测定糖化酶活性的方法
糖化酶发酵、提取及活力测定
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。
淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性的测定一、原理淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。
淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。
几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。
Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。
根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。
本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。
（三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。
盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
糖化酶活力测定
糖化酶活力测定1.定义1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。
2.原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。
3.试剂和溶液（1）乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH为4.6）。
称取乙酸钠（CH3COONa·3H2O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）2.6ml，用水定容至1000ml。
配好后用pH计校正。
（2）硫代硫酸钠标准溶液（Na2S2O3，0.05mol/L）。
（3）碘溶液（1/2I2，0.1mol/L）。
（4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1mol/L）。
（5）200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
（6）硫酸溶液（2mol/L）。
（7）20g/L可溶性淀粉溶液。
（8）10g/L淀粉指示液。
4.仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5.步骤（1）待测酶液的制备称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。
沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。
通过4层纱布过滤，滤液供测定用。
（2）测定于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。
在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。
糖化酶
我国糖化酶的研究概况糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
主要的内容包括：一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。
它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。
但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。
三、糖化酶的特性1、糖化酶的热稳定性在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。
工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。
一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。
实验十四糖化酶活力的测定
实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
关于糖化酶的应用
关于糖化酶的应用
1．我们的糖化酶活力是100000单位/毫升（国标法测的），杰能科和诺维信的糖化酶酶活的测定是由他们自己的方法测的，我们用国标法测定过他们酶活，杰能科和诺维信均为10万单位以上。
单独的糖化酶讲，诺维信的敲除了转甘酶基因，没有转苷酶活性。
杰能科的有较低的转甘酶活性，我们的和杰能科相同。
2．糖化的要求和标准;
1).糖化酶的选择：有二种糖化酶；1，单独糖化酶（如我们的糖化酶）2，
复合糖化酶(糖化酶加普鲁兰酶)。
2）底物的浓度：淀粉液化时的淀粉浓度在30%--35%（质量分数）左右。
3）酶的添加量：酶添加量大可以加快糖化速度，缩短糖化时间。
单独糖化酶的作用结果使其葡萄糖的DX值最高只能达到95%左右，再配合普鲁兰酶的复合糖化酶其DX值也不会超过97%。
单独用糖化酶增加用量只能缩短糖化时间，因为转苷酶也增大，其逆反应也增加了。
4）糖化时间控制：糖化时间由酶的添加量决定。
合理的糖化时间是给酶和淀粉充分反应时间将淀粉彻底分解，时间太短，酶没有充分作用糖化不彻底DX值不高；时间太长，葡萄糖的逆反应增强，产率也下降。
试验证明：考虑葡萄糖产率和酶制剂成本，糖化时间控制在36—48小时为好。
糖化结束立即灭酶，终止反应，抑制逆反应，达到稳定DX值目的。
以上资料来源于杰能科公司段钢老师
供参考，结合工厂实际，即设备、工艺、产品目标等条件应用。
杨建国。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9)UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
酶活力测定的原理和方法
• 3、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白质生 成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基， 用0.1N NaOH滴定生成的氨基酸的量，从 而测定酶活力。
• 4、DHT—酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮盐将酪 蛋白中部分组氨酸和酷氨酸重氮化，得到黄色 的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以 DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生 成DHT-肽。二价镍离子可与DHT-蛋白及DHT-肽 形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅 速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合 适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂， 利用比色法可测定蛋白酶活力。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
十、胰蛋白酶的活力测定
• 测定时，取底物溶液3.0mL，加盐酸 （0.001mol/L）0.2mL混匀，作为空白。取供 试品溶液0.2mL与底物溶液（预热至25±0.5℃） 3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度 保持在25±0.5℃，在253nm波长处，每隔30s 读吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间 为横坐标作图，取在3min内成直线部分的吸收 度计算分析。
• 1、福林—酚法：蛋白酶催化蛋白质水解 生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨 酸、色氨酸等)与福林—酚试剂反应，生
成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸
的量成正比，从而测定其活力。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)精选全文
可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
糖化酶执行标准
糖化酶执行标准本标准规定了糖化酶的酶活力定义和测定方法、酶活力单位定义、糖化酶的活性范围、糖化酶的底物特异性、糖化酶的活性稳定性、糖化酶的存储条件及保质期、糖化酶的外观及物理性质、糖化酶的使用方法及注意事项。
本标准适用于糖化酶的生产、检验和使用。
1.酶活力定义和测定方法糖化酶的酶活力定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
糖化酶活力的测定方法为：将一定量的糖化酶加入底物溶液中，在规定的温度和时间下反应，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定反应生成的葡萄糖含量，计算出酶的活力。
2.酶活力单位定义糖化酶的酶活力单位（U）定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
3.糖化酶的活性范围糖化酶的活性范围为：适宜温度范围为40℃-85℃，适宜pH范围为4.0-6.5。
4.糖化酶的底物特异性糖化酶的底物特异性为：能水解淀粉的α-1,4-葡萄糖苷键，生成葡萄糖，但不能水解纤维素和其他多糖。
5.糖化酶的活性稳定性糖化酶的活性稳定性为：在规定的储存条件下，糖化酶的活力保持稳定，有效期不低于2年。
6.糖化酶的存储条件及保质期糖化酶的存储条件为：密封、干燥、阴凉、避光。
糖化酶的保质期为：在上述存储条件下，有效期不低于2年。
7.糖化酶的外观及物理性质糖化酶应为无色至淡黄色的固体或液体，无异味。
其物理性质包括：相对分子质量低于100kDa，溶解性良好，不溶于有机溶剂和水。
8.糖化酶的使用方法及注意事项使用方法：将所需用量的糖化酶加入底物溶液中，搅拌均匀，按照规定的温度和时间进行反应。
反应结束后，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定生成的葡萄糖含量。
根据测定结果计算出糖化酶的实际用量。
使用时应遵守使用说明和安全规定。
注意事项：操作时应避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。
储存和使用时应避免污染和交叉污染。
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
9 糖化酶活力测定
（2） C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定溶液
配制：
称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)13g和碳酸钠0.1g（硫代硫酸 钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2）， 定容至1000mL，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封 保存，配制后应放置一星期标定使用。
第九型淀粉酶（一类酶）：将淀粉水解成麦芽 糖或葡萄糖，包括以下几种：
淀粉 β-淀粉酶： 淀粉-β-1，4-麦芽糖苷酶 淀粉
糖化酶： 淀粉-α-1，4-葡萄糖糖苷酶
麦芽糖
淀粉 异淀粉酶： 淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（真菌淀粉酶） 麦芽糖
葡萄糖
概述
糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵 提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非 还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢 水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。 本产品广泛用： 生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发 酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵； 生产各种规格的葡萄糖。 总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都 可适用。
（4）分别取上述反应液与空白液各5mL，放入 250mL碘量瓶中，准确加入C(1/2 I2)=0.1mol/L标 准碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，摇 匀，暗处放反应15min。 （5）取出，加入c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 2mL，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时， 加入几滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色为终 点。
目的
学习糖化型淀粉酶（或液体曲酶）活力的 测定方法 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的 指导意义
测定糖化酶活性的方法
测定糖化酶活性的方法测定糖化酶活性的方法是通过测量糖化酶在一定条件下催化底物转化为产物的速率来确定其活性的一种实验方法。
糖化酶活性可以反映糖化酶催化糖化反应的效果和能力，因此在糖化酶的研究和应用中起到重要的作用。
下面将介绍几种常用的测定糖化酶活性的方法。
1. 连续监测法（Continuous Monitoring）连续监测法是一种通过连续监测糖化酶催化反应中底物消失或产物生成的速率的方法。
常用的连续监测方法包括紫外吸收光谱法、荧光分光光度法和电化学法等。
紫外吸收光谱法是利用糖化酶催化反应底物或产物在特定波长下的吸光度改变，通过测定光强变化来间接测定糖化酶活性。
荧光分光光度法是通过测定糖化酶催化反应中产生的荧光物质的荧光强度变化来测定糖化酶活性。
电化学法是利用糖化酶催化反应中产生的电流变化来直接测定糖化酶活性。
2. 间断监测法（Discontinuous Monitoring）间断监测法是一种通过在催化反应开始与结束时测定底物或产物的浓度变化来测定糖化酶活性的方法。
常用的间断监测方法包括酶抑制法、血红蛋白法和多糖沉淀法等。
酶抑制法是通过在糖化酶催化反应中添加一种特定的抑制剂，抑制糖化酶的活性，然后在一定时间内测定抑制前后底物或产物的浓度变化，从而间接测定糖化酶活性。
血红蛋白法是通过测定糖化酶催化反应中产生的血红蛋白含量的变化来测定糖化酶活性。
糖化酶可以将底物中的血红蛋白逐步降解，通过比较血红蛋白的降解速率来测定糖化酶活性。
多糖沉淀法是通过将糖化酶催化反应中的产物与多糖结合形成沉淀，然后通过测定沉淀的质量来测定糖化酶活性。
3. 反射光度法（Reflectance Photometry）反射光度法是一种通过测量糖化酶催化反应中产生的反射率变化来测定糖化酶活性的方法。
在糖化酶催化反应中，底物被转化为产物后，产物的光学性质会发生变化，测量其反射率的变化可以确定糖化酶活性。
总之，测定糖化酶活性的方法很多，选择合适的方法应根据实验的具体目的、测量条件、仪器设备和操作方便性等因素来综合考虑。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
实验三酶的固定化
•
•
• 二、实验材料、仪器与试剂
• （一）实验材料与仪器
• 干燥箱；电子天平；注射器；碘量瓶；磁力搅拌器；pH 计；恒温水浴锅等。
• （二）主要试剂
• 糖化酶；3%海藻酸钠溶液；2%氯化钙溶液。 2％可溶性 淀粉液； pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液； 0.1mol／L碘 液； 0.1mol／L氢氧化钠溶液； 1mol／L硫酸溶液； 0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液； 0.5％淀粉指示剂。
• 四、实验数据基本要求 （一）酶活力计算
在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。
（二）固定化酶活力回收率计算
固定化酶总活力 活力回收率= 游离酶总活力
（三）固定化酶比活力计算
•
三、实验内容
• （一）固定化酶的制备
• 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 • 2、取糖化酶2g，悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 • 3、用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中，浸泡20 min 左右。 • 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶。置 于4℃冰箱中冷藏备用。
• 实验三
酶的固定化
• 一、实验基本原理 • 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙பைடு நூலகம்液。 形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成 固定化酶。 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）活性测定原理：在一定条 件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂 次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减 少量计算葡萄糖的量，从而计算算酶活力。
• （二）糖化酶活力测定
• 1、吸取2%可溶性淀粉10ml，加入pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液5ml，混匀后 于40℃水浴预热10min。 • 2、加入酶液1ml（空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液），于40℃，反 应10min。反应结束时，于沸水浴中煮10min，以终止反应。 • 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol／L碘液及0.1mol／L氢氧化 钠溶液各5ml，摇匀，于室温下在暗处放置15min，加入2ml硫酸酸化。 • 4、以0.5％可溶性淀粉为指示剂，用0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色 消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数（A），以及空白实验消耗的 硫代硫酸钠溶液毫升数（B）。
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酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量 蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容 至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL， 摇匀，贮存于棕色瓶中。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外 酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的 非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
具体步骤
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI
3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发 生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意: 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化 C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置 15min后加入2mol/L硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
（4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液
称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。
（5）2mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷 却后定容至l00ml，摇匀。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O) 24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳 定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至 1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中 密封保存，配制后应放置一星期标定使用。 （7）0.5%可溶性淀粉：称取0.5 g可溶性淀粉，用 少许水调匀，倾入80 ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却 后定容至100 ml。
次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地 (1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用 Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出 未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化 所产生的C6H12O6 的含量。
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯 上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4Glucan glucohydrolace)。多应用于酒精、淀 粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以 及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种 （Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖 化酶是食品工业中常用的一种酶。
酶活测定方法
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法 （ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯 酚葡。
我们采用次碘酸钠法来测定糖化酶 的活性。
糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范 围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生 成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间 内分解α –１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量 为酶的活力单位。
对照组
I2 NaIO
实验组
I2
NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此， 1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组 和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减 就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的 量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从 而计算出酶活。
N——硫代硫酸钠的当量浓度。 180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。 60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μ mol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2） × 180.1×（8/5）×2×（60/10）
式中: B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；