枯草芽孢杆菌表达手册 个人翻译中文版

枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明

2005年11月

目录

1.简介 (3)

2. pHT 载体 (3)

2.1. pHT01载体图谱 (4)

2.2. pHT43载体图谱 (5)

2.3. pHT01衍生物中标签的定位 (5)

3. 实验方案 (6)

4. 参考文献 (6)

5. 订单信息，运输和存储 (6)

本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室

开发。

仅用于科研！

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枯草芽孢杆菌表达载体

通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白

1.简介

革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性，且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译，蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。

但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解决。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1和pBS72衍生的一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003）。

最近，基于大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72的四种不同表达载体的构建和使用展示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005）。

两个新的载体pHT01和pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌gro E操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01衍生载体可与8×His 标签（pHT08），链球菌标签（pHT9）或C - Myc的标签（pHT10）相结合。

2. pHT 载体

所有在枯草芽孢杆菌的gro ESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从约1300种诱导因子中筛选出一种来使用bga B报道基因（Phan等，2005）。当分别将htp G 和pbp E基因融合到gro E启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的10%和13%（Phan等，2005）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A、B的高水平表达实验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamH I, Xba I, Aat II, Sma I）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。

P grac : P grac 启动子（包含gro E 启动子；

lac O 操纵子和gsi B SD 序列）

CoIE1 ori: CoIE1 起始子

Amp R : 青霉素抗性基因

LacI: lacI 基因 (lac 抑制子)

Cm R : 氯霉素抗性基因

完整的DNA 序列可根据要求提供

P grac: P grac启动子（包含gro E启动

子；

lac O操纵子和gsi B SD序列）

CoIE1 ori: CoIE1 起始子

Amp R: 青霉素抗性基因

LacI: lacI 基因 (lac 抑制子)

Cm R: 氯霉素抗性基因

SamyQ: amyQ 信号序列

完整的DNA序列可根据要求提供

2.3. pHT01衍生物中标签的定位pHT08中 8×His标签的定位

pHT09中Strep标签的定位

pHT10中c-Myc标签的定位

3. 实验方案

对大肠杆菌和枯草芽孢分子遗传操作（生长，转化等）的详细协议可以在有关实验室手册如Sambrook 和Russell （2001年）中可以找到。对于枯草杆菌改造我们推荐Anagnostopoulos 和Spizizen （1961）的方案，需稍加修改：

1． 20mL

LS 培养基（Spizizen 培养基* 补充加入0.5%葡萄糖，5μg/mL DL-色氨酸，5μg/mL 尿嘧啶，0.01% 干酪素水解物，0.1%酵母提取物[Difco 公司]，1mM MgSO 4，2.5mM MgCl ，0.5 mM CaCl ）中接种在HS 培养基（Spizizen 培养基* 补充加入0.5%葡萄糖，522μg/mL DL-色氨酸，5μg/mL 尿嘧啶，0.01% 干酪素水解物，0.1%酵母提取物[Difco 公司]，8μg/mL 精氨酸，0.4μg/mL 组氨酸，1mM MgSO ）中37C 过夜培养的5mL 中的1mL ，30C 缓慢摇3到4小时。

4o o 2．用10μL 的0.1M EGTA 室温孵育这1mLHS 培养物5分钟（对数晚期/稳定早期； OD ）而后加入1~2578μg 质粒DNA 。

3．37o C 摇2小时供其发展抗生素抗性后将细胞涂布至选择性平板。

*Spizizen 培养基配方：2g NH 4SO 4，14g K 2HPO 4，6g KH 2PO 4，1g 柠檬酸钠；加100mL 蒸馏水，高压灭菌，然后再加0.1mL 1M MgSO 4。

4. 参考文献

Anagnostopoulos, C. and Spizizen, J. (1961). Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81:741-746.

Jannière, L., Bruand, C. and Ehrlich, S.D. (1990). Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors, Gene 87:53-61.

Nguyen, D.H., Nguyen, Q.A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C.S., Tran, L.T. and Schumann, W. (2005). Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis. Plasmid; in press.

Phan, T.T.P., Nguyen, H.D. and Schumann, W. (2005). Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Protein Expr. Purif.; in press.

Sambrook, J. and Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual.

Titok, M.A., Chapuis, J., Selezneva, Y.V ., Lagodich, A.V ., Prokulevich, V .A., Ehrlich, S.D. and Jannière, L. (2003). Bacillus subtilis soil isolates: plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicating vector, Plasmid 49:53-62.

5. 订单信息，运输和存储

订单号 PBS001 PBS002 PBS003 PBS004 PBS005 描述 pHt01载体，冻干DNA 质粒 pHt43载体，冻干DNA 质粒 pHt08载体，冻干DNA 质粒 pHt09载体，冻干DNA 质粒 pHt10载体，冻干DNA 质粒 含量 10μg 10μg 10μg 10μg 10μg

室温运送。冻干质粒4o C储存。无菌水或缓冲液中解旋的DNA我们建议-20o C保存。