BIO-RAD脉冲场电泳介绍
脉冲场电泳仪参数
脉冲场电泳仪参数一、技术经济指标1、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对100bp-10Mb的DNA片段都能提供有效的分离。
2、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。
只要输入待分离DNA片段的最小、最大长度，结合10个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。
3、脉冲角度：可以在0-360°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒DNA的有效分离。
4、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。
5、多状态功能：在一个Block中可以有15个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现FIGE和CHEF两种技术。
6、二次脉冲功能：二次脉冲可加速DNA从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的DNA片段的分离，并可提高分辨率。
7、技术应用：CHEF（钳式均衡电场）技术，产生均衡电场；PACE（程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；FIGE（电场倒置）技术，为250KB以下小片断DNA提供快速分离；AFIGE（非对称场倒置）技术，精细分离小片断DNA，提高分辨率；以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。
8、性能指标：a. 电源输出：最高电压350V，0和0.6-9V/cm，0.1V/cm增量，连续可调b. 最大电流：0.5Ac. 延迟启动：最高72小时d. 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±0.5％e. 程序储存：存储20个复杂实验程序，每个程序包含8个程序模块或99个简单程序f. 数据记录：键盘，条形码读取或RS-232接口g. 显示屏：2行×40字符/行，荧光显示h. 转换范围：50毫秒到18小时i. 转换角度：0-360°，0.5°增量j. 电泳时间：最高999小时/模块k. 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定二、设备产地：国外三、参考品牌及型号：无四、资质要求：4.1投标人需在中华人民共和国境内注册，持有合法有效的企业法人营业执照。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
脉冲场电泳(PFGE)数据分析
细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)一、产品描述信息过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。
其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。
PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。
它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。
PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。
MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。
MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。
MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。
使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。
二、产品详细信息1、技术路线2、技术优势1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤(1)
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。
处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。
以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。
开始操作之前，请阅读所有指导。
把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。
可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。
提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
37℃培养14-18小时。
第一天1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS 琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。
2）加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。
3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。
4）将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。
3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。
4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。
注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。
脉冲场电泳系统Rotaphor60(中文资料).
德国Biometra的脉冲场电泳系统（Pulsed Field Gel Electrophoresis System）——Rotaphor 6.0版脉冲场电泳系统适用于分离高分子量DNA。
依靠专利的Rotaphor技术，Biometra的脉冲场电泳系统6.0版可分离最高达6,000 kb的DNA；同时，还可轻易地分辨线性和环状的DNA。
新的脉冲场电泳系统6.0版与以前的5.0版相比，不仅在硬件系统上做了较大改进，在控制软件上更是进行了一场革命。
在6.0版本中，整套系统由凝胶室（带旋转电极）、由PC编程和控制的电泳系统、电源盒P25、制冷调节器KH-4（用于外部制冷循环）等组成。
用户除了可以自定义电泳程序外，还可以选用预先储存的、针对不同分子量DNA的程序，并对它进行修改；而且在每一个电泳程序中，都有一幅照片，显示根据这一程序电泳后的实际结果。
由于使用了PC，理论上可以储存足够多的电泳程序。
除此之外，新的电泳室内部还集成了缓冲液循环泵，这样，在进行长时间的电泳时（可长达80小时），确保缓冲液的离子平衡。
Biometra脉冲场电泳系统6.0版技术参数凝胶室由14个铂金电极组成的旋转电极组可以自由旋转，最大角度达270°；内置的缓冲液循环泵；内部冷却回路，接于外置温度控制器；温度敏感探头；最多2.4 L缓冲液；丙烯酸透明玻璃安全盖（当盖子抬起时自动切断电源）；尺寸：35×47×25 cm（W×D×H）。
胶板可调整水平的支脚；20×20cm凝胶尺寸；最大18cm电泳距离；- 2 - 18齿梳子，制胶厚度为5mm 时，最大上样量约为60µl ；可选40齿梳子； 制胶框。
控制器个人计算机；操作系统Win XP ；256M 内存；40G 硬盘；40×光驱；Rotaphor 电泳槽控制界面；预装Rotaphor 6.0控制软件。
Rotaphor 6.0控制软件17组优化程序，可用于分离100bp~6,000kb 的DNA 样品；可根据分离样品类型将电泳程序分类；非常方便地调整各种参数（电极角度、电压、脉冲时间）；电泳电压范围0-225V （0-8.5V/cm ）；电泳缓冲液温度精确控制（5-22℃）；针对每一组电泳程序，都会有相应的实际电泳结果照片显示；用户分组和密码控制；全面的在线帮助；德语或英语界面（正在完成中文化！！）；用户手册。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
BIORAD电泳仪及SDS-PAGE凝胶电泳操作规范
使用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳的操作规范实验原理根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。
实验所用仪器FR-200A全自动紫外与可见分析装置上海复日科技有限公司电泳仪 BIO-RAD公司TS-1型脱色摇床江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司实验用试剂低分子量蛋白Maker TAKARA4*上样缓冲 TAKARAPagn Blue protein staining solution Fermentas试剂的配制1.贮液的配制（1）凝胶储液取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至100ml，过滤。
棕色瓶4℃保存一个月。
（2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。
再用双蒸水稀释至100ml，保存在4℃冰箱。
（3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用用4mol/l盐酸调PH至6.8。
再用双蒸水稀释至50ml，保存在4℃冰箱。
（4）10%过硫酸铵（APS）0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。
使用前新鲜配制（5）Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)）30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至1L。
每次使用时10倍稀释。
（6）样品缓冲液使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上样缓冲与样品比例1:3混匀，之后煮沸5min。
2.凝胶的配制注：上表所标体积为配制两块胶的用量。
若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。
具体步骤如下：1、样品制备：40 µL蛋白+5*上样缓冲液10 µL，煮沸5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用2、制胶1）用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净，电泳槽清洗干净，组装模具。
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程1、目的：正确使用Bio-rad 双向电泳系统，确保Bio-rad 双向电泳系统正常运行。
2、适用范围：Bio-rad 7cm/11cm/17cm双向电泳系统。
3、责任人：双向电泳系统操作人员。
4、程序：4.1、第一向等电聚焦4.1.1、准备工作及注意事项用标配的刷子小心将聚焦盘清洗干净，注意聚焦盘两端的两根电极丝，晾干后备用；根据样品使用合适的水化上样液，对于不同的聚焦盘的上样体积可参考下表：4.1.2、上样4.1.2.1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管，置室温溶解，加入合适的DTT与Bio-Lyte，充分混匀。
4.1.2.2、从小管中取出适量水化上样缓冲液与样品充分混匀。
4.1.2.3、取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
4.1.2.4、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4.1.2.5、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
4.1.2.6、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
4.1.2.7、在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
4.1.2.8、对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
4.1.3、设置程序4.1.3.1、打开电源；4.1.3.2、根据情况选择水化（REHYDRATION），预设的程序（PRESET METHOD），储存的程序（STORED METHOD），新的程序（NEW METHOD）；4.1.3.3、如果只需要水化，选择水化（REHYDRATION）选项，在接下来的界面选择主动水化或者被动水化、水化温度、水化时间；4.1.3.4、如果需要跑完整的程序，选择新的程序（NEW METHOD）, 在接下来的界面选择是否水化，并设置相应的等电聚焦程序，设置完成后，在最后的界面选择总的胶条数、限电流和聚焦温度，然后开始运行程序。
BIO-RAD双向电泳中文手册
ProteomicsBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册 ProteomeWorks TM System双向电泳实验流程z样品制备（Sample preparation）z固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）z第一向等电聚焦（IEF）z胶条的平衡（IPG strip equilibration）z第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） z凝胶的染色及检测（Detection/Staining）z PDQuest软件分析（Software analysis）z质谱鉴定（Protein identification）目 录第一章 实验材料1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3 试剂盒及其试剂1．4 化学试剂1．5 蛋白质Marker1．6 染色试剂1．7 注意事项第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章 双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置 附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4 组织样品的一般处理步骤第一章 实验材料1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存cm 163-2000 IPG预制胶条 pH 3-10，7，nonlinear（NL） 163-2002cmIPG预制胶条 pH 3-10， 7cm 163-2001 IPG预制胶条 pH 4-7，7cm 163-2003 IPG预制胶条 pH 3-6，7cm 163-2004 IPG预制胶条 pH 5-8，7cm 163-2005 IPG预制胶条 pH 7-10，7IPG预制胶条 pH 3-10，17cm 163-2007cm，nonlinear（NL） 163-2009 IPG预制胶条 pH 3-10， 17IPG预制胶条 pH 4-7，17cm 163-2008 IPG预制胶条 pH 3-6，17cm 163-2010 IPG预制胶条 pH 5-8，17cm 163-2011 IPG预制胶条 pH 7-10，17cm 163-2012 IPG预制胶条 pH 3-10，18cm 163-2032 IPG预制胶条 pH 3-10， 18cm，nonlinear（NL） 163-2033 IPG预制胶条 pH 4-7，18cm 163-2034 IPG预制胶条 pH 3-6，18cm 163-2035 IPG预制胶条 pH 5-8，18cm 163-2036 IPG预制胶条 pH 7-10，18cm 163-2037 IPG预制胶条 pH 3-10，11cm 163-2014 IPG预制胶条 pH 3-10， 11cm，nonlinear（NL） 163-2016 IPG预制胶条 pH 4-7，11cm 163-2015 IPG预制胶条 pH 3-6，11cm 163-2017 IPG预制胶条 pH 5-8，11cm 163-2018 IPG预制胶条 pH 7-10，11cm 163-2019 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，17cm163-2020163-2021 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，17cmIPG预制胶条 pH 5.5-6.7，17cm163-2022163-2023 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，17cm163-2038 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，18cm163-2039 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，18cm163-2040 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，18cm163-2041 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，18cm163-2024 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，11cm163-2025 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，11cm163-2026 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，11cm163-2027 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，11cmIPG预制胶条 pH 3.9-5.1，7cm 163-2028 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，7cm 163-2029 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，7cm 163-2030 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，7cm 163-2031 （二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml 163-1113 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml 163-1152 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163 Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193 （三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存100×ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml 163-2093 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100×，1ml 163-2094163-2095 100×ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml100×ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml163-2096163-2097 100×ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml163-2098 100×ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂Protein Assay Kit I，bovine γ-globulinstandard 500-0001standard 500-0002 Protein Assay Kit II，BSAProtein Standard I，bovine γ-globulin，1bottle 500-0005500-0006 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450mlbottle500-0007 Protein Standard II，bovine serum albumin，1standard500-0121 RC DC Protein Assay Kit I，bovine γ-globulin500-0122 RC DC Protein Assay Kit II，BSAstandard1．3 试剂盒及其试剂ReadyPrepExtractionKit 163-2100 SequentialTributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101163-2102 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial163-2103 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial163-2104 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1vialKit 163-2105 StarterReadyPrep2-DReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106DTT 163-2107 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，withBufferIIEquilibration163-2108 ReadyPrepStarterKitIodoacetamide，30g 163-2109E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg163-2110 ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 1．4 化学试剂尿素Urea，250g 161-0730 尿素Urea，1kg 161-0731Resin 142-6425 AG 501-X8（D）MixedBedCHAPS，1g 161-0460 CHAPSO，1g 161-0465 Triton X-100，500ml 161-0407 DTT（Dithiothreitol），1g 161-0610 DTT（Dithiothreitol），5g 161-0611Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101 溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g 161-0404 矿物油（Mineral Oil），500ml 163-2129 SDS，25g 161-0300 SDS，100g 161-0301 SDS，1kg 161-0302 Tris，100g 161-0715 Tris，500g 161-0716 Tris，1kg 161-0719Iodoacetamide，30g 163-2109 低熔点琼脂糖，25g 161-3111161-0717 甘氨酸，250g甘氨酸，1kg 161-0718甘氨酸，2kg 161-0724丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g 161-0100 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g 161-0101 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg 161-0103 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg 161-0107 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg 161-0108 甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g161-0200 甲叉双丙烯酰胺（Bis），50g 161-0201161-0202 PDA（Piperazine Diacrylamide），10g161-0203 PDA（Piperazine Diacrylamide），50g过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g 161-0700161-0754 过硫酸氨（Ammonium Persulfate），100gTEMED，5ml 161-0800TEMED，50ml 161-0801 甘油国产或Sigma 硫尿Sigma1．5 蛋白质Marker2-D SDS-PAGE Standards，500μl161-0320161-0303 SDS-PAGE Standards，high range，200μlSDS-PAGE Standards，low range，200μl 161-0304161-0317 SDS-PAGE Standards，broad range，200μlPolypeptide SDS-PAGE Standards，200μl 161-0326 Precision Protein Standards，unstained，1500μl，150 applications 161-0362Precision Protein Standards，prestained，500μl，50 applications 161-0372161-0325 Kaleidoscope Polypeptide Standards，500μlKaleidoscope Prestained Standards，broad range，500μl 161-0324161-0309 Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500μlPrestained SDS-PAGE Standards，low range，500μl161-0305 Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500μl 161-0318 IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250μl 161-0310 1．6 染色试剂Coomassie Brilliant Blue R-250，10g161-0400161-0406 Coomassie Brilliant Blue G-250，10gIEF Gel Staining Solution，1L 161-0434 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436161-0437 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，4×1L161-0438 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1LCoomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，4×1L 161-0439 Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786 Bio-Safe Coomassie Stain，5L 161-0787 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138 Silver Stain Kit 161-0443Kit 161-0450 PlusSilverStain1．7 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。
脉冲场凝胶电泳试验流程
脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
biorad序列电泳使用说明书
Sequi-Gen®GTNucleic Acid Electrophoresis Cell Instruction Manual Catalog Numbers165-3860, 165-3861, 165-3862 and 165-3863T able of ContentsPage Warranty Information ........................................................................Inside Front Cover Section 1 General Information (1)1.1 Introduction to Sequi-Gen GT DNA Electrophoresis Cell (1)1.2 Specifications (5)Section 2 Description of Major Parts (6)2.1 Sequi-Gen GT Parts (6)2.2 Gel Reagents and Electrophoresis Buffers (7)Path (8)2.3 ElectricalSection 3 Cleaning and Maintenance (8)3.1 Cleaning and Siliconizing Plates (8)3.2 Cleaning Plastic Parts (9)Section 4 Operating Instruction (10)Assembly (10)4.1 Before4.2 Assembling the Glass Plate Sandwich (10)4.3 Casting the Gel (12)4.4 Preparing for Operations (17)4.5 Loading the Gel (18)Electrophoresis (19)4.6 Gel4.7 Disassembly (20)Section 5 Troubleshooting Guide (22)Troubleshooter (22)5.1 Operational5.2 DNA Sequencing Artifacts (23)Section 6 Equipment and Accessories (26)6.1 Sequi-Gen GT Nucleic Acid Electrophoresis Cells and Accessories (26)Reagents (30)6.2 Electrophoresis6.3 Power Supplies and Slab Gel Dryers (31)6.4 DNA Template Purification, Sequencing, and Cloning Products (31)Handling (32)6.5 LiquidSection 7 Appendix A- Applications (32)7.1 DNA Sequencing Checklist (32)7.2 Standard Gel Protocol (33)7.3 Gel Drying Autoradiography (34)7.4 Applications for Sequi-Gen GT Nucleic Acid Electrophoresis Cell (34)Reading (35)7.5 SuggestedThe precision caster allows quick and easy gel casting without acrylamide spills or waste. By casting the gel with a syringe through the precision caster base, gels can be poured in less than 1 minute. The gel is cast with the glass plate assembly in the horizontal position. Two full-length clamps secure the assembly and allow attachment of the precision caster base to the bottom of the glass plate sandwich. A seal between the caster gasket and the plates is created without tape or grease. The gel is injected from the bottom of the glass plate sandwich (via the injection port of the precision caster base) and moves to the top of the glass plates as a dome-shaped gel front. Acrylamide spills and waste can be eliminated by controlling the flow of the gel front at the top of the glass plates.Modular AssemblyThere are four IPC dimensions to choose from, as shown in Figure 1.1. One universal base functions as the lower buffer chamber for all IPC sizes.21 x 40 cm21 x 50 cm38 x 30 cm38 x 50 cmFig. 1.1. Interchangeable sizes.1.2 SpecificationsGeneral SpecificationsBase footprint16 x 48 cmMaximum unit height65 cm (50 cm cells); 55 cm (40 cm cells); 45 cm (30 cm cells) IPC sizes21 x 40, 21 x 50, 38 x 30 cm and 38 x 50 cm(width x length)Actual gel sizes17 x 40, 17 x 50, 34 x 30 cm, 34 x 50 cmGel thickness range0.25 – 0.75 mmNominal gel volumes (0.25 mm)17 ml (21 x 40 cm); 21 ml (21 x 50 cm); 40 ml (38 x 30 cm);43 ml (38 x 50 cm)Nominal gel volumes (0.40 mm)27 ml (21 x 40 cm); 34 ml (21 x 50 cm); 50 ml (38 x 30 cm);68 ml (38 x 50 cm)Minimum upper buffer volumes500 ml (21 x 40 cm); 575 ml (21 x 50 cm); 650 ml(38 x 30 cm);1,400 ml (38 x 50 cm)Minimum lower buffer volume350 mlMaximum lower buffer volume500 mlElectrical SpecificationsElectrical Safety Certification IEC 1010-1Rated voltage limit3,000 voltsRated power limit100 wattsRated temperature limit60 ˚CElectrical cables Rated to 3,000 volts (VDC)Electrical leads Rated to 3,000 volts (VDC)Banana plugs Rated to 3,000 volts (VDC)•Rinse off all of the detergent with warm water.•Rinse with deionized water.•Wipe the cleaned plate with a large lint free tissue to dry.2.Inspect the plates carefully for pieces of detergent, dried polyacrylamide, or other particles.Rewash if necessary.3.Perform siliconizing under a fume hood, to reduce the hazard from breathing silanizingreagent. Alternatively, several non-toxic, non-corrosive glass plate coating solutions are commercially available. We recommend siliconizing or coating only the outer (long) plate, so that when the plates are separated, the gel sticks to the IPC-bound glass plate.•Use a glass Pasteur pipette to dispense 2 ml of the silanizing reagent onto the front plate. Coat the plate completely and evenly by spreading the silanizing reagent on the plate surface with a large lint free tissue, using a motion that travels from the top to the bottom of the plate.Caution: Do not siliconize the IPC plate unless hexane, heptane, or water is used as a solvent in the silanizing reagent. Other organic solvents will craze or damage the IPC plastic and weaken the adhesive bond.•Never heat an IPC in an oven. Severe damage will result to the adhesive bond. Use siliconizing compounds that react, or cure, at room temperature.Note: If the gels will be fixed or stained, the IPC (short) plate should be siliconized or coated, since its immersion into fixing or staining solutions is not recommended.4.Prior to assembling the plates, apply a small amount of ethanol to each plate and rub todryness with a tissue. Using the same tissue, clean the spacers.3.2 Cleaning Sequi-Gen GT Components1.Rinse the universal base buffer chamber, stabilizer bar, combs, spacers and precisioncaster base, gasket, syringe and tubing assembly with a mild detergent solution in warm water. Use a soft-bristled brush or sponge to remove polyacrylamide gel pieces.Note: Do not snag or break the electrode wire in the universal base while cleaning.2.Rinse thoroughly with warm water and air dry.Compatible Cleaning Agents for Polycarbonate PartsChemically compatible cleaners must be used to ensure long life of parts. These include:•Aqueous solutions of soaps and mild detergents•Organic solvents:•Hexane•Aliphatic hydrocarbons•Alcohols•Methanol•Ethanol•Isopropyl alcohol•Dilute acidsNote on Gel Bubble Formation•The following injection times (from the bottom of IPC to the top) were found to result in bubble-free gels: for 50 cm gels with 0.4 mm spacers, between 40–45 seconds; for50 cm gels with 0.25 spacers, between 50–65 seconds. Injection times of 10 secondsor less can result in bubble formation in the gel.•Bubbles can form at the gel front because of soiled areas or uneven siliconization or coating of the glass plates.•To achieve bubble free gels, thoroughly clean both plates and siliconize the outer glass plate before each use.•If bubbles begin to form at the gel front, hard tapping on top of the IPC assembly (above the bubble formation) while slowly injecting the gel solution should eliminate the bubble. Alternatively, the comb end of the IPC assembly can be momentarily lifted at an angle to facilitate elimination.10.Continue to slowly inject the gel solution until the gel solution emerges a few centimetersfrom the top of the notched (shorter) glass plate (across the entire width of the gel).Important: If pouring a 38 x 50 cm IPC, remove the support that created an incline and lay the unit level on the benchtop (use the Leveling Bubble provided). An additional 2 cm support will be needed to level the IPC assembly. Some users find it convenient to use two1.5 ml tube racks as props.When the gel is past the short plate, lay the syringe on top of IPC assembly until gel polymerization is complete. Do not remove the luer taper from the precision caster base injection port, or the gel solution will drain out of the plates. Do not adjust the syringe plunger after the gel has been cast (Figure 4.8).11.Insert the comb(s) between the plates to the desired depth.•If a sharkstooth comb is used, insert the flat edge of the comb no more than 5 mm past the short glass plate.•Clamp the comb(s) in place with three large metal binder clamps.Fig. 4.8.Syringe position for gel polymerization.•Alternatively, prior to injecting the gel solution, insert the corner of the comb to facilitate comb placement and insertion after gel casting.12.Let the gel polymerize for 30–60 minutes.•After gel polymerization, remove the luer taper from the precision caster base.•The syringe, tubing, and luer taper can be cleaned of any remaining polymerized gel solution by rinsing with hot tap water, followed by a distilled water rinse.13.Remove the precision caster base from the IPC assembly and clean the caster base andgasket of polymerized gel solution with tap water, followed by a distilled water rinse.4.4 Preparing for Operation1.Adhere a gel temperature indicator onto the outside of the outer plate, somewhere near thecenter, to monitor the gel temperature during electrophoresis.•Place the IPC assembly into the universal base, against the back wall, between the alignment tabs.2.Insert the stabilizer bar (Figure 4.9).•The stabilizer bar should slide into place with a snug fit, locking the IPC to the base in a vertical position.•The heads of the screws on the stabilizer bar should push against the front wall of the base to press the IPC clamps against the back wall of the universal base.Note: When first setting up your Sequi-Gen GT cell, adjust the screws on the stabilizerFig. 4.9.Inserting the stabilizer bar into the universal base.3.To avoid buffer spills and cell tipping accidents, adjust the leveling screws on the universalbase, as necessary.•To insure that the unit will not tip over during electrophoresis, make sure the leveling feet threaded rods are at least 1 cm deep into the threaded boss of the base.•At this time, test whether the IPC assembly is properly aligned in the universal base by attaching the top and bottom safety covers. The IPC assembly may have to be shifted to the right or the left to properly attach the safety covers. After this final alignment is complete, remove the safety covers.4.Fill the upper buffer chamber (the IPC) with running buffer (1x TBE) using the flaredportion of the panel as a fill spout.•The level of the buffer should be about 1 cm from the top of the fill spout at all times during the run.•Remove the comb(s) from between the glass plates.•Thoroughly rinse the resulting well(s) or gel front using a syringe with a needle, or disposable plastic transfer pipet (catalog number 223-9911).•If using a sharkstooth comb, insert the comb with the teeth facing the gel front. Lower the comb toward the gel surface until the teeth of the comb just touch the gel surface.5.Fill the lower buffer chamber with 350-500 ml of the running buffer. Refer to Appendix7.1 for running buffer recipes.Caution: Do not fill the lower chamber with more than 500 ml of buffer. The lower buffer chamber holds the entire volume of the upper buffer chamber should a leak develop in the IPC. Buffer levels over 500 ml will not allow the entire volume of the upper buffer chamber to be contained in the universal base.6.Attach the top and bottom safety covers and pre-electrophorese the gel at normal operatingvoltage or power (see Section 4.7), if desired, to increase the gel temperature.•Pre-electrophoresis prior to sample loading will create a uniform gel temperature and bring the gel temperature to the recommended run temperature. This will help eliminate any smile patterns from developing early in the run.Note: Gel electrophoresis buffers can be heated to 50 ˚C in a microwave before adding buffer into the upper buffer chamber. This will reduce the time needed to bring the gel to the appropriate run temperature before sample loading, and will greatly reduce pre-electrophoresis time.Warning: The upper buffer level may drop slightly due to evaporation as the system becomes warmer. Make sure that the upper chamber is always filled with buffer during electrophoresis. Do not allow the buffer level to drop below the level of the notched (shorter) IPC glass plate at any time during electrophoresis, as this may cause arcing and cell damage. Additionally, never allow the gel to exceed 60 °C under any circumstance.This excessive heat may crack the plates or cause the IPC/glass bond to deteriorate.4.5 Loading the Gel1.Turn off the power supply, and remove the top safety cover.•Rinse the well(s) with a syringe with needle, or disposable plastic transfer pipet (catalog number 223-9911), (to remove urea) before applying the samples to the gel.5.Ammonium Persulfate, 25% stock solution: 0.25 g in 1 ml distilled H2O (in a microfugetube). Make fresh daily (see Section 6.2).6. A constant power (or constant voltage) power supply (see Section 6.3).7.Slab gel dryer(see Section 6.3).8.Table top micro-centrifuge9.Gel loading syringe (e.g. Hamilton 701-SN, 28 Gauge, 1.25 inch needle)10.1.5 ml microcentrifuge tubes (see Section 6.5)11.Adjustable pipettors (e.g. Pipetman P-20, P-200, P-1000)12.Balance13.Plastic wrap14.Pipette tips, autoclaved (see Section 6.5)15.Waterbath or Temp-Block at 95 °C.16.X-ray film and cassettes (dark-room facilities)17.Filter Paper (see Section 6.3)18.Siliconizing solution or glass coating solution19.Geiger Counter20.Ice bucket7.2 Standard Gel ProtocolThe following protocol is for a standard 7 M urea, 5% polyacrylamide gel for DNA sequencing. See Section 4 for additional information on gel casting, sample loading, and gel electrophoresis. For ordering information on gel reagent and electrophoresis buffers see Section 6.bine 63 g of urea, 15 ml of 10x TBE, and 25 ml of 30% acrylamide stock solution.Bring the volume to 150 ml with distilled water (low heat may be required to dissolve the urea, but do not boil).2.Filter the solution through a 0.45 micron mesh filter (optional). Then, degas under strongvacuum 5–15 minutes to remove dissolved oxygen.3.Add 150 µl TEMED and 150 µl 25% ammonium persulfate (or one microliter of eachreagent for every milliliter of gel solution) prior to gel casting.4.Cast the gel according to procedures in Section 4.Note: Wedge spacers (see Section 6.1) increase the number of readable bases per lane in a sequencing gel. The use of wedge spacers results in a gel which becomes gradually thicker toward the bottom. As thickness increases, resistance, voltage, and DNA mobility decrease.The resulting gel has bands more closely spaced at the bottom. Wedge spacers allow the use of standard polyacrylamide solution and buffers. No alterations to the gel solution, gel casting or electrophoresis protocols are required to run DNA sequencing wedge gels.7.3 Gel Drying and AutoradiographyThe radiolabeled oligonucleotides may be visualized by a variety of techniques involving autoradiography. For the best resolution and signal intensity, dry DNA sequencing gels with a slab gel dryer.1.Transfer sequencing gels to a fresh sheet of filter paper. Wet the gel slightly by misting thegel with deionized H 2O. Lay the dry filter paper on top of the gel, and press firmly. The gel will stick to the paper. Pick up the gel by lifting the filter paper carefully from one end.2.Cover the sequencing gel with plastic wrap. Smooth out air bubbles and folds by rubbingwith a paper towel, and trim the edges to fit the slab gel dryer.3.Set Model 583 Gel Dryer to sequencing cycle. 30 minutes at 80 °C should suffice fordrying thin low percent gels, if the applied vacuum is above 28 inches of mercury or 125 torr. Refer to the dryer’s instruction manual for details.4.Autoradiograph the gel with high speed X-ray film (such as Kodak XAR) and a suitablefilm cassette. Intensifying screens are optional. If 35S radiolabel is used, the gel can be left on the outer glass plate and fixed in 1 liter of 10% acetic acid, 10% methanol for 15 minutes. This removes hygroscopic urea. The gel may then be dried on filter paper.Removal of plastic wrap before autoradiography is important because 35S is a weak beta emitter. Autoradiography of 35S labeled fragments typically requires 1–3 days. (However,we have found the fixative step unnecessary, even when sequencing with 35S.)7.4 Nucleic Acid Separation Applications for the Sequi-Gen GT Electrophoresis SystemSeveral other nucleic acid separation techniques requiring single nucleotide resolution can be conducted using the Sequi-Gen GT systems. Below is a comprehensive list. Refer to Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatas, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, or Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987,for more information and protocols.•Microsatellite Analysis•Single-Strand Conformational Polymorphism (SSCP) studies •Heteroduplex analysis •DNA footprinting •DNA fingerprinting •RNase protection assays •S1 nuclease mapping •Primer extension studies•DNA/Protein binding studies (gel shift assays)•Oligonucleotide analysis7.5 Suggested ReadingBankier, A. T. and Barrell, B. G., Shotgun DNA Sequencing. Techniques in Life Sciences, Vol. B5. Elsevier (1983).Biggin, M. D., Gibson, T. J. and Hong, G. F., Buffer gradient gels and 35S label as an aid to rapid DNA sequence determination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3963-3965 (1983).Bishop, M. J., Software for molecular biology. 1. Databases and search programs. Bio Essays1, 25-27. Deininger, P. Approaches to rapid DNA sequence analysis, Anal. Biochem., 135, 247-263 (1983). Garoff, H. and Ansorge, W., Improvements of DNA sequencing gels, Anal. Biochem., 115, 450-457 (1981).Henikoff, S. Unidirectional digestion with exonuclease lll creates targeted breakpoints for DNA sequencing, Gene, 28, 351-359 (1984).Hindley, J., DNA Sequencing, Elsevier Biomed. Press (1983).Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L. and Pace, N. R., Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6955-6959 (1985).Maxam, A. M. and Gilbert, W., Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages, Methods in Enzymology, 65, 449-580 (1980).Messing, J., New M13 vectors for cloning, Methods in Enzymology – recombinant DNA Techniques, 101, 20-79 (1983).Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P. H., A system for shotgun DNAsequencing, Nuc. Acids. Res., 9, 2871-2887 (1981).Ornstein, D. L. and Kashdan, M. A., Sequencing DNA using 35S labeling: A troubleshooting guide, BioTechniques, 3, 476-483 (1985).Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, R., DNA sequencing with chain terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,74, 5463-5467 (1977).Schreier, P. H. and Cortese, R. J., A fast and simple method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M13,J. Mol. Biol., 169-172 (1979).Staden, R., Automation of the computer handling of gel reading data produced by the shotgun method of DNA sequencing, Nucleic Acids Res., 10, 4731-4751 (1982).Tabor, S. and Richardson, C.C.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4767-4771 (1987)Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J., Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors, Gene, 33, 103-119 (1985).。
脉冲场电泳
脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。
电泳系统--Biometra
电泳系统--Biometra温度梯度凝胶电泳系统TGGE & TGGE MAXI SystemsBiometra为您提供各种核酸/蛋白质电泳设备，其中TGGE系统是独家生产的新一代产品，并享受专利保护。
该系统能够产生稳定而有效的温度梯度，基于生物大分子在不同温度下分子构象发生变化，进而发生电泳行为变化的原理，用于研究生物大分子突变、分子内或分子间相互作用、蛋白热稳定性及其他相关研究。
主要特点·用作DNA、RNA或蛋白质的快速分析·突变筛选和等位基因分析·基于水平平板PAGE的高级综合系统·微处理器控制确保精密温度梯度·高质量Peltier元件具有最好的温度重复性·快速分析、节省时间，可以同时检测三十多个样品·可选择标准运行模式和梯度运行模式·两种规格可选：TGGE(凝胶尺寸: 7.3×8cm)MAXI TGGE(凝胶尺寸: 20×22cm)应用领域·人类、动物遗传性疾病的筛选分析·检测动、植物的突变·群体研究中的序列多态性分析·RNA，蛋白质热稳定性分析·作为一项实验室研究工具·越来越多地应用在基因组研究中旋转脉冲场电泳ROFE·旋转脉冲场电泳用于分离高达几Mbp的高分子量DNA·旋转电极形成真实脉冲电场，有多种参数可调·由于胶长为20cm，因而有极高的分辨率，同时有多种梳子可选，最多可上样50个样品琼脂糖凝胶水平电泳系列·UV可透的凝胶板，各种型号梳子·模具铸塑结构保证长寿命使用·可调节支脚、水平仪、双面梳，橡胶挡条，制胶时不再使用胶带·中～宽型适用于大样本检测，一次最多可达80（40×2）个样本·中宽型和大型电泳仪均带有缓冲液循环装置。
大型胶板一次最多可检测160个样本，是多态性研究、筛选的理想之选·标准型有冷却或不冷却两种，适用多样品筛选Horizon系列水平凝胶电泳装置应用于琼脂糖凝胶电泳，以分离核酸分子。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
– Cluster according to similarity of pattern
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-XbaI
PFGE-XbaI
80 100
.E2003002160 .E2003002977 .E2003002278 .E2003002247 .E2003002231 .E2003002306 .E2003002276 .E2003002366 .E2003002399 .E2003002778 .E2003002827 .E2003002828 .E2003003026 .E2003002033
（2）细胞壁裂解，蛋白的消化
制好的胶块，可以在1天内或4天中 进行后续处理
Proteinase K
胶块在细胞裂解液和蛋白酶K溶液中 处理
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
胶块的制备:
常规的DNA制备方法 得不到完整的大分子量 DNA,因为DNA大片段很 脆弱,容易因提取过程中 的机械作用如吸打、离心 等而导致DNA的断裂。
脉冲场电泳（PFGE）的原理 普通核酸电泳的应用：
1、分子克隆-PCR产物特异性的确认
2、RNA完整性的确认 （定量PCR的验证环节）
脉冲场电泳（PFGE）的原理
﹡脉冲场凝脉电泳 (Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE),是近年 发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。
脉冲场电泳（PFGE）的应用
PFGE具有独特的分离大片段DNA的能力, 是一种分析染色体DNA强有力的工具。目前 PFGE主要应用于染色体DNA的分离、微生物基 因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋亡、酵母人 工染色体电泳分析及单向电场泳难以分辨的DNA 图谱制作等研究中。
脉冲场电泳（PFGE）的应用——分子分型
TM554 TM99 TM557 TM5b TM376 TM562 TM571 TM122 TM122 TM122 TM122 TM122 TM361 TM40
脉冲网实验室使用BIO-RAD的脉冲场电泳系统分离菌株DNA，电泳完毕后凝胶用 EB染色，然后用BIO-RAD的分辨率更高的成像仪采集和处理图像，并制成TIFF 格式， 使用带数据共享工具的Fingerprinting 软件或BioNumeric软件进行分析。该模式成功地应 用于细菌性传染疾病的溯源及监控。
﹡普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限是50 kb
﹡大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便失去了其分子筛的作 用,导致电泳带型无法分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
﹡1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离得到酿酒酵 母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞的16条完整染色体DNA。
Digest with Proteinase K, EDTA and detergent
Wash this solution out of the plug
Store in EDTA buffer until use These are usually stable for 3-4 months at 4癈
脉冲场电泳（PFGE）的原理
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓 度（%） 标 准(kb)
高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶点(kb)
0.3
1~50
0.5
0.7~25
0.8
0.5~15
1.0
0.25~12
1.2
0.15~6
1.5
0.08~4
2.0
3.0
4.0
6.0
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
Blood Concentrate White Cells
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（1） 细胞包被
Agarose
Cellular Protein
Cell Wall
DNA
所有的培养细胞用琼脂糖包被，避 免后续处理过程中DNA被剪切
琼脂糖和细胞的混合物注入制样模块 中， (1.5mm x 10mm x 5mm)，凝固 后，胶块可以从制样模块中取出。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1, 000 bp之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高 ，孔隙越小，其分辨能力就越强。
Mix cells with Low Melt agarose and harden in mold (be sure to use certified agarose when doing restriction digestions)
Digestion of cell walls using lysozyme, lyticase, chitinase, etc...
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（3） DNA的酶切
16hr
Rare Cutting Restriction Enzyme
用不常用的限制性内切酶消化 DNA，产生15-20 条带，可以清 楚的鉴别亚型
（4）上样、电泳
(Side view of agarose
gel)
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA。
低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大片段的剪切作用,因而细 胞裂解所释放的DNA大片段包埋在胶块中。制作好的样品插块可以在电泳时直接 插入加样孔中。
这种电泳技术促进了癌症研究、食品安全、公共健康、品质 控制和基因组作图的进步。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
普通核酸电泳
PFGE
BIO-RAD 脉冲场电泳的型号选择
Pattern Comparison
• BioNumerics Computer Software
– Create dendrograms
65
8.0
60~400
160
45
12.0
40~200
70
20
15.0
25~150
60
15
20.0
6~1004512源自脉冲场电泳（PFGE）的原理
在 凝 胶 电 泳 中 或 后 ， 加 入 溴 化 乙 锭 （ Ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置 在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中 DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的 微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。
Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium
项目 方法依据 方法举例
优点 缺点
表型分型
分子分型
表型特征
遗传特征
生物分型、血清分型、噬菌体分 型、耐药性分析
成熟可靠的数据库，作为初级分 型仍在常规使用
质粒分型、PFGE、核糖体分型 、基于PCR方法、基于测序方法 （MLST、VNTR、MLVA）
高分辨率，可重复性，易于标准 化及自动化
低分辨率、不可重复，并不适用 于所有病原体
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（5） 染色，观察结果
DNA用EB 染色，在紫外下 观察结果。