宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用

宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用

感染性疾病一直是世界范围内疾病主要致死原因之一。WHO监测统计数据显示，在2016年全球约5690万例死亡患者中，有3项感染性疾病（下呼吸道感染、腹泻病、结核病）位列前10大死因，共造成的死亡数约占总死亡数的10%，其中下呼吸道感染造成约300万例患者死亡，腹泻病造成约140万例患者死亡，结核病造成约130万例患者死亡。感染性疾病的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，而在目前的临床微生物检测工作中，微生物实验室对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪即开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测（例如PCR）、分子免疫学检查（例如ELISA）等检测手段，这使得临床医生对感染性疾病的病原学诊断、病情评估及治疗方案制定等存在许多困难。目前仍有约60%的感染性疾病病例的病原体是诊断不明的。由于宏基因组测序（mNGS）对病原学诊断具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原学诊断之中。在此，我们回顾了近些年宏基因组测序在病原学诊断中的临床应用进展情况。

１．临床宏基因组学

宏基因组的概念最早在1998年被学者提出，指在一份独立的土壤标本中，所有微生物的基因组信息的总和，包括那些无法培养的生物体的基因组信息。后来，宏基因组的概念不仅仅局限于描述环境来源的标本，还被逐渐沿用于描述临床来源标本中的生物遗传信息特征。临床宏基因组学指为获取临床相关的微生物信息而对临床来源的标本中所有的核酸序列进行测序分析的一门学科间。宏基因组测序主要是通过以新一代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性、毒力等一系列生物信息。由于宏基因组测序不依赖病原体培养结果且可以不对可疑病原体的标志核酸序列进行靶向扩增，这使得检测结果更具客观性和全面性，且更迅捷，这是对传统实验室检测手段的有效补充。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》也指出临床宏基因组学能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，

临床宏基因组学应用于临床病原体诊断正变得更加全面、廉价、高效及准确.

目前基于宏基因组测序的微生物分类检测技术主要包括以下两种：靶向扩增测序（Targeted-amplicon Sequencing）和鸟枪宏基因组测序（Shotgun Metagenomics Sequencing）。

靶向扩增测序是指对目标病原体的具有物种特异性的标志核酸序列进行测序分析以鉴别具体病原体种类，这要求操作者对目标病原体的可能分类要有初步的概念，并且针对不同种类的病原体选择不同的序列目标，例如16s rRNA对应于细菌和古生菌，18S rRNA对应于真核生物，ITS（Internal Transcribed Spacer,内转录间隔区）对应于真菌等。靶向扩增测序首先需要收集临床检测标本，之后对标本中的DNA进行提取并纯化，获得包含微生物核酸以及人源核酸的混合物，再以微生物目标基因序列为样本靶向扩增出包含对应序列的DNA序列，然后将扩增后的DNA序列碎片化后再行高通量测序。由于靶向扩增测序无法呈现宏基因组中的全部基因组信息，这使得其对临床病原体的检测存在一定的偏倚性和局限性，但是靶向扩增测序具备特异性高、标本量需求低、实验室操作相对简单、花费相对低等优势，且不受人源遗传信息的影响，所以它仍适用于除病毒感染外的病原体分类预估把握相对高、临床标本中病原体核酸含量低或者人源遗传信息含量高的病例。

另一方面，鸟枪宏基因组测序是指对样本中所获得全部核酸序列无偏移地进行测序分析，其主要流程同样包括收集临床检测标本以及核酸的提取和纯化。由于标本中可能含有RNA，如需同时评估该RNA对应的病原体信息，需要将其转变为对应的cDNA。然后将含有病原体核酸、人源核酸以及可疑污染物的核酸的混合物直接碎片化并行高通量测序，因而可以获得病原体更加全面而详细的遗传信息，且无需针对可疑病原体进行预先评估和特异性准备，尤其适用于怀疑病毒感染、病原体诊断困难及爆发感染等的病例。但是鸟枪宏基因组测序结果中包含了人源核酸序列以及可疑污染物的核酸序列，对这些测序结果更精确解读的需求也对测序技术的生物信息学分析提出了更高的要求。

除了宏基因组测序具备的病原体检测无偏倚性的本质特点之外，其相较于传统检测手段最大的优势是更短的时间。目前宏基因组测序明确病原体遗传信息的时间一般不超过48小时，这明显短于传统病原学检测方法所花费的时间（平均

约3-5天）更短的周转时间意味着临床医生可以更快地评估病原体并尽早实施适当的治疗方案，这对减少广谱抗生素的使用及降低患者病死率都有着极大的益处。

2.宏基因组测序在临床感染性疾病病原诊断中的应用

目前已有不少应用宏基因组测序成功对临床感染性疾病患者进行病原学诊断的研究报道，且相关研究报道的数量正在不断增加。目前研究所涉及的感染性疾病主要包括呼吸道感染、中枢神经系统感染、血流感染、骨关节感染、消化系统感染、泌尿系统感染以及眼内感染等诸多方面，且涉及范围和内容正不断延伸拓展。尤其在一些存在免疫缺陷的感染患者，传统检测手段反复裣测仍无法明确病原体及新型或罕见病原体感染的案例中，宏基因组测序正不断显示出其特有的优越性。

2.1在呼吸道感染病原诊断中的应用

呼吸道感染是感染性疾病中最主要的致死原因，仅仅依靠培养等传统检测手段使得其病原体诊断存在诸多困难。有学者回顾性研究了511份临床来源的呼吸道样本，对其进行宏基因组测序以检测病原体类型并同步对比微生物实验室培养，结果显示宏基因组测序具备更高的病原学诊断敏感性，且受前期临床抗生素使用的干扰影响更小。该临床研究显示：宏基因组测序应用于感染性疾病的病原体检测确实存在相当的优势，有望在未来的临床工作中进一步推广。

临床上不同类型的病原体检测难易度不尽相同。其中，病毒是呼吸道感染的主要病原体之一，但由于其有着种类多、变异快、实验室无法直接培养等特点，目前临床检测手段仍相当有限。呼吸道相关病毒几乎可感染所有年龄段的宿主，且在婴幼儿中的流行尤为严重，其中应用宏基因组测序对儿童患者进行病原体诊断正获得越来越多的重视。早在2009年的一项研究中，研究人员采集了流感流行期间不同患者的5份鼻咽分泌物标本及3份排泄物标本，并应用宏基因组测序技术成功在所有标本中都检测出了流感病毒（或诺如病毒）的核酸序列，其结果与同步进行的RT-PCR验证结果一致。在近期的多项临床研究中，宏基因组测序对呼吸道病毒感染的诊断均显示出其相较多重PCR、呼吸道病毒检测芯片等检测方法有着更高的检出率，且能发现被遗漏来检出的病毒，这主要得益于宏基因组测序的无偏倚性和高效性。

病毒也常常是医院获得性肺炎的致病病原体，且常常因为无法及时确诊而影