RNA提取,RT-PCR实验报告
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。
实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。
分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。
本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。
均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。
RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。
完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。
它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。
3、抑制内源和外源RNase。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。
二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量要比乙醇少。
异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
总RNA的提取及RT-PCR
每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染
避免重复加样或漏加样。
加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。
加完试剂后离心将液体汇集管底。
对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。
此步注意事项：
扩增β-actin基因程序的建立
01
预变性 94℃5min
02
变性 94℃45s
02
RNA保存：
紫外分光光度法测定260/280nm比值大约为2.0，如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。
RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释度×40。
RNA提取结果的鉴定：
通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解
电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S
（普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）
02
整性，浓度不高、完整性不好的标本应谨慎选用，以
04
总RNA 提取之后，用紫外分光光度计测定其纯
01
再用1% 琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，以鉴定其完
03
免影响后面的实验结果。
05
总RNA 的纯度和完整性鉴定
01
半定量RT-PCR需选用体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的管家基因片段作为内参。
mRNA 蛋白质多肽链
外显子
真核生物基因的表达
内含子
转录
基因
翻译
RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于：
01
检测mRNA表达信息,进行基因表达差异分析等研究
02克隆cDNA 构建cDNA03RT-PCR技术的应用
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RNA提取及RT-PCR
（2）随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed
cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡 核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA 的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合 成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不 仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μ g/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2)进行琼脂糖凝胶电泳,确定RNA提取的情 况。
RNA降解 1、组织取出后没有马上处理或冷冻
2、样品或提取的RNA保存与-5—-20℃， 没有在
准备工作
RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活， 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须 戴手套。 2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。
（1） oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核 mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入 12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段， 由反转录酶合成cDNA的第一链。 缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’ －末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对 于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻 烦。
总RNA的提取,RT-PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
总RNA的提取与RT、Realtime-PCR
总RNA的提取与RT、Realtime-PCR一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。
获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。
再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。
1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。
RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。
外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。
这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。
2．常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。
它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。
*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。
*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。
2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。
3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。
4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。
5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。
实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。
2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。
3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。
4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。
5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。
6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。
结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。
以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。
结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。
这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。
2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。
小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR实验
0.5 l ② 0.5 l ③
Random 6 mers (`100 m)
提取的RNA
1 l
0.5 l
④
RNase Free 水
5.5 l ⑤
10 l
37℃
15min
85℃
5 sec
PCR
10x PCR Buffer 5 l
dNTP
模板DNA
4 l
2 l
引物1
引物2 Tag 酶 H2O
2 l
2 l 0.5 l 34.5 l 50 l
94℃
5 min
94℃° 30 sec
54℃° 30 sec
25 cycle
72℃
72℃
30 sec
7 min
1%琼脂糖凝胶电泳观察结果
，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿 时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水
3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50l DEPC水中。
RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR
RT-PCR操作步骤
5x Prime Script Buffer Prime Script RT Enzyme Mix Oligo dT primer (50 m) 2 l ①
Oligo dT Primer
特异性下游引物 (PCR时的下游引 物)
逆转录反应的引物
1. 随机引物 约30％论文采用，缺点：rRNA的干扰 2. Oligo(dT)引物 约40％论文采用，缺点：mRNA 5’端的合成 另有10％论文同时采用以上两种引物 3. 基因特异性引物（GSP）
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告《RT-PCR实验报告》摘要：本实验旨在利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对特定基因进行定量分析。
通过逆转录将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
实验结果表明，该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
引言：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测、基因型鉴定等领域。
其原理是利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
本实验旨在利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，为基因表达研究提供重要的技术支持。
材料与方法：1. 提取RNA：从细胞或组织中提取总RNA，使用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
2. PCR扩增：设计特异性引物，利用PCR技术扩增目标基因。
3. 实时荧光检测：利用实时PCR仪检测PCR反应过程中的荧光信号，得到目标基因的表达水平。
结果与讨论：实验结果显示，利用RT-PCR技术可以准确、快速地检测目标基因的表达水平。
与传统的Northern blot和原位杂交技术相比，RT-PCR技术具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，适用于大规模基因表达分析。
因此，RT-PCR技术在基因表达研究中具有广泛的应用前景。
结论：本实验利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，结果表明该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
未来，我们将进一步优化实验条件，扩大样本量，深入研究基因表达的调控机制，为相关疾病的诊断和治疗提供更多的理论和实验依据。
细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合殷悦涵实验日期：2021.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白〔RNP〕的形式存在。
别离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质别离，然后将RNA同其他的细胞成分别离开并保证RNA的完整性。
Trizol法别离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节防止它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过屡次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。
根本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞〔A549和H1299〕中的表达水平。
二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549〔野生型〕和H1299〔p53缺失型〕、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温枯燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定〔一〕RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心15min分层→取上层水相入新的Ep管中参加等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀〔二〕RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达〔一〕反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管参加样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。
外周血白细胞RNA提取并RT-PCR实验技术
外周血（静脉血）白细胞RNA提取1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液↓颠倒混匀，室温放置5min↓3000rpm离心5min↓弃上清。
留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次）↓加入1ml Trizol裂解白细胞↓用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散↓用5ml注射器反复吹打（不少于10次）↓再用1ml注射器反复吹打↓加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min↓4℃离心：12000rpm 15min↓转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。
RNA产出浓度为200-300ng/μl,100μl稀释），混匀，静置15min↓4℃离心：12000rpm 10min↓弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml）↓4℃离心：7500rpm 5min↓弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干↓将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中↓－70℃冰箱保存，备用1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置）2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定RT-PCR实验A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）：1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液Oligo dT Primer （50uM） 1uldNTP mixture (10mM each) 1ulRNA模板 0.5ug～5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）O 适量至总体积为10ulRNase Free dH22、65℃保温5min后，冰上迅速冷却1min以上3、在上述离心管中继续配制下列反应液，总量为20ul上述变性后反应液 10ul5X PrimeScriptII Buffer 4ulRNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ulPrimeScriptII RTase (200U/ul) 1ulO 至20ulRNase Free dH24、缓慢混匀，轻轻用枪吹打或手指轻弹，稍离心5、42℃， 30～60min6、70℃，灭活15min后，冰上迅速冷却B、PCR实验（25ul反应体系）：Taqmix 12.5ul引物1（上游）（10～20nM） 0.5ul引物2（下游）（10～20nM） 0.5ulcDNA 2ul（可调整）超纯水加至总体积25ulPCR步骤：1、Hold on 94℃ 5min2、Cycle 94℃ 40s3、退火温度： X℃ 40s4、72℃ 40s repeat “2～4步骤”5、72℃ 10min6、4℃ 60min琼脂糖凝胶电泳1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min 后冷却至60～70℃左右加入5ul EB溶液。
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RNA制备及其鉴定
实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴
定的基本方法。
实验原理
细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。
分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。
本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。
均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。
RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。
完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
本实验中几个重要试剂的作用：
Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。
它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。
3、抑制内源和外源RNase。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。
二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量要比乙醇少。
异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
75%乙醇：应用无水乙醇+DEPC水制备。
用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐.RNA样品中如果含有无机盐,有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。
实验步骤按规定的操作步骤进行操作，特别注意创造一个无RNA酶的环境。
实验结果
经RNA琼脂糖电泳后，紫外灯下观察RNA分离情况如下图：
可观察到未见明显28S和18S条带，可见少量5S条带，实验结果并不满意。
采用紫外分光光度法测定出RNA的浓度和纯度，结果如下：
RNA的A260/A280=1.057/0.920=1.15，说明有蛋白污染，RNA纯度不高。
实验讨论
实验结果中未见28S和18S条带，5S条带显色强度不强，说明RNA已被大量降解或者起初提取的RNA总量并不是很大。
有多种原因可能会导致这种结果，回顾操作过程中的细节并总结分析，可以得到如下结论：
1、RNA酶是一种耐热、耐酸、耐碱、不需要辅助因子且能迅速降解RNA 的一种酶，蛋白质变性剂只能使之暂时失活，变性剂去除后，其活性又可恢复，而且这种酶广泛存在于人的皮肤、周围的环境中。
在操作本实验时，实验室人多且经常活动，使用枪头的时候用完之后没有及时盖上，对着EP管呼吸等难免会有或多或少的RNA酶污染试剂或试管污染，从而导致实验失败。
2、在匀浆时加入了2mlTrizol试剂，导致匀浆体积太大，匀浆后，为保证后续操作步骤能与其他组同步，我们选择倒掉了一部分匀浆液，因而造成本组RNA 总量减少，从而导致实验失败。
3、RNA的A260/A280=1.057/0.920=1.15，一是说明可能有蛋白DNA残留，二是说明可能有酚残留，原因可能是抽提的时候操作不当。
可用氯仿重新抽提，沉淀，溶解。
另外也有可能是分光光度计设备的问题。
综上所述，在进行RNA制备及鉴定实验的时候一定要特别注意创造一个无RNA 酶的环境，每一个操作步骤都应该胆大心细，尽量避免不规范的操作。
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术
实验目的：通过本实验，掌握RT-PCR的基本原理和基本操作技能。
实验原理：
PCR是一种在体外大量扩增特异基因片段的分子生物学技术。
其利用合成的两段已知序列的寡核苷酸作为引物，将位于两引物之间的特定基因片段进行复制，经过多次循环，使模板上特定基因拷贝数呈指数级增长，具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。
PCR反应过程分为三步：变性、退火、延伸。
RT-PCR其基本原理是将mRNA反转录合成cDNA后再
经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA的扩增，我们常利用此技术克隆cDNA 或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
利用此技术进行特定基因片段的克隆时，要特别注意引物的设计。
实验步骤按规定的操作步骤进行操作。
实验结果
经PCR产物琼脂糖电泳后，紫外灯下观察PCR产物分离情况如下图：
可观察到，与对照组相比，未见明显的PCR产物条带出现，实验结果并不满意。
实验讨论
与对照组相比，未见明显的PCR产物条带出现，可能的原因有很多，可主要分为以下几点：
1、在RNA制备及鉴定实验中，我们可以观察到的结果是RNA被大量降解，这样可能导致在进一步反转录成cDNA和PCR时，几乎没有模板，从而导致实验失败。
2、PCR反应体系应该是最有可能导致实验失败的地方，但是从对照组来看，对照组条带显色很强，所以基本上可以排除PCR反应体系出现问题的情况。
3、电泳时，在向加样孔中加样时，可能会因没有混匀或操作不当而导致样品丢失，我们在操作这一步骤时，虽然有大部分样品都沉淀在加样孔中，但是仍有部分样品漂浮起来，这也可能是导致失败的一个原因。
另外，加试剂顺序可能也会影响电泳的结果。
综上所述，在做RT-PCR时，首先要对提取的总RNA的量进行鉴定，最好是电泳，以确定RNA的纯度和浓度。
然后再进行反转录、PCR以获取自己想要的基因片段。
在PCR时，PCR反应体系也是一个十分重要的部分，要保证反应体系无误。
例外，实验技能的操作规范程度、熟练程度也是影响实验结果的一个重要因素。