QPCR原理及应用
qpcr探针法原理
qPCR探针法原理是以实时荧光PCR为基础的一种基因实时定量分析技术，该技术是利用荧光探针比较准确地测量PCR反应产生的荧光信号，进而推导出待测物的数量。
接下来我们将从概述、原理、优点、应用以及未来发展方向几个方面阐述qPCR探针法原理。
一、qPCR探针法原理概述qPCR探针法原理是一种表达基因变化或病原体感染程度的实时定量PCR方法，是PCR技术的一种分支，具有更高的灵敏度和准确度。
该技术基于实时定量PCR技术，结合荧光探针检测，能够精确量化PCR反应中待测物的数量，是生物技术领域的研究人员进行基因表达分析及定量核酸检测的重要手段之一。
qPCR探针法原理已广泛应用于生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全等领域。
二、qPCR探针法原理解析qPCR探针法原理是其它PCR技术的升华，依靠荧光方法对PCR反应的实时程度进行监测。
在PCR反应过程中，荧光探针被加进PCR扩增反应体系中。
荧光探针又分为探针和引物两种，两者分别被标记上FAM和TAMRA两种不同的荧光染料，探针和引物的序列与待测物的靶基因序列互补匹配。
当PCR 反应增殖到延线性阶段时，探针就会被引物剪切并发生荧光素染料的释放，同时荧光素会因为分子间的变化而产生荧光信号，检测机器即可准确读出荧光信号测量PCR延线性阶段的荧光信号强度，进而推导出待测物的数量。
三、qPCR探针法原理的优点qPCR探针法原理具有许多优点，包括灵敏度高、特异性好、快速、精确、可重复性强等优点。
具体来说，一方面，通过荧光检测，该技术可以在大约30个循环内检测到PCR反应物的片段；同时该技术的探针设计和特异性验证，可以保证检测结果的特异性和准确性，即只有待测靶基因才能够引起荧光信号的释放；另一方面，该技术可以通过低氧环境或具有抑制PCR酶活性的样品中（例如血浆、粪便等）进行PCR反应，其探测灵敏度可以达到1个分子级别。
四、qPCR探针法原理的应用qPCR探针法原理作为实时定量PCR技术的一种，广泛应用于生命科研、医学临床、环境监测、食品安全等领域。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种快速、灵敏及准确的基因表达分析技术，它结合了聚合酶链式反应（PCR）和荧光探针技术，可以对目标基因在样品中的数量进行定量分析。
qPCR的原理：1.制备DNA模板：通过DNA提取技术，从感兴趣的样品中纯化出目标DNA。
2.PCR反应：将目标DNA及特异性引物和酶（聚合酶）放入PCR反应体系中，进行多个温度循环，使DNA的两条链分开，随后引物与DNA链特异性结合。
3.DNA合成：引物与DNA链结合后，酶开始合成新的DNA链，双链变为双链。
4.指数增加：经过多个PCR循环，目标DNA序列指数级增加。
5.荧光检测：利用荧光物质（荧光标记的探针）与PCR产物结合，通过荧光信号检测PCR产物的数量。
6.数据分析：根据荧光信号的强度，可以定量计算出目标DNA的初始数量，并进行数据分析。
qPCR的应用：1.基因表达分析：qPCR可以快速、准确地测量特定基因在不同样本中的表达水平，从而了解基因的功能及调控机制。
2.点突变检测：通过使用特异性引物和荧光标记探针，qPCR可以检测特定突变位点的存在与否，有助于基因突变的诊断和疾病的预测。
3.病原体检测：qPCR可以快速鉴定和定量病原体的存在，对于疾病的早期诊断、疫情监测有重要意义。
4.基因组拷贝数分析：qPCR可以快速、准确地测量基因组DNA的拷贝数变化，为研究基因组结构和进化提供重要线索。
5.表观遗传学研究：qPCR可以定量测量DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学修饰的水平，有助于揭示表观遗传学的调控机制。
总结：qPCR作为一种高分辨率、灵敏度高的基因表达分析技术，在分子生物学和医学领域具有广泛的应用前景。
它可以快速、准确地定量测量目标DNA的数量，因此在疾病诊断、病因研究、基因功能分析等方面具有重要作用。
随着技术的不断发展和创新，qPCR将会在更多领域得到应用，为科学研究和临床诊断提供更多有价值的信息。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究中的技术。
它利用荧光探针或荧光染料来实现对PCR产物的定量，从而测量样品中相应基因的拷贝数。
本文将介绍qPCR的原理、步骤以及应用。
qPCR的原理：qPCR利用PCR反应体系中的DNA聚合酶，在不断复制DNA的过程中将荧光探针或荧光染料标记的探针与靶标DNA结合，并释放荧光信号量。
PCR反应过程中，荧光强度与反应体系中的DNA 量成正比。
通过荧光信号的强度，可以在PCR反应结束后测量靶标DNA的数量。
qPCR的步骤：qPCR主要分为两个步骤：反应体系的制备和实验操作。
反应体系的制备：反应体系中主要包括模板DNA、引物和荧光探针等。
引物是两个齐端互补的DNA片段，能够在相应的温度下与模板DNA进行互补配对，从而在PCR反应中扩增目标DNA片段。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光猝灭剂的DNA分子，可以与PCR产物的靶标DNA结合，通过荧光信号来定量PCR产物。
实验操作：qPCR的实验操作包括PCR反应的设置和荧光信号的测量。
在PCR 反应中，引物和荧光探针与模板DNA结合，通过PCR反应体系中的DNA聚合酶进行扩增。
在PCR反应结束后，通过荧光信号的测量来定量PCR产物。
荧光信号可以通过实时荧光定量PCR仪器进行测量。
qPCR的应用：qPCR在分子生物学和遗传学研究中有着广泛的应用。
例如：1.基因表达分析：qPCR可以对特定基因的表达进行定量，从而研究基因的表达模式和变化。
2.病毒和微生物检测：qPCR可以检测病毒和微生物的DNA/RNA，从而进行快速和准确的病原体检测。
3.遗传疾病的诊断：qPCR可以检测遗传疾病相关基因的突变和拷贝数变化，从而进行遗传疾病的诊断。
4.转基因生物检测：qPCR可以对转基因生物中外源基因的拷贝数进行检测，从而进行转基因生物的鉴定和检测。
qPCR是一种快速、准确、可重复的分子生物学技术，广泛应用于遗传学、生物医学、环境科学和农业等领域。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
啥是qpcr原理及应用
啥是qpcr原理及应用qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶链反应）是一种利用DNA聚合酶酶链反应技术来定量检测DNA浓度的方法。
该技术结合了聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量技术（RTQ-PCR），可以快速、高效地定量研究目标DNA在样本中的存在量。
在qPCR中，DNA模板经过PCR扩增后，在PCR过程中的每个循环都可以测量荧光信号的强度，从而实时监测PCR产物的累积量，进而精确定量DNA。
qPCR原理：1. DNA扩增：qPCR通过酶链反应的多个循环来扩增目标序列的DNA。
每个循环分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA被加热至解链温度使其变为单链DNA。
在退火步骤中，引物与DNA模板结合，并使其扩增产物变为双链DNA。
在延伸步骤中，DNA聚合酶以DNA模板为基础，通过在引物之间合成新的DNA链。
2. 荧光探针：在qPCR中，引物和荧光探针是必不可少的。
引物通过与DNA 模板的两端结合，指导PCR扩增的目标。
荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光信号抑制团（quencher）构成。
当荧光探针与引物结合，并经过PCR扩增过程中的延伸步骤时，荧光信号会产生。
3. 荧光信号检测：qPCR利用荧光信号来定量PCR扩增产物。
荧光信号可以通过实时荧光检测系统来测量，这个系统可以在PCR反应过程中实时记录每个循环的荧光信号强度，并以此来生成一个扩增曲线。
qPCR应用：1. 基因表达研究：qPCR被广泛应用于基因表达研究中，可以定量检测mRNA 水平的变化。
通过对目标基因和参考基因的qPCR检测，可以计算出目标基因相对于参考基因的表达量。
2. 病原体检测：qPCR在临床医学中也有广泛的应用，特别是在病原体检测中。
通过针对病原体的基因进行qPCR检测，可以准确、快速地诊断感染性疾病，并对疾病的治疗方案和预后进行判断。
3. 食品安全检测：qPCR也在食品安全检测中发挥着重要作用。
荧光定量PCR的原理及应用
荧光定量PCR的原理及应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于荧光信号的分子生物学技术，用于定量检测目标DNA序列的数量。
它结合了传统的聚合酶链反应（PCR）技术和荧光探针技术，通过检测盘细胞PCR扩增过程中产生的荧光信号的数量来确定目标序列的初始模板DNA的量。
以下是荧光定量PCR的原理和应用相关内容。
1.原理：荧光定量PCR基于PCR扩增技术，通过DNA的双链不断不断的分离和扩增，形成指数级别的增加，从而使DNA数量可检测，实现定量的目标DNA检测。
在PCR反应体系中加入DNA荧光探针，该探针含有一个荧光染料和一个阻断器。
在PCR反应中，荧光探针与引物结合，并通过荧光染料发射荧光信号。
当引物与靶DNA序列结合时，即在扩增成产物的过程中，荧光探针被水解，导致发射的荧光不再受到阻断器的遮挡，荧光信号显著增加。
通过检测PCR反应中荧光信号的强度，来确定目标序列的初始模板DNA量。
2.应用：（1）基因表达分析：荧光定量PCR可用于分析特定基因在不同组织、细胞类型或疾病状态下的表达水平差异。
通过测量目标基因的荧光信号，可以定量表达水平。
（2）病原体检测：荧光定量PCR可用于检测并定量常见病原体的存在。
例如，通过检测病毒或细菌的DNA或RNA来确定其感染程度。
（3）遗传疾病诊断：荧光定量PCR可用于检测一些遗传疾病相关基因突变的存在，并定量突变的数量。
（4）细菌或病毒负荷检测：在一些感染疾病的监测中，荧光定量PCR可用于检测和定量病菌或病毒在患者体内的负荷，可用于监测治疗效果。
（5）环境微生物分析：荧光定量PCR可用于分析和定量土壤、水样和空气等环境中的微生物（如细菌、真菌和病毒）的存在和变化。
（6）转基因分析：在转基因研究中，荧光定量PCR可用于检测和定量外源基因的存在并分析其表达水平。
（7）单细胞分析：荧光定量PCR可用于对单个细胞中目标基因或突变的检测和定量。
这对于研究单细胞的异质性和功能以及肿瘤细胞的进化和耐药性等方面的研究具有重要意义。
qpcr的原理与应用
qPCR的原理与应用一、引言qPCR（quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种能够实时监测PCR反应的分子生物学技术。
通过测量PCR反应过程中特定DNA序列的荧光信号，可以定量分析初始DNA模板的含量。
由于其高灵敏度、高准确性和快速分析能力，qPCR广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、细菌检测等领域。
二、qPCR的原理qPCR的原理是通过PCR反应扩增目标DNA序列，并利用荧光探针或SYBR Green等荧光染料实时监测PCR反应的过程。
qPCR分为两种常用的检测方法：荧光探针法和SYBR Green法。
2.1 荧光探针法在荧光探针法中，PCR反应体系中有一对互补的引物和一种与引物具有互补序列的特定荧光探针。
该荧光探针包含一个荧光物质和一个荧光淬灭物质，并且在荧光探针未与目标DNA序列结合之前，荧光物质和荧光淬灭物质之间存在着耦合作用。
在PCR扩增过程中，引物结合到模板DNA上，荧光探针与DNA序列结合并被5’-3’外切酶降解，使荧光物质与荧光淬灭物质分离，从而荧光信号得以释放。
通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进行，并计算出目标DNA序列的初始模板含量。
2.2 SYBR Green法SYBR Green法是另一种常用的qPCR检测方法。
SYBR Green是一种荧光染料，它可以与双链DNA结合并发出荧光信号。
在SYBR Green法中，PCR反应体系中只包含一对互补的引物和SYBR Green染料。
在PCR扩增过程中，引物结合到目标DNA序列上，并通过扩增产生双链DNA。
SYBR Green染料进入双链DNA内部，结合并发出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产物的量成正比，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进行，并计算出目标DNA序列的初始模板含量。
三、qPCR的应用qPCR技术在许多领域都有广泛的应用。
以下列举了一些主要领域中的应用：3.1 基因表达分析qPCR技术可以用于定量检测特定基因的表达水平。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用
qPCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种用于定量检测DNA或RNA分子的技术。
它基于传统的聚合酶链反应（PCR）技术，并添加了定量的元素，使其能够精确测量起始模板的数量。
qPCR的原理如下：首先，从待检测的DNA或RNA样品中提取目标分子，如基因或RNA转录产物。
然后，通过逆转录反应将RNA转化为互补的DNA（cDNA）。
接下来，在PCR试剂中加入引物（针对目标分子的特定序列）和荧光探针。
引物与目标序列特异性结合，PCR反应开始时，酶将引物与目标序列进行延伸。
同时，荧光探针被酶的活性降解，在PCR进行过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与每个循环中的DNA产生的数量成正比。
最后，根据荧光信号的强度，可以通过标准曲线或一些数学算法计算出起始模板的数量。
qPCR广泛应用于许多领域，包括：
1. 遗传疾病诊断：通过检测DNA中的特定基因突变或缺失，可以早期诊断和筛查遗传疾病。
2. 病原体检测：qPCR可以用于检测病原体如细菌、病毒或寄生虫等，对于疾病的快速诊断和流行病学研究非常有用。
3. 分子生物学研究：qPCR可以用于对基因表达进行研究，例如通过检测mRNA的数量来研究特定基因的转录水平。
4. 食品检测：qPCR可以用于检测食品中的致病微生物，确保食品的安全性。
5. 环境监测：qPCR可以用于检测环境中的微生物，例如污水处理厂中的细菌，以评估环境的健康状况。
总的来说，qPCR是一种快速、准确且灵敏的分子生物学技术，被广泛应用于医学诊断、基因表达研究以及环境和食品检测等多个领域。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
qpcr检测目的基因表达原理
qPCR检测目的基因表达原理一、引言1.1 背景近年来，随着分子生物学和生命科学的快速发展，人们对基因表达的研究越来越深入。
为了了解目的基因在细胞或组织中的表达水平，科学家们发展了许多方法。
其中，实时定量聚合酶链反应（qPCR）是一种常用的技术，用于检测目的基因的表达水平。
本文将详细介绍qPCR检测目的基因表达的原理及其应用。
1.2 目的本文旨在全面、详细、完整地介绍qPCR检测目的基因表达的原理和技术，并探讨其应用前景。
二、qPCR的基本原理2.1 PCR的基本原理聚合酶链反应（PCR）是一种通过体外扩增DNA片段的技术。
它基于DNA的双链结构，通过酶的作用，在复制DNA时使用适当的引物扩增特定的DNA序列。
2.2 qPCR与普通PCR的区别尽管qPCR与PCR有许多共同之处，但二者仍然有一些关键差异。
qPCR可以实时监测PCR过程中的DNA扩增，而不是在扩增结束后进行凝胶电泳分析。
这种实时监测使qPCR能够定量测定起始DNA模板的多少，并提供相对或绝对的定量结果。
2.3 qPCR的基本步骤qPCR主要包括以下几个步骤：1.模板DNA的提取：从待测样本中提取目的基因的DNA。
2.引物设计：选择合适的引物序列，以特异性地扩增目的基因。
3.反应体系的准备：根据实验设计和引物的特点，准备PCR反应体系，包括模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶和其他辅助成分。
4.PCR扩增：通过一系列变温步骤，使目的基因的DNA序列得以扩增。
5.实时监测：使用荧光染料（如SYBR Green）或探针技术（例如TaqMan探针）实时监测PCR过程中的DNA扩增情况。
6.数据分析：根据实时监测到的扩增曲线，使用合适的软件进行数据分析，计算目的基因的相对或绝对表达水平。
三、qPCR的应用3.1 表达水平分析qPCR被广泛用于分析目的基因在不同组织、细胞类型或生理状态下的表达水平差异。
通过定量测定目的基因的表达水平，可以了解其在生物学过程中的功能和调控机制。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用
PCR (Polymerase Chain Reaction)，即聚合酶链反应，是一种体外扩增特定DNA片段的方法。
qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是PCR的一种变种，能够定量测定DNA的相对数量。
PCR的原理是通过特殊的酶（DNA聚合酶）以酶链反应方式进行DNA复制。
在PCR过程中，DNA模板在高温下被融化成单链DNA，然后在较低的温度下DNA引物（也称引子）与单链DNA互补配对，DNA聚合酶利用引物为模板进行DNA复制。
这个过程重复数次，每一轮PCR产物都是前一轮产品的模板，从而指数级增加目标DNA的数量。
qPCR在PCR的基础上加入了荧光探针或SYBR Green等荧光染料。
荧光探针包括探针分子和荧光基团，通过与目标DNA 序列特异性结合，可以在PCR反应过程中产生荧光信号。
可以根据荧光信号的强度，通过标准曲线或其他定量方法计算出目标DNA在样本中的相对含量。
qPCR在许多领域有重要的应用。
在基因表达研究中，可以通过qPCR定量分析特定基因在不同生理或病理条件下的表达水平。
在疾病诊断中，可以利用qPCR检测病原体的DNA从而确定感染状态。
在遗传研究中，qPCR可以用于基因型鉴定和基因突变分析。
此外，qPCR还可以用于血性疾病的分析、食品安全监测、环境污染监测等。
总之，qPCR作为一种灵敏、特异、快速的检测技术，广泛应
用于生命科学研究、医学诊断、农业生产等领域，为我们提供了便捷和可靠的实验手段。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用qPCR原理及应用。
qPCR是一种广泛应用于生物医学领域的分子生物学技术，它可以快速、准确地定量检测DNA或RNA样本中的特定序列，因此在基因表达分析、病原体检测、药物研发等领域具有重要的应用价值。
首先，让我们来了解一下qPCR的基本原理。
qPCR全称quantitative polymerase chain reaction，即定量聚合酶链反应。
它是在传统PCR技术的基础上发展而来的，通过引入荧光探针或SYBR Green等荧光染料，可以实现实时监测DNA合成过程中的荧光信号变化，从而实现对DNA或RNA模板的定量检测。
在qPCR过程中，需要经历一系列步骤，包括DNA模板的变性、引物的延伸、荧光信号的检测等。
通过这些步骤，可以快速、准确地获得目标序列的定量信息。
在实际应用中，qPCR技术具有广泛的应用价值。
首先，在基因表达分析中，研究人员可以利用qPCR技术对特定基因的表达水平进行定量检测，从而揭示基因在不同组织、不同生理状态下的表达模式，为基因功能研究提供重要数据。
其次，在病原体检测中，qPCR技术可以快速、敏感地检测病原体的存在，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
此外，在药物研发领域，qPCR技术也可以用于评估药物对基因表达的影响，为药物筛选和药效评价提供可靠数据。
除了以上几个领域，qPCR技术还可以在植物学、微生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
例如，研究人员可以利用qPCR技术对植物基因的表达进行定量分析，揭示植物在逆境条件下的应答机制；微生物学领域可以利用qPCR技术对微生物群落的结构和功能进行定量分析；环境监测领域可以利用qPCR技术对环境样品中的微生物、污染物等进行快速检测。
总的来说，qPCR技术作为一种快速、准确的分子生物学定量分析技术，具有广泛的应用前景，为生物医学领域的研究和应用提供了重要的技术支持。
随着技术的不断发展和完善，相信qPCR技术在未来会发挥更加重要的作用，为生命科学领域的发展做出更大的贡献。
qpcr原理
qpcr原理qPCR原理。
实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种快速、准确、灵敏的核酸定量技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域。
其原理是在PCR过程中实时监测荧光信号的变化，通过检测荧光信号的强度来定量反应物的含量。
本文将详细介绍qPCR的原理及其应用。
1. PCR反应。
PCR反应是qPCR的基础，其原理是通过DNA聚合酶在不断变性、退火和延伸的循环过程中扩增目标序列。
在qPCR中，PCR反应体系中除了常规的引物和模板DNA外，还需要加入荧光探针。
这种荧光探针通常包括一个荧光素和一个猝灭剂，当探针与目标序列结合时，荧光素被释放，从而产生荧光信号。
2. 实时检测。
与传统的终点检测PCR不同，qPCR是实时检测PCR反应中荧光信号的变化。
在PCR反应过程中，荧光信号随着PCR产物的不断增加而累积，通过检测荧光信号的增加速率和终点荧光信号的强度，可以确定起始模板的含量。
3. 定量分析。
通过构建标准曲线或使用绝对定量方法，可以将实时检测到的荧光信号转化为目标序列的绝对含量。
标准曲线是通过已知浓度的标准品制备一系列稀释液，然后在qPCR中检测这些稀释液的荧光信号，从而建立荧光信号与模板含量之间的关系。
绝对定量方法则是通过已知浓度的标准品直接计算目标序列的绝对含量。
4. 应用领域。
qPCR技术在生物医学研究、临床诊断和食品安全等领域有着广泛的应用。
在基因表达分析中，可以利用qPCR技术快速、准确地检测特定基因的表达水平；在微生物检测中，可以实现对病原微生物的快速、灵敏的检测；在基因突变分析中，可以准确地鉴定目标基因的突变类型和频率。
总之，qPCR技术作为一种快速、准确、灵敏的核酸定量技术，为生命科学研究和临床诊断提供了重要工具。
通过实时监测PCR反应中的荧光信号，qPCR可以快速、准确地定量分析目标序列的含量，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用qPCR原理及应用。
qPCR全称quantitative real-time polymerase chain reaction，是一种用于测量DNA或RNA分子数量的技术。
它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在PCR反应过程中实时检测目标分子的数量，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点。
qPCR在基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域有着广泛的应用。
首先，我们来了解一下qPCR的原理。
qPCR的关键步骤包括DNA 或RNA的提取、逆转录（如果是RNA）、PCR扩增和荧光信号检测。
在PCR扩增过程中，荧光信号与目标分子的数量成正比，通过测量荧光信号的强度可以定量分析起始模板的数量。
荧光信号通常由DNA或RNA结合的荧光探针释放而产生，因此荧光信号的强度与目标分子的数量成正比。
其次，qPCR的应用非常广泛。
在基因表达分析中，qPCR可以用来检测特定基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平，从而揭示基因在生物体内的功能和调控机制。
在病原微生物检测中，qPCR可以快速、准确地检测病原微生物的存在，对于临床诊断和食品安全具有重要意义。
在基因突变分析中，qPCR可以用来检测特定基因的突变情况，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
除了以上应用外，qPCR还被广泛应用于环境监测、食品安全、法医学和生物技术等领域。
随着技术的不断发展，qPCR在生命科学领域的应用前景将更加广阔。
总之，qPCR作为一种高灵敏度、高特异性和高准确性的分子生物学技术，已经成为生命科学研究和临床诊断中不可或缺的工具。
通过了解其原理和应用，我们可以更好地理解和应用这一技术，为科研和临床实践提供更多可能性。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR, 全称为定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction），是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量方法。
通过QPCR可以准确快速地检测和定量目标核酸分子的存在和数量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传性疾病诊断等领域。
QPCR是在传统PCR技术的基础上发展而来的。
传统PCR是通过反复扩增目标DNA片段，而QPCR则在PCR的同时实时测量扩增产物的含量。
通过实时监测PCR反应中目标DNA结合荧光探针的情况，可以根据荧光信号的变化来确定PCR产物的数量。
QPCR主要基于荧光染料或荧光标记的探针的特性，通过光学检测和数据分析实现定量测量。
QPCR中常用的探针包括SYBR Green和TaqMan探针。
SYBR Green与双链DNA结合后会发出荧光，因此在PCR反应中，随着扩增产物的生成，SYBR Green与其结合，导致荧光信号强度增加。
TaqMan探针是一种双荧光标记的探针，包括一个与目标DNA序列互补的探针和两个引物。
探针上的荧光标记物与固定的荧光信号抑制剂之间的能量传递会受到PCR产物的影响。
当PCR反应中扩增产物达到特定阈值量时，会释放出荧光信号。
QPCR应用：1.基因表达分析：QPCR可以用来测量基因的表达水平，通过定量测量目标基因在不同组织、细胞类型或生理状态下的表达量差异，揭示基因在生物体中的功能和调控机制。
2.病原体检测：QPCR可以用于病原微生物的快速检测和定量分析，包括细菌、病毒和真菌等。
与传统培养方法相比，QPCR具有更高的敏感性和特异性，可以在早期诊断感染病例。
3.遗传性疾病诊断：QPCR可以用于遗传性疾病的基因突变检测和遗传风险评估。
通过检测携带突变基因的个体的基因表达水平或基因拷贝数的变化，可以进行遗传性疾病的早期筛查和诊断。
4.药物治疗指导：QPCR可以用于监测个体对药物治疗的反应。
通过检测药物代谢酶或药物靶标基因的表达水平，可以评估个体对药物的代谢能力和药物敏感性，为个体化药物治疗提供依据。
qPCR及各种定量检测技术在药理研究中的应用
qPCR及各种定量检测技术在药理研究中的应用随着现代药物研究的不断深入，各种检测技术也得到了不断的改进和创新。
其中，qPCR技术以其高灵敏度、高精确度和高通量性等优势，成为了现代药理学研究中不可或缺的检测手段之一。
本文将从药理学的角度出发，对qPCR技术及其在药理学研究中的应用进行探讨。
一、qPCR技术的基本原理和流程qPCR技术是Real-time PCR（实时荧光定量PCR）的简称。
其基本原理是：在反应中，引物与DNA结合，在特定的温度下进行扩增，同时荧光探针与DNA的结合在荧光强度上发生变化；通过检测荧光变化的时序，可以快速地准确测定起始DNA量。
qPCR的操作流程一般分为三个步骤：第一步是样品的处理，包括提取RNA或DNA、通常采用试剂盒或自制方法，常用的是QIAamp RNA/DNA Mini Kit；第二步是PCR的反应，实验所需的试剂一般包括引物、探针、dNTPs、聚合酶及缓冲液等，在这一步，荧光强度随着PCR产物的增加而增加，荧光强度与相应的DNA浓度成正比；第三步是数据分析，数据通常可以通过计算实验中的Ct值（CT value）来获得，Ct值的大小与样品中起始DNA或RNA的量呈反比例关系。
二、qPCR技术在药理学研究中的应用1、药物效应的评估通过qPCR技术，可以测定药物对特定靶点的转录水平的影响。
药物对这些mRNA的表达的影响，可能与其在细胞内的作用相相关。
举例来说，研究人员曾用qPCR技术在人体白血病细胞系中评估了药物IMatinib在BCR ABL基因转录水平上的影响。
实验结果显示，药物IMatinib对BCR ABL基因的表达水平有显著的抑制作用。
2、药物代谢的研究qPCR技术可以被用于药物代谢酶的表达水平。
很多药物代谢酶都包含在CYP450基因家族中。
研究人员常常使用qPCR技术来评估某些药物对人体内肝脏的这些药物代谢酶基因家族的影响。
实验结果表明，一些研究人员使用qPCR技术评估了青蒿素在人类体内代谢过程中的影响。
QPCR原理及应用
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
临床疾病诊断
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。
食品安全
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
科学研究
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
应用行业
各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。
qpcr仪 工作原理
qpcr仪工作原理qPCR仪是一种用于检测和定量PCR反应的仪器。
它通过测量PCR反应体系中的荧光信号来确定反应体系中的模板DNA的数量。
本文将介绍qPCR仪的工作原理及其在分子生物学研究中的应用。
qPCR仪的工作原理主要包括PCR反应、荧光信号检测和数据分析三个步骤。
PCR反应是qPCR仪的基础。
PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，通过反复进行循环性的DNA变性、引物结合和DNA 合成，最终使目标DNA序列得以扩增。
在qPCR仪中，PCR反应通常包括预变性、扩增和终止三个阶段。
预变性阶段的目的是将DNA样本中的双链DNA变性为单链DNA，使其能够与引物结合。
扩增阶段是核酸链合成的主要阶段，此时引物与目标DNA序列结合并进行扩增。
终止阶段则是为了结束扩增反应并保持PCR产物的稳定性。
荧光信号检测是qPCR仪的关键步骤。
在PCR反应过程中，荧光染料与PCR产物结合并发出荧光信号。
常用的荧光染料有SYBR Green和TaqMan探针等。
SYBR Green是一种亲核染料，可以与DNA结合并发出荧光信号。
TaqMan探针则是一种双标记探针，其5'末端连接着荧光染料，3'末端连接着一个荧光淬灭剂。
TaqMan探针与PCR产物结合时，淬灭剂被切断，从而释放出荧光信号。
qPCR仪通过检测荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
数据分析是qPCR仪的关键环节。
qPCR仪会记录下PCR反应过程中荧光信号的变化，并将这些数据转化为扩增曲线。
扩增曲线可以反映PCR反应的动力学过程，包括指数增长期、平台期和饱和期。
通过分析扩增曲线的形状和荧光信号的阈值，可以计算出PCR产物的初始数量。
此外，还可以根据不同的数据处理方法，如绝对定量法和相对定量法，来计算目标DNA的相对表达水平或绝对拷贝数。
qPCR仪在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于基因表达分析。
通过比较不同样品中目标基因的表达水平，可以研究基因的调控机制和功能。
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QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。
与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。
其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。
独特是这个微量荧光检测系统。
有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。
2. Real-time qPCR的数学原理首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。
一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。
如果从标准曲线上得到斜率（），就可以算出扩增效率（）。
一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。
效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR的种类根据real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR@Green I或者特殊设计的引物(如LUX@Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。
Taqman@探针法Taqman@探针是最早用于定量的方法。
就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
分子信标法分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。
与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
SYBR@Green 法SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
LUX@Primers法LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。
在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
4. Real-time qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量三、Real-time qPCR实验设计实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。
当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。
对于一个real-time qPCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。
组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。
现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液，比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物设计一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则：尽量靠在上游引物；长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量四、Real-time qPCR操作过程1. RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA 酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则：1. 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在 NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。
配制一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。