植物细胞培养

植物细胞培养

一、定义

●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振

荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。

●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然

产物的主要来源。

●植物细胞培养具有以下优点：

1、提高产率

2、缩短周期

3、提高产品质量

4、易于管理，减轻劳动强度

因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。

二、培养基

常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基

三、单细胞培养

1、制备方法

（1）机械法（机械磨碎、切割）

（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）

（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）

2、培养方法

（1）平板法（似微生物平板培养）

（2）看护培养与饲养层培养法

看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。

饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。

（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。

（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。

①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。

②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。

③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。

④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。

3、保存

（1）继代培养（高等植物、海藻等）

（2）低温（ 5℃～10℃）

（3）冷冻（ -20℃或液氮）

植物细胞冷冻保存方法：

在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。

植物细胞冷冻保护剂组成：

7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖

四、植物细胞培养的应用

1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等）

2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等）

3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂）

4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等）

五、植物细胞的生物反应器大规模培养

1、培养特性

（1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染）

（2）培养液流变特性（黏度增高）

（3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）

（4）泡沫与器壁表面黏附性（气泡增多、黏度大、易黏附，可用硅油、脂肪酸酰胺等消除）

（5）悬浮细胞生长与增殖（静止期前继代）

2、培养过程

（1）细胞的驯化、筛选与细胞株的建立

愈伤组织诱导与培养→单细胞分离→细胞无性系分离→细胞株筛选

（2）扩大培养

采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器培养的种子细胞。

（3）生物反应器培养

3、植物细胞大规模生物反应器培养

搅拌式、鼓泡式、气升循环式

4、植物细胞的生物反应器高密度培养

例：培养紫草细胞、水母雪莲细胞

5、植物细胞生物反应器培养存在的主要问题

生长缓慢；次级代谢物含量低；培养细胞不稳定等；多数产物积累于胞内；不耐受剪切力。

必须首先解决的重要问题：细胞生长及代谢途径基础研究、反应器结构与工艺优化

六、植物细胞两相培养技术

两相培养技术——在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了连续培养。这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。

两相培养系统满足条件：

1、添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞生长。

2、产物能比较容易被有机物吸附或溶解于有机相中。

3、两相容易分离

4、有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。

七、植物细胞的生物反应器固定化培养

细胞固定化——将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。

常用的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等。常采用包埋法，可以采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻胶、白明胶等作为包埋剂。

八、植物细胞培养存在的问题与发展趋势

1、存在问题

（1）技术问题

生物反应器设计缺陷多

细胞易聚集分层、易变异

放大培养不足

（2）经济方面

成本高、工业化经济效益低

2、发展趋势

（1）高效细胞系的筛选

（2）发展大规模细胞培养所用的培养基，降低成本

（3）开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统

（4）两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术

（5）对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系进行基础研究