化学文献及查阅方法

双水相萃取分离技术的研究

摘要：双水相萃取技术是一种较新的生物分离技术，近年来发展较快，由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。双水相萃取技术的应用和发展日益受到重视。本文综述了双水相萃取技术的基本原理、特点、影响及应用，并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。

关键词：双水相萃取；分离纯化；生物物质；

前言：与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点[1]，已经越来越受到人们的重视。

Beijeronck在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。双水相萃取（Aqueous two-phase extraction,ATPE）技术真正应用是在20世纪60年代，1956年瑞典轮的大学的Albertsson将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。1979年德国Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。迄今为止，被成功应用于生物医药工程，天然产物分离陈华，金属离子分离等方面[4-6]。因其广泛的应用性，已经发展成为一种相对成熟的技术，但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。

一、双水相萃取原理[7]

双水相萃取与水有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：

K=C

上/C

下

其中K为分配系数，C

上和C

下

分别为被分离物质在上、下相的浓度。

分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双

水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。

二、双水相萃取技术的特点

双水相萃取成为新兴生物技术产业研究的热点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势。双水相体系萃取技术具有如下特点：

(1)双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高，相对于某些分离过程来说，能耗小，速度快。

(2)含水量高(70 %～90 %)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，会引起生物活性物质失活或变性；

(3)分相时间短，自然分相时间一般为5～15min；

(4)相体系的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离条件温和，因而会保持绝大部分生物分子的活性，而且可直接用在发酵液中。如潘杰等人用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离、纯化[8]；

(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；

(6)易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。Albertson 证明了分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用有位有利；

(7)易于进行连续化操作[9]，设备简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；

(8)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体伤害很小以至基本无害；

(9)影响双水相体系的因素比较复杂，从某种意义上说，可以采取多种手段来提高选择性或提高收率；

(10)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；

(11)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的专一性。

由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

三、影响双水相分离的主要因素[10-11]

影响双水相萃取平衡的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的离子浓度、pH值、温度等。不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐糖<葡萄糖<羟丙基葡聚糖<甲基纤维素<聚乙二醇<聚丙三醇，这种疏水性的差异对目的产物互作用是重要的。

PEG分子量：同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加，这是由于分子链的长度增加，其所包含的羟基减少。两相亲水差距越大，其大小的选择性依赖于萃取过程的目的和方向。对于PEG聚合物，若想在上相收率较高，应降低平均分子量，若想在下相收率较高，则增加平均分子量。

pH值：（1）pH值会影响蛋白质分子中可解离集团的解离程度，因而改变蛋白质所带的电荷的性质和大小，这是与蛋白质的等电点相关的；（2）pH值能改变盐的解离程度（如磷酸盐），进而改变时间电位差。

萃取温度：温度首先影响相图，在临界点附近尤为明显。但当远离临界点时温度影响较小。大规模生产常在常温操作，但较高升温还是有利于降温体系黏度，有利分相。

无机盐浓度：盐的正、负离子在两相分配系数不同，两相间形成电位差，从而影响带电生物大分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两相间的电位差。

四、双水相萃取技术的应用进展

1.在生命科学中的应用

传统的液液萃取分离，由于使用了有机溶剂，通常会使生物大分子（如蛋白质等）失活。而双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和，易操作，可调节因素多，目前已成功应用于生命科学中蛋白质、生物酶、细胞器、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分离纯化。双水相萃取技术在生命科学中的应用，国

内外的研究都取得了很多丰富的成果。如Miyuki[12]通过PEG/ K

3PO

4

双水相体系，

用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG 1500 (第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。张志娟等