叶绿素a测定

实验三 富营养化湖中藻量的测定（叶绿素 a 法） 、实验目的

富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中

10微克 /升。

本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素 a 浓度，以考查其富营 养化情况。 二、器材与用品

分光光度计（波长选择大于 750nm ，精度为0.5— 2nm ）。

蔡氏滤器；滤膜（ 0.45 微克，直径 47mm ）。

的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素

a 浓度常大于

1、 2、 比色杯（ 1cm ； 4cm ）。 3、 台式离心机（ 3500r/min ）

4、 离心管（ 15ml 具刻度和塞子） ；冰箱

5、 匀浆器或小研钵。

6、 7、 真空泵（最大压力不超过 300kpa ）。

MgC03悬液：Ig MgC03细粉悬于100ml 蒸馏水中。 90％的丙酮溶液： 90 份丙酮＋ 10 份蒸馏水。

10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各 2L.

三、方法和步骤

8、 9、

1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml ,池塘

300ml 。采样点及采水时间同“浮游植物” 2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤

剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素

a 分解。

3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取 500ml 减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入 0.2ml MgCO 3

悬液、摇匀直至抽干水样。加入 MgCO 3 可增进藻细胞滞留在滤 膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素 a 被分解。如过滤后的 载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷

（4C ）暗处保存，放置时间最多不能超过 48小时。

4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加 2 - 3ml90 %的丙 酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻 度离心管中，用 5ml90%丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加 90%丙酮，使管内总体积为

10ml 。塞紧塞子并在管子外部罩上

遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取 18－24小时。

离心10min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管 中，塞上塞子，3500r/min 在离心10min 。正确记录提取液的体 积。

6、测定光 密度：藻 类叶绿素 a 具有其 独特的吸 收光谱 (663nm )，因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取 液移入 1cm 比色杯中，以 90％的丙酮溶液作为空白，分别在 750、663、645、630nm 波长下测提取液的光密度值( OD )。注 意：样品提取的 O D 663值要求在 0.2与 1.0 之间，如不在此范围

50－ 5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上 3500r/min ，

内，应调换比色杯，或改变过滤水样量。OD663小于0.2时，应

该用较宽的比色杯或增加水样量；OD663大于1.0时，可稀释提

取液或减少水样滤过量，使用1cm 比色杯比色。

7、叶绿素a浓度计算：将样品提取液在663、645、630nm波长

下的光密度值( OD663 OD645 O D 630)分别减去在750nm 下的光密度值( OD750) ,，此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿

素 a 浓度计算公式如下：

(1)样品提取液中的叶绿素a浓度Ca为:

Ca(微克/升)=11.64 (OD663 —OD750)—2.16 (OD645 —OD750)

+0.1(OD630－OD 750

(1) 水样中叶绿素a浓度为: 叶绿素a(微克/升)=Ca x v/(V x L)

叶绿素a(微克/升)=Ca x v/V x L

Ca:样品提取液中叶绿素a浓度（微克/升） v : 90%丙酮提取液体积（ml）

V :过滤水样的体积（L）

L :比色杯宽度（cm）四、实验报告将测定结果记录于表4-1中

表4—1测定结果

根据测定结果，参照表4-1中指标评价被测水样的富营养化程度。

表4-2湖泊富营养化的叶绿素a评价标准

五、思考题

1、比较两种水样中的叶绿素a浓度，通过本实验你的结论是什么？

2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性？主要应注意哪几个方面的问题?