实时定量PCR简介
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR简介
实时荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。
在Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有19 篇，在1997 年仅有28 篇，在98 、99 、2000 年分别达到了52 、157 、409 篇，2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。
针对实时PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。
荧光定量PCR基本原理•Taqman 技术：该技术以美国ABI 公司为代表。
PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。
该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
•Beacon 技术：该技术以美国人Tagyi 为代表。
也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
•FRET 技术：该技术以Roche( 罗氏公司) 为代表。
它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的3 …端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。
其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。
实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。
在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。
当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。
而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。
根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。
为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。
首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。
根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。
最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。
实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。
它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。
相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。
实时定量pcr的原理及应用
实时定量PCR的原理及应用一、什么是实时定量PCR？实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction），简称实时定量PCR，是一种高度敏感且快速的核酸检测技术。
它不仅可以定性地检测目标核酸序列的存在与否，还可以精确测量目标序列的数量。
二、实时定量PCR的原理实时定量PCR利用DNA聚合酶的酶活性，在双链DNA模板上合成新的DNA 链。
该技术的原理是：首先，通过一个DNA引物与目标DNA序列特异性结合，并将DNA聚合酶带有荧光标记的探针与其结合。
然后，在每一轮的PCR循环中，DNA聚合酶将合成新的DNA链，并释放一个荧光信号。
这个荧光信号可以实时地被特定的检测设备及时检测到。
根据荧光信号的量，可以判断目标DNA序列的数量。
实时定量PCR主要包含以下步骤：1.DNA模板的制备：包括从生物样本中提取DNA，如细胞、组织或血液等；2.引物的设计：设计两个与目标DNA序列特异性结合的引物，确保引物的长度和温度适宜；3.反应体系的准备：准备PCR反应体系，包括引物、荧光标记的探针以及DNA聚合酶等；4.PCR循环条件的设定：确定PCR循环的温度和时间条件以实现合成新的DNA链；5.实时检测和数据分析：通过特定的实时定量PCR设备实时检测荧光信号，并根据标准曲线计算目标DNA序列的数量。
三、实时定量PCR的应用实时定量PCR在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是实时定量PCR常见的应用领域：1. 生物学研究实时定量PCR可以用于研究基因表达的变化，从而揭示生物体内基因调控的机制。
它可以定量测量不同组织或细胞中特定基因的表达水平，帮助科研人员了解基因在不同生理状态下的功能和调控网络。
2. 分子诊断实时定量PCR在疾病的分子诊断中扮演着重要角色。
通过对人体样本中特定基因的定量检测，可以帮助医生确定某些疾病的存在，并评估疾病的严重程度。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。
它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。
该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。
在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。
当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。
SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。
由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。
在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。
标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。
然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。
总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。
实时荧光定量pcr检测原理
实时荧光定量pcr检测原理实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
这种方法通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性，在DNA合成过程中检测荧光信号的变化。
当DNA聚合酶与特定荧光染料标记的DNA引物结合时，荧光染料会被标记在引物的3’端。
在PCR反应过程中，每当DNA聚合酶添加一个核苷酸到引物3’端时，聚合酶的外切酶活性将荧光染料从引物上切割下来，释放出荧光。
通过实时检测荧光信号的变化，可以实时监测DNA的合成过程。
实时荧光定量PCR的定量原理是利用PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。
在PCR扩增的指数时期，随着循环次数的增加，DNA产物的量呈指数增长。
在这个阶段，每个循环的DNA产物量与上一个循环的DNA产物量成比例。
因此，通过实时检测荧光信号的变化，可以确定PCR进程中的DNA产物量。
由于每个模板的起始拷贝数不同，因此不同模板的Ct值也不同。
通过比较不同模板的Ct值，可以确定模板的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR具有许多优点，如高灵敏度、高特异性和高自动化程度。
它可以用于多种类型的样本检测，包括血液、组织、细胞培养液等。
此外，实时荧光定量PCR还可以用于基因表达分析、突变检测和病原体鉴定等应用。
实时荧光定量PCR是一种非常有用的技术，可以用于多种类型的样本检测和分析。
它的基本原理是利用DNA聚合酶的外切酶活性和荧光染料标记的引物来实时监测DNA的合成过程。
通过比较不同模板的Ct值，可以确定模板的起始拷贝数，从而实现定量分析。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR 仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理实时定量PCR原理。
实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测和量化DNA或RNA的技术，它结合了传统PCR技术和荧光探针技术，能够实现对靶基因的快速、准确和高灵敏度的定量分析。
实时定量PCR的原理基于传统PCR技术，但是在PCR反应过程中通过荧光信号实时监测靶基因的扩增情况，从而实现对靶基因的定量分析。
在实时定量PCR中，常用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。
在实时定量PCR反应中，首先是DNA或RNA的反转录和前PCR扩增，然后在PCR反应过程中，荧光信号与靶基因的扩增量成正比。
通过检测荧光信号的增加，可以实时监测靶基因的扩增情况，并且可以根据荧光信号的增加来计算出靶基因的起始量。
实时定量PCR的优势在于其快速、准确和高灵敏度的特点。
相比于传统PCR技术，实时定量PCR无需等待PCR反应结束后再进行结果分析，而是可以在PCR反应过程中实时监测靶基因的扩增情况，从而能够更快速地得到定量分析结果。
同时，实时定量PCR的荧光信号检测系统能够实现对靶基因的高灵敏度检测，能够检测到极低浓度的靶基因。
另外，实时定量PCR还具有高度的准确性。
通过荧光信号的实时监测，可以避免了传统PCR技术中可能出现的内源性荧光干扰，从而能够更准确地进行靶基因的定量分析。
总的来说，实时定量PCR技术是一种快速、准确和高灵敏度的DNA或RNA定量分析技术，它在基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域具有广泛的应用前景。
随着实时定量PCR技术的不断发展和完善，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告周向阳
平台期 线性扩增期 指数扩增期
基线期
扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
扩增曲线
S型曲线的四个特征性阶段
➢ 线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。
➢ 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环 后，PCR产物呈指数倍增加。
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
PCR产物的电泳检测和分析
ladder
PCR fragment
二、实时荧光定量PCR
(Real time Quantitative PCR)
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始 浓度进行定量分析的方法。
手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值， 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。
Ct值
• Ct（Cycle Threshhold）值：每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。
目的基因：FAM
内标：HEX
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
➢ 基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均 一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对 每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自 动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其 他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整 分析。
实时定量PCR技术原理
实时定量PCR技术原理实时定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于DNA扩增的技术，可以在PCR过程中同时进行扩增和定量分析。
其原理是利用DNA聚合酶酶的催化作用，在初始模板DNA的基础上，通过PCR循环反应不断扩增目标序列的数量，并通过荧光信号的强度变化来实时监测扩增过程。
实时定量PCR使用双链DNA作为模板，首先通过热变性步骤将DNA模板的两条链分离。
然后，在降温的过程中，引物与模板特异性结合形成引物-模板复合物。
引物是针对目标序列设计的短链DNA，根据目标序列的首尾碱基序列确定。
在PCR扩增的第一次循环中，引物与模板复合物在热稳定的DNA聚合酶的存在下，通过链延伸反应合成新的DNA链。
DNA聚合酶酶会催化引物与模板的配对延伸反应，合成新的DNA链，同样的，新合成的DNA链会作为模板在下一循环中被再次复制，形成指数级的扩增。
实时定量PCR技术使用DNA荧光染料或探针来标记并检测扩增过程中产生的DNA数量。
荧光信号可以分为非特异性荧光信号和特异性荧光信号。
非特异性荧光信号来自于引物和其他反应物的副产物，在扩增早期出现，但由于无法用于准确定量，一般在分析中会被排除。
特异性荧光信号来自于目标序列的扩增产物，并通过荧光探针或广泛用的双链DNA染料（如SYBR Green）进行检测。
通过在每一个循环反应中实时监测荧光信号的强度，可以获得一个荧光强度随循环次数而变化的荧光曲线。
荧光强度的增加代表了目标序列的扩增量，通过与已知浓度的标准样品对比，可以计算出初始样品中目标序列的数量。
实时定量PCR技术的优势在于实时监测扩增过程，能够准确、快速地定量目标序列的数量，并且操作简便，适用于许多领域，如基因表达分析、病原微生物检测、基因突变检测等。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理
实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一种用于检测和测量特定DNA序列量的技术。
该技术结合了传统PCR和DNA定量技术，可以在PCR反应进行过程中实时监测和记录DNA的增殖情况。
实时定量PCR的原理是通过特定引物和荧光探针结合，实时监测和记录PCR反应中DNA的增量。
该技术通常采用荧光染料或探针，如SYBR Green或探针涉及双校验报告器染料。
SYBR Green可以结合PCR产物中的双链DNA，生成荧光信号，而探针方法则利用探针与PCR产物的高度特异性结合，产生荧光信号。
这些信号可以由实时定量PCR仪器进行检测和记录。
在实时定量PCR中，反应体系包含待测DNA样本、引物、荧光信号探针（如SYBR Green）或特异性探针以及其他反应组分。
PCR反应进行过程中，随着DNA的增殖，荧光信号也会相应地增加。
实时定量PCR仪器可以对荧光信号进行连续的检测和记录，通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值），可以确定初始模板DNA的量。
实时定量PCR的原理基于实时检测和记录PCR反应中DNA 的增量，无需进行后续凝胶电泳或测序等步骤，从而实现了高效、准确和革新的DNA定量。
由于其高灵敏性、快速性和定量性，实时定量PCR在生物医学研究、遗传学分析、疾病诊断和药物筛选等领域得到广泛应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Real-time Quantity PCR
NJSunshine 李文 2005.11.17
实时定量PCR简介
定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸 定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反 应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA 模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性 更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染 性、具实时性和准确性等特点 。
实时定量PCR的两个重要概念 的两个重要概念 实时定量
反应的前15 （1）荧光域值（ threshold）： 以PCR反应的前15 个循环的荧光信 荧光域值（ threshold）： PCR反应的前 号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15 15个循环的荧光信号 号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号 的标准偏差的10 的标准偏差的10 倍。 (2)Ct值 也称循环阈值， 代表Cycle， 代表threshold。指在PCR (2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR Ct Cycle threshold 循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的 循环次数。在实际操作中， 循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于阈值。 Ct值取决于阈值 号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于阈值。
探针设计一般应符合以下条件： 探针设计一般应符合以下条件： (1)GC碱基含量在40% 60%。 GC碱基含量在40%(1)GC碱基含量在40%-60%。 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 避免5'端为G 因为G对荧光可能有抑制作用， 5'端为 （3）避免5'端为G， 因为G对荧光可能有抑制作用，尽量 个数多于G 使C个数多于G。 长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。 15--25个碱基左右 （4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。 探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃ Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。 另外，探针与引物不能形成二聚体， 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引物尽量 接近但不要重叠。 接近但不要重叠。
图.LUX 引物工作原理
为了帮助保护您的隐私， PowerPoint 禁止自动下载此外部图片。若要下载并显示此图片，请单击消息栏中的 “选项 ”，然后单击 “启用外部内容 ”。
Lux引物 引物
LUXTM 技术的优势
1.通过/dlux-easy-to-use methode设计适合客户的实验的LUXTM Primer。 2.购买已经验证，即用的LUXTM Primer－这些引 物只适合看家基因（40＋）和人类基因。 40 3.通过和Invittrogen Custom LUXTM Primer服务中 心联系，由专家给您设计适合您实验的新的引 物。
SYBR GREEN
FRET探针
Taqman
分子信标
LUX 引物
性质
可逆荧光
积累荧光
熔点分析
体有影响）
引物＋2探 针
引物＋探 针
引物＋探 针
引物（非特异性 扩增或引物二聚 体无影响）
探针
不需要
需要
需要
需要
不需要
通用性
通用
专用
专用
专用
专用
1.TaqMan探针方法的作用原理: 1.TaqMan探针方法的作用原理: TaqMan探针方法的作用原理 本方法的原理主要是利用Taq 酶的5'→3' 5'→3'外切核酸酶活性并在 本方法的原理主要是利用Taq 酶的5'→3'外切核酸酶活性并在 PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针 TaqMan探针5'端标以荧 过程中反应体系加入一个荧光标记探针。 探针5' PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。TaqMan探针5'端标以荧 光发射基团，3'端标以荧光猝灭基团 该探针在PCR 端标以荧光猝灭基团。 PCR过程中不能被延 光发射基团，3'端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中不能被延 当探针保持完整时，3'端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射 端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射。 伸。当探针保持完整时，3'端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射。 PCR的退火期 探针与引物所包含序列内的DNA 的退火期。 DNA模板发生特异性杂 在PCR的退火期。探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂 延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处， Taq酶作用下延DNA模板延伸 交。延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处，Taq 酶发辉5'→3'外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后， 5'→3'外切核酸酶活性 酶发辉5'→3'外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射 基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检 测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断， 测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并 伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR 伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR 产物数量是一对一的关系， 产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成 正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。 正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短 时效率较高，故扩增长度一般为50 150bp 50—150bp。 时效率较高，故扩增长度一般为50 150bp。
(3)RNA UltraSense One-step Quantitative RT- PCR System 适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的 适用于超低量 摸板的灵敏扩增的 QRT-PCR系统 系统 (4)Platinum qRT-PCR Thermoscript One-step System 适用于扩增具有二级结构的RNA 适用于扩增具有二级结构的 2.二步法 二步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum two-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green two-step qRT-PCR Kit w/ROX
(2) 适合于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit (3) Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect 二步法 ① Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect Two-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum CellsDirect Two -step qRT-PCR Kit w/SYBR Green 3. SuperScript Ⅲ 1st cDNA合成系统 合成系统 SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis superMix for qRT-PCR
经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn） 经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn）成反比 。 值与模板DNA的起始拷贝数
作用原理
实时荧光定量PCR常用的检测模式五种： 实时荧光定量PCR常用的检测模式五种： PCR常用的检测模式五种
TaqMan探针 （1）TaqMan探针 GreenⅠ （2）SYBR GreenⅠ （3）LUX引物 ） 引物 (4)Molecular beacon (5)荧光谐震能量传递（FRET,Roche product） 荧光谐震能量传递（ 荧光谐震能量传递
qPCR 试剂盒 1.一步法 一步法 (1)优化于 优化于ABI系统 优化于 系统 ① SuperScript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit w/ROX ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit w/ROX (2)适用于其他系统 适用于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit
(2) SYBR Green I荧光染料的作用原理
是一种只与双链DNA小沟结合的染料， DNA小沟结合的染料 SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料， 当它与DNA双链结合时，发出荧光； DNA双链上释放出 DNA双链结合时 当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出 来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内， 来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。 DNA分子的数量 号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是在于能 与非特异性双链DNA 如引物二聚体）结合， DNA（ 与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合，但是其产 生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。 生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。 这种检测方法无法应用于多重qPCR中 中 这种检测方法无法应用于多重
Invitrogen qPCR产品 产品 (1) superscript RT 和更好的特异性。 和更好的特异性。 可获得更高的cDNA产量 产量 可获得更高的