测定糖化酶活性的方法

次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地 (1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用 Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出 未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化 所产生的C6H12O6 的含量。

注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此， 1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组 和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减 就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的 量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从 而计算出酶活。
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意: 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化 C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置 15min后加入2mol/L硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
（4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液
源自文库

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

（5）2mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷 却后定容至l00ml，摇匀。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O) 24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳 定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至 1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中 密封保存，配制后应放置一星期标定使用。 （7）0.5%可溶性淀粉：称取0.5 g可溶性淀粉，用 少许水调匀，倾入80 ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却 后定容至100 ml。
N——硫代硫酸钠的当量浓度。 180.1——葡萄糖的摩尔质量。


8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。 60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。

（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μ mol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯 上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4Glucan glucohydrolace)。多应用于酒精、淀 粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以 及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种 （Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖 化酶是食品工业中常用的一种酶。

具体步骤
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI
3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发 生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。

反应试剂配制方法




（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量 蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容 至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL， 摇匀，贮存于棕色瓶中。

对照组
I2 NaIO
实验组
I2
NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：


酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2） × 180.1×（8/5）×2×（60/10）
式中: B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；


A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；

糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外 酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的 非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。

酶活测定方法
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法 （ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯 酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 等方法。
我们采用次碘酸钠法来测定糖化酶 的活性。

糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范 围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生 成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间 内分解α –１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量 为酶的活力单位。