细胞培养实验技术大全
细胞培养方法总结
细胞培养方法总结细胞培养是生物学研究中重要的实验技术之一，通过在体外人工创造和维持细胞生长环境，使细胞能够持续繁殖、生长和分化。
本文将对常用的细胞培养方法进行总结，并介绍其步骤和注意事项。
一、细胞培养基的配制细胞培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长调节因子的混合物，根据细胞类型和实验需求的不同，培养基种类繁多。
在配制培养基时，应按照标准操作流程，确保成分准确无误并避免细菌和真菌的污染。
二、细胞的分离和传代1. 细胞的分离：将细胞从原来的培养皿中取出，并用消化酶、细胞分离酶等方法进行细胞的离散处理，以获得单细胞悬浮液或小团的细胞群。
2. 细胞的培养：将悬浮的细胞或细胞小团转移至新的培养皿中，添加适量的培养基，并静置于恒温培养箱中，创造适宜的生长环境，促进细胞的生长。
3. 细胞的传代：当原始细胞群生长至饱和状态时，需进行细胞的传代，即将部分细胞转移到新的培养皿中，以保持细胞的活力和增长。
传代过程中，注意维持传代比例和规律的同时，避免细胞超密植或过稀。
三、细胞冻存和解冻细胞冻存是将培养好的细胞保存在低温下，以延缓其代谢过程，以备后续使用。
具体步骤包括：1. 预处理：加入冻存保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)或甘油，以降低冻存过程对细胞的伤害。
2. 储存管制备：将细胞转移到冻存管中，并标记相关信息，如细胞类型、培养时间等，以方便后续的识别。
3. 冷冻：将装有细胞的冻存管放置在低温环境中，逐渐降温至最终低温储存条件下，一般为液氮温度（-196°C）。
4. 解冻：将冻存管取出，快速置于37°C预热的培养基中解冻，然后将细胞转移至培养皿中，尽快恢复细胞活性。
四、细胞凋亡检测细胞凋亡是指细胞主动发生的自我死亡过程。
为了研究细胞凋亡的发生机制，需对细胞进行凋亡检测。
以下是常用的细胞凋亡检测方法之一：1. Annexin V/PI双染法：利用Annexin V亲和素与磷脂酰丝氨酸的结合，通过荧光检测乙酰胆碱酯酶的失活，以区分早期和晚期凋亡。
(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI 酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul 退火引物5ul酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。
（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（完整版）细胞实验技术
（完整版）细胞实验技术（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI 酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul 退火引物5ul酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。
（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养技术
• 3.3.4. 以0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭 菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基 种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。
• (血清亦可加入培养基中一起过滤)
• 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污 染测试。
细胞培养技术
基础篇-无菌操作基本技术
• 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照 射30-60 min 灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操 作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 min 后， 才开始实验操作。
• 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同 亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
基础篇-培养基
• 1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照， 实验进行前放在37℃ 水槽中温热。
• 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月， 期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不 佳，可以再添加适量glutamine。
• 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末 培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。
基础篇-抗生素
• 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中 不加抗生素。
• 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
•
• 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无 菌过滤。
• 若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加 入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
细胞培养实验集合
实验一培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件1、温度条件（37 ＋0.5）2、pH条件（7.2-7.4）3、气体条件4、水的质量（三蒸）5、渗透压6、营养条件7、无菌条件℃二、培养基的分类1、平衡盐液2、天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸钠 .0.11 g3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000 mL四、过滤出菌电磁搅仪器：不锈钢正压滤器材料：纤维素微孔虑膜（0.22 mm 孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。
所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。
细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。
一、实验目的1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点；3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。
二、实验条件本实验在细胞工程实验室完成。
1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。
细胞生物学实验方法与技术
细胞生物学实验方法与技术1.细胞培养：细胞培养是细胞生物学研究中最基本的实验技术之一、它通过将细胞放入培养基中，在特定的环境条件下进行体外培养。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞进行进一步的实验研究。
2.免疫荧光染色：免疫荧光染色是一种常用的细胞实验方法，通过此方法可以检测特定蛋白质或分子在细胞中的分布和定位。
该技术利用特异性的抗体与目标分子结合，并用荧光染料标记抗体，从而利用荧光显微镜观察染色结果。
3. 免疫印迹法（Western Blot）：免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的定量和分析的方法。
该方法通过将细胞或组织中的蛋白质经过电泳分离，并转移到膜上，然后用特异性的抗体与目标蛋白质结合，最后通过酵素反应或荧光信号检测目标蛋白质的存在和表达水平。
4.转染技术：转染技术是将外源的DNA或RNA导入到目标细胞中的一种常用方法。
常见的转染技术包括植入病毒载体、使用质粒转染剂、电穿孔和化学转染等。
通过转染技术，可以实现基因过表达、基因沉默等实验研究。
5.索引技术：索引技术是一种分析和比较细胞中基因表达的实验方法。
通过索引技术，可以快速筛选出在不同生理状态下表达差异显著的基因，并进一步研究这些基因的功能和调控机制。
常见的索引技术包括差异显著性分析、基因芯片、RNA测序等。
6.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是一种使用荧光染料观察细胞结构和功能的方法。
荧光显微镜可以通过选择不同的染料和光源，实现对细胞核、细胞器等结构的观察。
此外，还可以利用特定的荧光探针，实现对细胞内的信号分子、离子和代谢产物的监测。
7.流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测细胞的光学和物理特性，实现对单个细胞的定量分析和分选的方法。
该技术可以实现细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
特别是流式细胞术结合细胞分类仪，可以实现高通量的细胞分析。
综上所述，细胞生物学实验方法与技术为研究细胞的结构、功能和特性提供了重要的工具。
随着科技的不断发展，细胞生物学实验方法与技术也在不断更新与创新，为我们更好地理解细胞的生命活动提供了强大的支持。
基本细胞实验大全及注意点
细胞实验K-8实验步骤(4天)☐接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜）（三天，每天分别接种1000、2000细胞各三孔，共六孔）☐换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液（避光处理，加200ul培养基加20ul，加100ul只需加入10ul）☐分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（即OD值）☐酶标仪操作：KC Junior软件（606室）—new protocol—protocol name--Readmethod--Primary:450;performce:630--template--sample--拖区域--其他不需要改变--read plate --ID：日期+0.5h。
☐制作图表注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大；2.加入cck-8溶液时，要注意避光，且不能有气泡，否则会影响结果；3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。
2. Transwell实验☐收集细胞并计数☐接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基☐上室中加入4ug/ml mitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，移到另外一个有500ul4%PFA固定15-20分钟，再用棉签擦去微孔膜上层细胞，倒立，放另外一个板放入4°冰箱。
☐姬姆萨染色：⏹加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min⏹再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min⏹水洗，干燥☐镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野☐注意：1.上述实验均在24孔板中进行；2.transwell小室中种细胞时，注意细胞悬液不要弄到小室外，否则，会影响结果，造成人为误差；3.固定前，一定要把微孔膜上层的细胞擦干净；4.加入姬姆萨B液后，一定要摇匀，否则会造成染色不均匀；水洗时，要注意水流不要太快太大，否则会把细胞冲掉3.Wound healing实验（2到3天）☐大皿细胞大>70%可铺6孔板，没株细胞铺两孔（前一天或前晚），细胞长到95%以上时，待用☐加入4µg/mL 的mitomycin C，5%CO2 37℃培养2h☐每孔划3或5条痕，PBS洗两次（尽量洗去柱内细胞），加入加入4µg/mL 的mitomycin C，拍照，即为0h的数据（最小枪头，快，不拖）☐在6h、12h、24h、48h、72h分别拍照☐注意事项：1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；4.要及时换新鲜的培养基。
基本细胞实验大全及注意点
细胞实验K-8实验步骤(4天)☐接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜）（三天，每天分别接种1000、2000细胞各三孔，共六孔）☐换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液（避光处理，加200ul培养基加20ul，加100ul只需加入10ul）☐分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（即OD值）☐酶标仪操作：KC Junior软件（606室）—new protocol—protocol name--Readmethod--Primary:450;performce:630--template--sample--拖区域--其他不需要改变--read plate --ID：日期+0.5h。
☐制作图表注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大；2.加入cck-8溶液时，要注意避光，且不能有气泡，否则会影响结果；3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。
2. Transwell实验☐收集细胞并计数☐接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基☐上室中加入4ug/ml mitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，移到另外一个有500ul4%PFA固定15-20分钟，再用棉签擦去微孔膜上层细胞，倒立，放另外一个板放入4°冰箱。
☐姬姆萨染色：⏹加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min⏹再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min⏹水洗，干燥☐镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野☐注意：1.上述实验均在24孔板中进行；2.transwell小室中种细胞时，注意细胞悬液不要弄到小室外，否则，会影响结果，造成人为误差；3.固定前，一定要把微孔膜上层的细胞擦干净；4.加入姬姆萨B液后，一定要摇匀，否则会造成染色不均匀；水洗时，要注意水流不要太快太大，否则会把细胞冲掉3.Wound healing实验（2到3天）☐大皿细胞大>70%可铺6孔板，没株细胞铺两孔（前一天或前晚），细胞长到95%以上时，待用☐加入4µg/mL 的mitomycin C，5%CO2 37℃培养2h☐每孔划3或5条痕，PBS洗两次（尽量洗去柱内细胞），加入加入4µg/mL 的mitomycin C，拍照，即为0h的数据（最小枪头，快，不拖）☐在6h、12h、24h、48h、72h分别拍照☐注意事项：1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；4.要及时换新鲜的培养基。
细胞培养实验技术
细胞培养试验技术细胞培养环境1.实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
2.常用设施及设备（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
3.培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。
常准备量是使用量的三倍。
器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。
常用的器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。
（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm 等几种。
（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。
其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。
常用1ml 和10ml 两种。
短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。
（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
常用细胞培养方法整理
常用细胞培养方法整理细胞培养是一种在体外培养细胞的技术，广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。
常用的细胞培养方法包括原代细胞培养、细胞系培养、体外血管生成实验和三维培养等。
1.原代细胞培养原代细胞培养是从组织中分离和培养原始细胞的方法。
常用的原代细胞包括肝细胞、肺细胞、心肌细胞等。
通常，将组织样品切碎并用酶溶解，然后通过筛网过滤，以分离单个细胞。
分离的细胞可以通过离心或贴壁培养等方法进行培养。
2.细胞系培养细胞系培养是一种从原代培养细胞中建立的“永生”细胞系。
常用的细胞系有HEK293细胞、HeLa细胞等。
一般来说，细胞系生长速度更快且更易于培养。
细胞系培养常用的方法包括贴壁培养、悬浮培养和旋转培养等。
3.体外血管生成实验体外血管生成实验是一种研究血管生成过程的常用方法。
通过培养内皮细胞和其他细胞在三维基质中形成管状结构，模拟体内血管生成的过程。
这一方法被广泛应用于研究血管生成的机制、药物筛选和治疗的评估。
4.三维培养三维培养是一种在三维基质中培养细胞的方法，模拟细胞在体内的生长环境。
相对于传统的二维培养，在三维培养中，细胞能够形成更复杂的结构和组织，更贴近真实生理情况。
这一方法被广泛应用于组织工程、疾病模型的构建和药物筛选等研究领域。
除了上述常用的细胞培养方法外，还有一些其他的方法也值得关注。
例如，共培养是一种将不同类型的细胞一起培养的方法，用于研究细胞间相互作用。
过去，常规的细胞培养方法主要是在培养皿中进行，但现在也发展出了一些其他容器，如微流控芯片和生物反应器等，用于更精确地控制和监测细胞培养的环境。
细胞培养是现代生物学研究不可或缺的一部分，不断发展和改进的细胞培养方法为科学家们提供了更丰富和多样的工具，以便更好地理解细胞的生理机制和生命过程。
养细胞实验内容
养细胞实验内容细胞培养是生物学研究中非常重要的实验手段之一，可以用于探究细胞的生理、生化和分子机制，研究细胞的生长和分裂，以及对细胞进行基因转染和药物筛选等。
以下是关于细胞培养实验的一些相关参考内容：1. 细胞培养基的配制细胞培养基是细胞培养的基础，一般由多种物质组成，包括无机盐、氨基酸、维生素、有机物、生长因子和血清等。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640、F12等，不同类型的细胞适用不同的培养基。
细胞培养基可以根据需求进行调整、添加抗生素和调节pH值等。
2. 细胞分离和传代当细胞培养达到一定密度时，需要进行细胞的分离和传代。
一般方法是使用胰酶或胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养基表面或底部脱落。
然后将细胞悬浮于新的培养基中，经过离心沉淀后将上清液抽取，用新的培养基代替旧的培养基。
细胞传代的目的是为了维持细胞的分裂活力和生物学特性。
3. 培养皿的处理和细胞接种在细胞培养实验中，培养皿的处理非常重要。
最常用的培养皿是培养瓶和96孔板。
接种前需要将培养皿消毒，可以用70%酒精或紫外线照射等方法。
接种时需要将细胞悬浮液均匀均匀地滴在培养皿表面或孔底。
细胞密度的控制对细胞培养的成功至关重要。
4. 细胞培养条件的调节细胞培养对温度、湿度、CO2浓度和氧气浓度等环境条件有较高的要求。
细胞通常在37℃、5% CO2浓度和95%湿度的培养箱中培养。
细胞培养箱需要定期检查和校正，以确保细胞的最佳生长条件。
培养皿的密封性和通气性也是需要考虑的因素，可以使用无菌的高含氧的帽子。
5. 细胞的药物处理和基因转染细胞培养实验可以用于药物的毒性和疗效检测、基因功能研究以及基因转染等。
药物的处理一般是将药物溶液加入到培养基中，接种细胞后培养一段时间，然后进行细胞活力、分化状态等的检测。
基因转染常见的方法包括质粒转染、RNA干扰等，可通过改变细胞的基因表达和信号转导途径来研究细胞的功能和机制。
总结起来，细胞培养实验内容包括细胞培养基的配制、细胞分离和传代、培养皿的处理和细胞接种、细胞培养条件的调节以及细胞的药物处理和基因转染等。
各种细胞培养 方案 总结
各种细胞培养方案总结细胞培养是现代生物科学中的重要技术手段之一，它可以用于研究细胞的生理、生化过程、疾病机制等方面。
下面将介绍几种常用的细胞培养方案。
1. 培养基的选择细胞培养基是细胞培养的基础，不同类型的细胞需要选择适合其生长和增殖的培养基。
常用的培养基有DMEM、RPMI 1640、MEM等。
此外，还可以根据需要添加生长因子、激素和抗生素等。
2. 细胞的传代细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到一定程度时，需要进行细胞的传代。
传代时，首先将细胞从培养瓶中取出，用PBS洗涤，然后用胰蛋白酶等消化酶将细胞与培养瓶表面的细胞结合物消化，最后将细胞重新分装到新的培养瓶中。
3. 细胞的冻存细胞的冻存是为了长期保存细胞，以备后续实验使用。
冻存前，需要将细胞用冷冻保护剂进行保护，然后将细胞悬液分装到冻存管中，放入液氮中进行冷冻保存。
4. 细胞的鉴定细胞的鉴定是为了确认细胞的纯度和种属。
常用的鉴定方法有形态学观察、生长特性观察、免疫细胞化学染色等。
5. 细胞的感染细胞培养过程中，常常需要感染细胞以进行病毒或细菌相关的实验。
感染时，可以将病毒悬液或细菌悬液添加到培养基中，与细胞共同培养一段时间，观察感染效果。
6. 细胞的转染细胞转染是将外源基因导入细胞中的过程。
常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法等。
7. 细胞的分化诱导细胞分化诱导是将未分化的细胞转变为特定细胞类型的过程。
常用的分化诱导方法有添加特定培养因子、改变培养基成分等。
8. 细胞的凋亡检测细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，常用于研究细胞生命周期、疾病发生机制等。
常用的凋亡检测方法有流式细胞术、DNA凝胶电泳等。
以上是几种常用的细胞培养方案的介绍。
在实际应用中，我们需要根据具体实验目的和要求选择合适的方案，并严格按照操作规程进行操作，以保证实验的准确性和可靠性。
细胞培养技术的不断发展和完善，为细胞生物学和医学研究提供了重要的工具和手段。
细胞培养_实验报告
一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本操作流程。
2. 掌握原代细胞培养和传代细胞培养的方法。
3. 了解细胞培养在生物学研究中的应用。
二、实验原理细胞培养是指将生物体中的组织或细胞取出，在人工条件下模拟其生理环境，使其生存、生长、繁殖或传代的技术。
细胞培养技术具有操作简便、可控性强、成本低等优点，在生物学、医学、药物研发等领域具有广泛的应用。
三、实验材料1. 仪器：显微镜、培养皿、移液枪、离心机、超净工作台等。
2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、抗生素等。
3. 组织：动物组织（如小白鼠胚胎组织）。
四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取动物组织，用无菌手术刀切成小块。
（2）将组织块放入含有胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴消化30分钟。
（3）消化结束后，用移液枪吹打组织块，使细胞分散。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。
（5）加入DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿中。
（6）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。
2. 传代细胞培养（1）待原代细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）加入胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。
（3）加入DMEM培养基重悬细胞，按1:2的比例接种于新的培养皿中。
（4）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。
五、实验结果1. 原代细胞培养：细胞呈圆形，排列紧密，生长较快。
2. 传代细胞培养：细胞形态与原代细胞相似，生长速度略慢。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，无菌操作至关重要，避免细菌、真菌等污染。
2. 培养基的成分和pH值对细胞生长有重要影响，需严格控制。
3. 细胞培养技术广泛应用于生物学、医学、药物研发等领域，具有广阔的应用前景。
七、实验总结通过本次实验，我们掌握了细胞培养的基本操作流程，了解了细胞培养在生物学研究中的应用。
在实验过程中，我们体会到无菌操作的重要性，以及培养基成分和pH值对细胞生长的影响。
常用实验基本技术细胞培养
中国医科院细胞中心
6
培养方式
• 原代培养：
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。 只能原代培养：神经元、心肌细胞等。
• 传代培养：
当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制， 需要分散稀释后重新培养。 常见：肿瘤细胞系
7
培养细胞的处理
17
细胞特性检测
• 活力：MTT实验 • 凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等 • 增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验 • 分化：形态学观察、分化标志物检测 • 致瘤性：体内成瘤实验 •…
18
靶基因表达水平检测
• RT-PCR • Western blot • 免疫组化 • 其他：基因芯片、流式细胞术等
• 常用： Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA.
• 其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA.
14
瞬时转染与稳定转染
• 瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不 会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集 被转染的细胞进行基因表达分析。
加。
25
谢谢！
26
• 稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据 选择标记经过一段时间的筛选，使目的基 因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表 达目的基因的细胞系。
15
真核筛选标记
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设立对照组
• 空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。 • Scrambled siRNA：将选中的siRNA序列打乱。
作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中 的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目 的基因的mRNA没有明显的同源性。
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细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
每传代一次称为“一代”。
二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。
转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。
四、冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。
然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
五、常用仪器设备无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。
第三节细胞培养的无菌环境一、无菌室无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
此外，还应注意防止无菌室的污染。
造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。
二、超净工作台工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。
根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。
超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。
还要定期用福尔马林熏蒸超净台。
第四节常用培养器皿及清洗消毒细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。
一、清洗离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。
因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。
（一）玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。
1、浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。
新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。
2、刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。
不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。
将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。
3、浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。
浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。
放取器皿要小心。
4、冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。
手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。
（二）橡胶制品清洗新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。
（三）塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。
常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。
培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。
二、消毒和灭菌微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因（一）物理消毒法1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。
革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。
紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。
直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。
紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。
因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。
离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。
灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。
紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。
紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。
2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。
对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。
布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。
不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。
从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。
煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。
3、高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。
主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。
干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。
干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。