植酸酶

植酸酶高产菌株选育实例
从自然界筛选高产菌株： （1）、初筛 采集各地土壤样品各取10g溶于50mL生理盐水， 80℃煮沸8min，菌液稀释涂布于初筛平板。挑取 产生较大水解圈的菌落，再次划线分离，将单菌 落保存于斜面培养基。 （2）、菌种复筛 挑取斜面菌落，经种子发酵培养，用偏钒酸铵法 测定植酸酶活力。挑选活力最高的菌株，保存。
植酸酶应用包含以下几个方面： 1、在饲料工业上的应用 2、在食品工业的应用 3、在医学上的应用
1、植酸酶在饲料工业上的应用
1.1提高磷及其它矿物元素的生物利用率 日粮中添加微生物植酸酶，磷的利用率可 以提高30%～50%。同时能增加钙镁、锌、 锰、铜和铁的生物利用率，促进了动物矿 物质营养的平衡，进而导致动物组织结构 改善。
• 激活因子与抑制因子 多数二价阳离子(Ca2+ 、Fe2+ 、Zn2+ 、Mg2+ 、Cu2+ 等) 因与底物(植酸) 发生强烈的络合作用而抑制酶的 活力。草酸、柠檬酸等化合物也因与酶活性中心关 键氨基酸的侧链基因反应而降低酶活,常见的底物竞 争性抑制剂等的出现也会对酶的作用效果产生不利 的影响。 对于有的植酸酶,则存在某种特定的金属离子可以作 为电子转移载体起到酶的激活剂的作用, 如Fe2+激活 酿酒酵母, Ca2+激活枯草杆菌植酸酶等等。
植酸酶的理化特性
• 最适PH： 植酸酶的最适pH 值一般在2～6 之间。植物 来源的植酸酶最适pH 为4. 0～7. 5 ,大多数在 5. 0～6. 0 。细菌来源的植酸酶最适pH 一般 为中性或偏碱性。真菌植酸酶为2. 5 ～ 7. 0。 最适温度： 植酸酶最适温度在40～60 ℃范围内。
植酸酶的理化特性
植酸酶生产
• 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最 广泛的外源基因表达系统之一。它不但克服了大 肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质，表 达的蛋白多形成包涵体，背景蛋白多，表达量不 很高等缺陷，还具有与真核生物极其相似的分泌 途径和很强的真核蛋白质修饰功能，并且其自身 分泌的蛋白质很少且易于高密度发酵，因此，在 表达和分离纯化异源蛋白质等方面具有很强的优 势。
植酸酶发酵生产
植酸酶发酵包含固态发酵和液态发酵。
固态发酵是以麸皮、玉米淀粉、黄豆饼粉等农副产 品或加工废弃物，如稻草、米糠等为主原料，微生 物此时发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习 性，产生的酶系更全。固态培养设备比较简单、成 本低、产生的废弃物少、易推广，但放大比较困难、 培养参数控制较复杂、易染菌，而且生产的酶难于 分离纯化。
植酸酶高产菌株选育
目前，植酸酶生产主要是利用微生物发酵。 由于天然菌种的植酸酶产量较低，无商业利用价值。 目前都是以天然菌株进行改良获得的改良菌或通过 基因工程技术获得的基因工程菌。 Marisa K. Che - lius 等用紫外照射法对无花果 曲霉Asp . ficuum (NRRL31155)菌株进行改良,获得 的突变菌株其植酸酶产量为野生型的3. 3 倍。 此外，可以直接从自然界筛选、亚硝基胍处理、 复合处理、钴照射诱变等方法获得高产菌株。
1、植酸酶在饲料工业的应用
1.2 促进动物对蛋白质、氨基酸及碳水化合物 的消化吸收 从理论上讲，植酸酶水解植酸释放磷的同时， 可以将与植酸络合的蛋白质释放出来，便 于消化道分泌的各种蛋白酶作用同时还可 以释放与植酸结合的内源性蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶等，从而使消化利用率提高。 1.3 提高动物的生产性能，提高总能利用率
植酸酶的生产及应用
植酸酶的性质
• 植酸酶是一种能水解植酸为肌醇和磷酸的 一类酶的总称，它具有特殊的空间结构可 将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷 酸，属于磷酸单酯水解酶。是胞外酶。 • 其分子量因来源不同存在很大差异，这主 要是由于糖基化的原因造成的。植酸酶基 因在不同的表达系统中, 糖基化程度不一样。
植酸酶发酵生产
液态发酵 液态发酵培养条件易于控制，不易污染杂菌， 生产效率高。目前植酸酶的工业化生产主 要采用液态发酵工艺。
植酸酶的应用
植酸酶不仅可以解除植酸的抗营养作用,提高食物和 饲料中多种矿物元素和蛋白质、氨基酸的可利用性。 而且能够降低粪便排泄磷造成的环境污染,是一种新 型的绿色饲料添加剂。
植酸酶生产应用的主要难题是其耐热性问题。 现有的用于商品化的植酸酶虽然具有较强的 耐热性，但在70℃下制粒试验表明，其活性损失25 ％，80℃以及更高的温度使酶活损失更大，而高温 制粒和高温消毒是现代饲料工业中常用的加工工艺。 另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶 活性，因为饲料用酶最终的作用场所在动物的肠道 中，一般在37℃左右，现有的植酸酶通常都存在这 样一种矛盾，即耐热性好但在37℃时酶活不高，或 者是37℃时酶活高却不耐高温。
植酸酶生产应用中存在的问题
利用转基因植物生产植酸酶 以微生物作为转化受体生产植酸酶存在以下缺点： 第一，微生物发酵需要庞大的设备投资和高成本的 培养基 第二，原核生物不能对表达产物进行准确的翻译后 加工及蛋白质的糖基化 第三，通过微生物发酵生产的植酸酶能让动物感染 病原体
参考文献：
1.马俊孝.饲用植酸酶的研究进展 [J].饲料工业, 2010,31(16). 2.李晓宇，陈耀国，柳志强.植酸酶生产与应用的研究进展 [J]-中国农学通报， 2011,27（03）：257-261. 3.张若寒.饲用植酸酶应用技术现状及生产企业面临的挑战与机遇[J]-专家论坛， 2008,44（06）. 4.于平，陈益润.土壤中高产植酸酶芽孢杆菌菌株的筛选及鉴定[J]-中国食品学报， 2010,10(06). 5.贺建华.植酸磷和植酸酶研究进展[J]-动物营养学报，2005,17(01). 6.姚斌，范云六.植酸酶的分子生物学和基因工程[J]-生物工程学报，2000,16(01). 7.龙跃，杨博，王永华，等.植酸酶的高密度发酵、制备及其应用研究[J]-饲料工 业，2010,31(20). 8.汪世华，吕茂洲，等.植酸酶的现状及其研究进展[J]-广州食品工业科技， 2010,1（18）.
植酸酶高产菌株选育实例
（3）种子培养 活化甘油管保存菌种，接种于种子培养基。 种子培养条件为50 mI/250mL，温度37℃， 摇床转速160dmin，培养时间24h。 （4）摇床发酵培养 按8%接种量接种，培养条件为50 mL/250 mL，温度34℃，摇床转速160 r／min，培 养时间72 h。
2、植酸酶在食品工业的应用
2.1 改善人体对矿物质的吸收 2.2提高食品加工技术 许多主要的食品原料，如：豆类、谷物和 油料作物中抗营养因子——植酸的含量很 高，由其加工的食品中植酸的含量也很高。 在人的小肠中，植酸酶活性极低，难以利 用植酸盐。所以在一些食品中添加植酸酶 是必要的，可提高其营养价值。
植酸酶催化机制
胍基中的正电荷直接与底物植酸的磷酸基 团相互作用，使其对亲荷攻击更敏感。在共 价连接的磷-组氨酸中间物中，组氨酸残基作 为亲荷物质。C-末端序列HD的天门冬氨酸残 基提供质子给底物，释放磷。 杆状菌植酸酶催化机制存在特殊性，其稳 定性与活性依赖于Ca2+ 。
杆状菌植酸酶催化机制
• 植酸通过双降解途径产生三磷酸肌醇。 • 途径一：酶依次从3-位和1-位将磷酸盐水解下来， 将第一个磷水解后，酶与底物分离，然后底物再 结合到酶的活性位点水解第二个磷，产生中间物 2,4,5,6-四-磷酸肌醇，再将5-位磷水解下来，得到 产物2,4,6-三-磷酸肌醇。 • 途径二：首先是依次将6-位和4-位的磷水解，得 到的中间产物1,2,3,5-四-磷酸肌醇释放后，再与 酶结合，将2-位磷水解，得到终产物1,3,5-三-磷 酸肌醇
谢谢！
制片人： 杨娇、陈丹丹、柯荣华、曹亚飞
植酸酶高产菌株选育实例
5)、酶活测定 制作定磷标准曲线。取发酵液10mL， 4000 r/min离心15 min去菌体,10倍稀释： 取0.1 mL稀释液+1.9 mL Tris— HCI(p7．5)+4mL植酸钠(2 mmo1/L)，55℃ 反应30 min，再加入4 mL反应终止液。显 色10 min。4000r/min离心10 min。波长 415 nm处测定OD值。
3、植酸酶在医学上的应用
植酸的降解产物之一以1，2，6-IP3、1，2， 3-IP3和1，3，4-IP3等几种异构体为主的三 磷酸肌醇（IP3）具有广泛的生理功能。 此外，植酸酶还有其它用途，如开发植酸酶 菌肥，循环利用土壤中有机磷；还可用于 谷物沉淀加工废弃物的处理和玉米的湿磨 加工。
Байду номын сангаас酸酶生产应用中存在的问题
植酸酶高产菌株选育实例
（6）、菌种鉴定 菌落形态观察和生理生化鉴定 （参照《伯杰士细菌鉴定手册》） 分子生物学鉴定 提取细菌基因组，根据16S rDNA中最保守序列设 计引物。 进行PCR，产物1%琼脂糖凝胶电泳，产物测序， 与Genebank中进行Blast比对，下载同源性最高的 菌株16S rDNA序列，采用N-J算法，用Mega软件构 建系统发育树。