计算1000ng（反转录RNA上样量1000ng）的RNA体积，必要时稀释2、反转录体系20uL（RTmix 4uL ；RNA样品约2uL ；DEPC水补齐20uL ）3、弹管底混匀瞬时离心4、Bio-rad 中间选项takaraRT run 16min5、dd水稀释cDNA，使cDNA浓度约为10ng/uL，100uL分装后-20℃保存三、荧光定量PCR准备物品：8联管；引物；cDNA；200uLEP管；无菌枪头1、引物稀释dd水溶解稀释引物，旋涡混匀，引物储存浓度10nM/uL2、定量PCR10uL体系引物F 0.4uL引物R 0.4uLcDNA 1uL(终浓度为1ng/uL)SYBR 5uL(含染料、DNA扩增酶、DNTP、Mg2+、扩增缓冲液等)dd水3.2uL3、布板一个指标三个重复4、取10个200uL无酶EP管，按顺序编号123456789105、按照一个指标：六个孔+2个孔（防止枪误差导致各孔不均）=8孔的剂量配制混合：引物F 0.4uL*8=3.2 uL引物R 0.4uL*8=3.2 uLSYBR 5uL*8=40 uLdd水3.2uL*8=25.6 uL6、按照布板依次加入8联管中（置于冰上），最后每孔加1 uL cDNA（P5 P10 cDNA不同），设置不加cDNA模板的阴性对照。
实时荧光定量 PCR 仪快速操作指南说明书
实时荧光定量PCR仪快速操作指南1.连接电源从包装箱里取出仪器放置在实验台上，拿出电源线和电源适配器，将电源线一端与电源适配器相连，另一端连接至交流220V电源插座（AC85~264V）电源适配器的输出端连接到仪器电源插孔。
接口插入仪器电源插孔，注意插孔方向箭头方向朝上。
打开仪器背面的电源开关开启仪器，仪器自检成功，自动进入到软件界面。
2.样品准备◼准备试剂Q1600实时荧光定量PCR仪使用0.2ml透明离心试管根据试剂要求选用10-100μl合适的加液量。
◼离心操作配置完成试剂样本的试管在放入仪器之前，要用离心机进行离心操作，确保试剂液体处于试管底部，且液体内部不含有气泡。
◼放置样品将反应管按照顺序放入加热孔内。
3.设置程序，运行实验软件操作基本步骤：◼新建实验新建实验，选择运行槽◼基本设置设置实验名称，实验类型，检测项目，选择使用的染料。
◼样本设置设置样品名称，样本ID号，选择样本类型◼程序设置设置需要的反应程序◼保存文件单击保存，保存实验文件◼运行单击运行，运行实验。
4.结果分析◼实验结束，软件自动计算Ct值，根据判定规则自动出结果。
◼如需进行熔解分析和基因分型，在软件分析类型里选择相应的分析功能。
5.结果导出◼导出实验结果单击导出，导出实验数据。
◼结果打印连接配置的热敏打印机，选中要打印的样品孔，单击打印，打印实验结果。
6.关闭仪器◼实验结束，取出反应管◼长按仪器前面板关机按键，关闭仪器◼长时间不使用仪器，请关闭仪器背部左下角电源开关。
pcr实验流程和注意事项
PCR实验流程如下：
试剂准备阶段：在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。
所有的PCR体系都应该在-20℃保存，除了ddH2O之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。
配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。
体系配制完成之后应马上进行PCR反应。
样本制备阶段：样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。
严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。
戴手套并勤于更换，要有无核酸观念。
在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。
PCR实验注意事项：
引物长度通常在18-22个碱基之间。
解链温度Tm值通常要在52-58度之间。
GC含量也是一个重要的因素。
以上信息仅供参考，具体步骤和注意事项可能会因实际情况而有所不同，建议咨询专业人士获取更准确的信息。
实时定量PCR步骤
实时定量PCR步骤实时定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA序列或基因表达水平的方法。
它是PCR技术的变体，可以实时监测PCR反应的进行，并在放大过程中定量目标DNA序列的数量。
下面是实时定量PCR的详细步骤：步骤1：实验准备1.1收集所需的实验材料，包括PCR反应液组分（引物、探针、dNTPs、缓冲液、聚酶等）、PCR管和盖膜、模板DNA样品、阳性和阴性对照样品等。
1.2预先冷藏和解冻所有的试剂和样品。
1.3清洁操作台面，并准备离心机、实时荧光PCR仪和计算机等设备。
步骤2：引物和探针设计2.1根据待测目标序列，使用生物信息学工具设计引物和探针，确保具有高度特异性和高扩增效率。
2.2检查引物和探针的熔解温度是否相近，并避免二次结构和杂交问题。
步骤3：制备PCR反应液3.1根据PCR反应体系计算所需的试剂量，并根据实验板的数量和样品数量，按比例制备PCR反应液。
3.2在一个干净的离心管中，将缓冲液、dNTPs、引物、探针、酶和染料等反应组分按照特定顺序加入。
3.3使用纯水调整总反应体积，确保每个样品反应液体积相等。
步骤4：添加模板DNA4.1准备好模板DNA样品，可以是基因组DNA、cDNA或其他。
4.2将模板DNA分别加入各个PCR反应管中，注意避免污染和交叉污染。
步骤5：进行PCR反应5.1将PCR反应管密封，并在PCR仪上进行扩增。
此时，PCR仪应可提供实时荧光信号监测功能。
5.2设置PCR仪的温度程序和循环次数，通常包括热激活、扩增和延伸等不同的阶段。
5.3监测PCR仪上的实时荧光信号，并记录下所有的扩增曲线。
实时荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。
5.4在每个PCR循环的结束时，建议进行一次熔解曲线分析，以确定PCR产物的特异性。
步骤6：数据分析6.1使用PCR仪上的软件工具，导出扩增曲线数据。
6.2使用阈值周期（Ct）方法，根据扩增曲线与阈值线的交叉点来定量反应液中目标序列的数量。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR详细操作步骤1.实验前准备a.首先，准备所需的引物和探针。
引物是用于扩增待测DNA或RNA序列的短链DNA片段，而探针是荧光标记的DNA分子，用于标记和检测扩增产物。
可以使用商业引物和探针，或者设计自定义的引物和探针。
b.准备样品。
样品可以是DNA或RNA提取物，也可以是cDNA反应产物。
确保样品的质量和纯度，避免污染和降解。
c. 准备Master Mix。
Master Mix是一个预混合的反应液，包含引物、探针、核酸酶、逆转录酶、聚合酶和其他所需的试剂。
根据实验设计确定Master Mix的配方和浓度。
2.反应管设定a. 将适量的Master Mix加入每个反应管中。
根据实验设计，确定每个反应管中所需Master Mix的体积。
b.加入适量的模板DNA或RNA溶液。
根据实验设计，确定每个反应管中所需模板溶液的体积。
c.加入适量的引物和探针。
根据实验设计，确定每个反应管中所需引物和探针的体积。
d.加入适量的缓冲溶液和其他试剂。
根据实验设计，确定每个反应管中所需缓冲溶液和其他试剂的体积。
3.PCR程序设定a.设定PCR程序。
根据引物和探针的特性，确定PCR程序的温度和时间参数。
通常包括一个初始变性步骤（95°C，5分钟），40个循环的扩增步骤（95°C，30秒；温度调节，30秒；扩增，30秒-1分钟），以及最终的降温步骤（4°C或25°C）。
b.设定数据采集方式。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，并实时记录和分析数据。
根据实验设计和PCR程序，选择合适的数据采集方式，在合适的时间点记录荧光信号。
4.实验操作a.将反应管安置在实时荧光定量PCR仪中。
确保反应管正确放置在PCR仪的样品槽中，并密封好。
b.启动PCR程序。
根据PCR仪的操作说明，启动PCR程序并开始反应。
c. 监测PCR反应过程。
实时观察PCR反应过程中的荧光信号变化。
定量PCR加样操作流程
定量PCR加样操作流程定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于精确测定目标DNA 或RNA分子在样本中的相对或绝对含量的技术。
在定量PCR实验中，需要进行一系列加样操作，以确保正确反映目标分子的浓度。
下面将详细介绍定量PCR的加样操作流程。
1.设计引物和探针：在进行定量PCR之前，需要设计一对引物和一种探针，用于扩增和检测目标分子的特定序列。
引物和探针的设计需要考虑到特异性和效率，并且应该使扩增产物的大小恰好在所需范围内。
2.准备实验材料：在进行定量PCR之前，需要准备一系列实验材料，包括：-收集所需的引物和探针；-准备PCR反应液，包括缓冲液、dNTPs、酶、MgCl2和DNA模板等；-防护用品，如手套和护目镜，以确保实验操作的安全性。
3.制备PCR反应体系：根据PCR反应的种类和厂家提供的建议，按照实验方案准备PCR反应液。
反应液通常由多个组分组成，其中包括DNA模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2和水。
4.为每个样品制备PCR反应管：为每个样品准备PCR反应管，确保每个反应管都包含相同的PCR反应液。
如果有多个样品需要测试，可以通过分装PCR反应液到每个反应管中来实现。
5.添加DNA模板：在每个PCR反应管中，将一定体积的DNA模板加入到PCR反应液中。
DNA模板的体积应当根据所用方法和预期浓度来确定。
6.加入引物和探针：根据引物和探针的设计，向每个PCR反应管中加入适量的引物和探针。
确保每个反应管都包含相同浓度的引物和探针。
7.混匀反应液：通过轻轻的振动或轻微的离心来混合PCR反应液，以确保其中的各个组分均匀混合。
8.加盖或密封反应管：将PCR反应管盖上或用密封膜密封，以防止反应过程中的污染和蒸发。
9.进行PCR扩增：将PCR反应管置于热循环仪中进行PCR扩增。
根据实验方案设置PCR程序，包括预扩增步骤、扩增步骤和终止步骤。
10.数据分析和解读：在PCR扩增完成后，可以使用荧光定量PCR仪测量每个反应管中荧光信号的强度。
定性pcr操作流程
定性pcr操作流程
定性PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA
序列的技术，通过扩增特定DNA片段来确定样本中是否存在目标序列。
下面将介绍定性PCR的操作流程。
1. 样本准备：首先需要准备待测样本，可以是DNA提取物、细
胞提取物或者其他含有目标DNA的样本。
确保样本的纯度和浓度符
合实验要求。
2. 反应体系准备：将PCR反应体系按照实验方案准备好，通常
包括DNA模板、引物、核酸酶、缓冲液、dNTPs等。
引物是PCR反
应的关键，它们是用于扩增目标DNA片段的短链DNA片段。
3. PCR扩增：将反应体系加入PCR仪器中，设置好扩增程序。
PCR程序通常包括变性、退火和延伸三个步骤，通过循环这三个步
骤来扩增目标DNA片段。
4. 凝胶电泳：扩增反应结束后，将PCR产物进行凝胶电泳分析。
将PCR产物与DNA分子量标准一起加载到琼脂糖凝胶上，然后进行
电泳分离。
通过观察凝胶图谱，可以确定PCR反应是否成功，目标DNA片段是否存在。
5. 结果分析：根据凝胶电泳结果，判断PCR反应是否成功，目
标DNA片段是否存在。
如果目标DNA片段存在，则可以进一步进行
测序或其他实验。
总的来说，定性PCR操作流程包括样本准备、反应体系准备、PCR扩增、凝胶电泳和结果分析等步骤。
通过这些步骤，可以快速、准确地检测目标DNA片段的存在与否，为后续实验提供重要数据支持。
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用，为科学研究和
临床诊断提供了重要的工具。
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QPS-201加样流程和Step One Plus仪器的仪器操作
要准备的东西：
1.八排管和盖子
2.96孔细胞培养板
3.移液器：10ul,20ul,100ul,200ul。
4.枪头10ul,20ul,100ul,200ul或者300ul。
5.200ul和600ul的PCR管。
6.试剂：QPk-201，上下游引物，cDNA，去RNA酶的PCR水
7.注意事项：
A.引物的储存浓度100nm，工作浓度：5-10nmol,引物要过量，上下游引物要先混匀在一起，然后再加。
内参actin和目标基因的引物都要混匀。
混匀后的引物可用半个月，用时要反复混匀，水样的东西混20下，油状的（酶）东西至少要混30下。
B.试剂配总管用，cDNA和酶mix配一管，引物和水配一管。
混匀之后，再分别加到管子里。
为什么试剂要配总管呢？cDNA模板量很少，所以加多加少对实验影响很大，酶加10ul，样多，少量的东西要想混匀，必须放在大量的东西里这样再去混匀，就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。
C.内参和目标基因都要跑3个复孔，取平均值，差异CT值要在0.5之内，如果Ct值>0.5，结果就不可信，要重新再做。
（一）QPk-201加样流程：
用QPk-201做样品体系是20ul的。
cDNA :2ul
PCR水：6ul
上下游引物共：2ul
酶MIX：10ul
一共是20ul体系。
把cDNA :2ul和酶mix：10ul共12ul配一管。
把引物：2ul和水6ul共8ul配一管。
以下以样品为例，加样流程如下：
目标基因STOB1，样品六个，编号：1,2,3,C5，C6，C7
内参基因actin
如何计算是关键：
6个样品，每个样品配一管，再分6次加，但是要考虑都损失，所以要多加10%的量，以避免最后没得加了。
cDNA和酶配一管①：
cDNA:2×6×1.1=13.2ul
酶Mix:10×6×1.1=66ul，在总管里吹打30次混匀，取12ul。
引物和水配一管②：
引物：2×18×1.1=39.6ul
PCR水：6×18×1.1=118.8ul，在总管里吹打20次混匀，取8ul。
配完之后要混匀。
剩下的就是加样，贴在一侧的壁上，加样时，先吹打，再吸，贴壁打到底，按着不松，把移液器收回来。
加一个样品，就换一个枪头。
加另一管的时候，把管子反过来，再在这一侧壁上加管②，的就不用换枪头了。
这个加样的步骤一般是在碎冰上操作的，试剂一定要放在冰上的。
加完之后，轻轻的盖上盖子，放在离心机里离心，让试剂都落到管子底部去。
离心完之后，就可以放到定量PCR仪的黑色的96孔板子上了，然后打开机器，放进去，开始设置了。