空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生质体的制备与再生

第41卷第2期2014年4月

植物保护学报

ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA

Vol．41No．2Apr．2014

基金项目：安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（12B1122）

作者简介：周凤艳，女，1982年生，助理研究员，研究方向为杂草抗性机制与生物防治，E-mail ：zhoufy1982@163．com 收稿日期：2013－09－03

空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生

质体的制备与再生

周凤艳

1

张勇

1

周振荣

2

刘小林

1

（1．安徽省农业科学院，植物保护与农产品质量安全研究所，合肥230031；

2．当涂县农业技术推广中心，安徽当涂243100）

摘要：为建立空心莲子草致病菌假隔链格孢菌Nimbya alternantherae 的原生质体提取体系，以其强致病性野生型菌株N．alternantherae 11-2为供试菌株，研究了不同菌龄、酶系统、酶解时间及稳渗剂等对假隔链格孢菌原生质体制备及再生的影响，并采用聚乙二醇PEG 介导转化法，构建了随机插入突变体库。结果表明，在酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中培养2d 的假隔链格孢菌丝体，以0.7M 山梨醇为稳渗剂，同时使用2%裂解酶、2%崩溃酶和2%蜗牛酶3种酶的混合液，在30ħ下酶解3h 能获得足量的原生质体，且其再生率也可满足后继转化试验的要求。

关键词：假隔链格孢菌；原生质体；突变体

Preparation and regeneration of protoplasts for alligator weed

pathogen Nimbya alternantherae

Zhou Fengyan 1

Zhang Yong 1

Zhou Zhenrong 2

Liu Xiaolin 1

（1．Institute of Plant Protection and Aro-Product Safety ，Anhui Academy of Agricultural Sciences ，

Hefei 230031，Anhui Province ，China ；2．Dangtu County Agriculture Technology and

Popularization Center ，Dangtu 243100，Anhui Province ，China ）

Abstract ：Nimbya alternantherae is a pathogenic fungus of the invasive alligator weed ，Alternanthera philoxeroides （Mart．）Griseb．In this study ，a highly pathogenic and wild-type strain of N．alternantherae 11-2was selected to establish a protoplast extraction system．The influences of age ，enzyme system ，enzymolysis time and osmotic stabilizer on the preparation and regeneration of fungal protoplasts were examined．In addition ，the polyethylene glycol-mediated transformation method was used to establish a randomly inserted mutant library．The results showed that sufficient protoplasts could be produced when N．alternantherae hyphostroma were cultivated in a liquid medium of yeast extract peptone dextrose for 2days and then underwent 3hours of enzymolysis at 30ħ，with 0．7M sorbierite as the osmotic stabilizer along with a mixture of 2%lyase ，2%driselase ，and 2%snailase．Furthermore ，the regeneration rate of N．alternantherae protoplasts could also meet the requirements of subsequent transformation experiments．Key words ：Nimbya alternantherae ；protoplast ；mutant 空心莲子草Alternanthera philoxeroides 因其具有繁殖迅速、适应性强等特点，于20世纪50年代被引

入我国江苏和浙江等地作为牲畜饲料植物栽培，随

后相继传入全国各地并引起草害，与农作物争夺水

分、肥料、阳光和生长空间，导致农作物严重减产，同时还会对水产、水利、航运、物种资源、生态环境等产生极为不利的影响，成为全国大部分省区和水域的恶性杂草之一［1］。目前我国对空心莲子草以化学防治为主，有几种除草剂如水花生净，对防除空心莲子草效果比较显著，但因其残留期较长而受到限制。许多真菌毒素由于具有特异性生理活性和高度专化性作用位点，即使在很低的浓度下也能引起寄主植物的特异性反应，而且和传统的化学农药相比，往往具有化学结构新颖、低毒、低残留等特点，因此成为开发生物除草剂优先和重点考虑的对象。国内外近十年来对于空心莲子草的生物防治研究也逐渐开展了起来，其中以对假隔链格孢菌Nimbya alternan-therae的研究居多。

Barreto＆Torres［2］在上世纪90年代末从巴西的空心莲子草上分离获得了2个致病菌，假隔链格孢菌和莲子草尾孢菌Cercospora alternantherae，并发现前者的致病力显著高于后者，具有生物防治潜力。此后，假隔链格孢菌对空心莲子草具有致病力的报道陆续在中国［3］、澳大利亚［4］以及美国［5］等国家出现。田间试验表明，假隔链格孢菌SF193菌株防除空心莲子草的最适合浓度配比为1ʒ5 1ʒ10，其原液7d后对空心莲子草的鲜重防效高于化学除草剂氯氟吡氧乙酸［6］。在自然界中，许多致病真菌尤其是腐生性真菌都能够产生毒素，毒素对于致病真菌成功侵染寄主是必需的或者是兼容性的因子［7］。在对假隔链格孢菌分泌的毒素进行分离、纯化以及鉴定后，发现该物质为2-乙酰基-3，4-二羟基-5-甲氧基苯乙酸（vulculic acid）［8］。该物质是非寄主专一性毒素，能够引起空心莲子草根尖组织防御酶活性发生变化［9］。用不同浓度的假隔链格孢菌毒素处理空心莲子草叶片和根尖，发现叶绿体和线粒体可能是莲子草假隔链格孢毒素作用的初始位点［10］。此外，还发现假隔链格孢菌在入侵空心莲子草时会导致植物细胞内活性氧的迅速上升，从而对叶片造成严重破坏［11］。

综上所述，目前国内外主要侧重于假隔链格孢菌对空心莲子草防治的生理生化研究，但在其毒素合成路径的分子作用机制方面还未开展相关工作。而不同变异菌株的致病性、产毒能力和遗传稳定性往往存在较大差异，会给未来生产带来障碍。因此，研究致病菌产毒的相关基因、毒素合成的分子调控机制和致病机理，将会为这些毒素开发成为新的生物除草剂提供坚实的理论依据和技术支撑。近年来，分子遗传学研究极大地推动了对植物致病真菌产毒机制和侵染相关基因的认识。利用现代分子生物学技术产生新的基因敲除突变体和缺毒突变体，研究毒素生物合成的相关基因、以及哪些基因的改变有助于提高病原体的致病性，对于揭示真菌的致病机理是至关重要的［12］。而若想获得真菌产毒突变体，首先需要获得具有再生能力的原生质体，它是遗传操作的基础。

因此，针对不同真菌，建立合适的原生质体提取体系对后继试验至关重要。目前国内已经探索出多个真菌的原生质体提取体系，如禾谷镰孢菌Fusari-um graminearum［13］、黑曲霉Aspergillus niger［14］和刺孢吸水链霉菌Streptomyces hygrospinocus等［15］。但截至目前，还没有假隔链格孢菌原生质体提取方法的报道。本研究旨在建立假隔链格孢菌原生质体的提取与再生体系，并通过随机插入PEG介导转化法，建立假隔链格孢菌产毒突变体库，为后期探索其毒素合成路径搭建平台。

1材料与方法

1．1材料

供试菌株：空心莲子草假隔链格孢菌N．alter-nantherae11-2菌株由染病空心莲子草上分离鉴定获得（GenBank登录号JQ905258），本实验室保存。

质粒：质粒pCB1636由美国弗吉尼亚生物信息研究所Christopher B．Lawrence教授赠送。

培养基：菌丝生长培养基：PD培养基（马铃薯200g、蔗糖20g，加水定容至1L）、PDA培养基（取200mL PD培养基，加入2．6g琼脂粉）、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基（1%蛋白胨、0．3%酵母浸出物、2%葡萄糖）、酵母浸出葡萄糖（yeast extract dextrose，YED）培养基（0．5%酵母提取物、1%葡萄糖）、原生质体再生培养基（0．1%酵母提取物、1M蔗糖、1%琼脂、0．1%蛋白胨）。

试剂：蜗牛酶（snailase），购自上海经科化学科技有限公司；崩溃酶（driselase）、裂解酶（lyase）、纤维素酶（cellulase），购自Sigma公司；稳渗剂：NaCl、KCl、山梨醇、蔗糖、MgSO

4

各0．7M。其它试

剂：STC（1M sorbitol、10mM CaCl

2

、10mM Tris-Cl，pH7．5）、40%PEG4000（用STC配制）均为国产分析纯，购自合肥欣乐生物有限公司；Takara PrimeSTAＲMaX DNA Polymerase，购自宝生物工程（大连）有限公司。

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