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WB试验每步原理和技术及试剂的分析
WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。
讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。
一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。
我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。
你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。
另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。
封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。
如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。
除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
wb蛋白定量
百泰派克生物科技
wb蛋白定量
蛋白质印迹（Western blotting，WB）是细胞和分子生物学中的一项重要技术。
通过使用蛋白质印迹，研究人员能够从细胞中提取的复杂蛋白质混合物中鉴定出特定的蛋白质。
该技术使用通过三个步骤来完成这一任务：（1）按大小进行蛋白分离，（2）将蛋白转移到固体支持物上，（3）使用合适的一级和二级抗体标记靶蛋白进
行可视化。
WB通常用于分离和鉴定蛋白质的研究，也可用于蛋白含量的鉴定。
在这种技术中，根据蛋白质分子质量差异通过凝胶电泳分离蛋白质混合物，然后将分离开来的蛋白条带转移到PV或NC上，每种蛋白质产生一个条带。
将膜与目标蛋白特异性的标记抗体一起孵育，洗去未结合的抗体，只留下与目的蛋白结合的抗体。
最后通过显影薄膜来检测结合的抗体。
由于抗体只与感兴趣的蛋白质结合，因此只能看到一个条带。
条带的厚度对应于存在的蛋白质的量；因此，可以预先做一个条带厚度与含量关系的标准即可对蛋白质的含量进行鉴定。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供快速准确的蛋白质定量鉴定服务技术包裹，可
对各种蛋白进行精确的含量鉴定，包括蛋白质提取物、SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋
白胶点、pull-down及Co-IP等样品中的蛋白质等，还可根据需求提供定制化的检
测方案，欢迎免费咨询。
WB实验步骤(精)
Western blotting实验步骤1．蛋白质的样品制备：取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。
将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。
2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。
2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。
2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。
2.4 分别加PBS定容至20ul。
2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。
2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。
3 SDS-PAGE电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。
同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。
吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。
3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。
（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。
3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。
WB详细操作步骤
Western blot实验检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体WB步骤1 蛋白样本处理：(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
2 分离胶浓缩胶配方如下：分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：SDS-PAGE分离胶浓度（%）最佳分离范围（kD）6 50-1508 30-9010 20-8012 12-6015 10-40不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：分离胶5%浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 试剂体积去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0 30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.01.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.01.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL)1.010%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（μL)80.0 10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（μL)60.0 TEMED（μL)7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（μL)8.0 总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.03 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
WB原理、步骤与总结
实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理基于免疫学技术，主要包括以下几个步骤：1. 细胞裂解，首先需要将待检测的细胞或组织样品进行裂解，使得蛋白质释放出来。
2. 蛋白质分离，裂解后的蛋白质需要通过电泳或其他方法进行分离，以便后续的检测。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常采用电泳转印的方法。
4. 抗体结合，将特异性的一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解，将含有蛋白质的细胞或组织样品加入裂解液中，使用超声或搅拌等方法进行充分裂解。
2. 蛋白质分离，将裂解后的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常使用半干法或湿法转印。
4. 抗体结合，将膜中的蛋白质与特异性的一抗结合，通常需要进行过夜孵育，以保证抗体与蛋白质的充分结合。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测抗体与蛋白质复合物的信号，得到目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
在进行WB实验时，需要注意以下几点：1. 样品处理，样品的裂解和处理过程需要在低温和无酶的条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 抗体选择，选择特异性良好的一抗和二抗，以确保实验结果的准确性。
3. 数据分析，对实验结果进行准确的数据分析，包括目标蛋白的相对表达水平和统计学分析。
四、实验应用。
WB实验广泛应用于生物医学研究领域，可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用等。
在癌症、免疫学、神经科学等领域具有重要的应用价值。
总之，WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，掌握其原理和步骤对于开展生物学研究具有重要意义。
wb电泳条件
WB电泳条件1. 简介WB电泳是Western Blot（免疫印迹）实验中的一项重要步骤，用于检测蛋白质的存在和定量。
WB电泳条件指的是进行WB实验时所需的电泳条件，包括凝胶类型、电泳缓冲液、电极缓冲液和电泳参数等。
2. 凝胶类型在WB实验中通常使用两种类型的凝胶：聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
SDS-PAGE适用于分离较小的蛋白质，而琼脂糖凝胶适用于分离较大的蛋白质。
2.1 SDS-PAGE凝胶制备SDS-PAGE凝胶制备步骤如下：1.准备分离凝胶：根据需要选择合适浓度（通常为8%至15%）的聚丙烯酰胺溶液，并加入TEMED和过硫酸铵（APS）使其聚合。
2.倒入分离凝胶：将聚合后的混合物倒入垂直电泳槽中，插入槽中的梳子，等待其固化。
3.准备浓缩凝胶：根据需要选择合适浓度（通常为4%至6%）的聚丙烯酰胺溶液，并加入TEMED和APS使其聚合。
4.倒入浓缩凝胶：将聚合后的混合物倒入垂直电泳槽上方的空隙中，等待其固化。
5.去除梳子：将槽中的梳子取出，注入电泳缓冲液。
2.2 琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶制备步骤如下：1.准备琼脂糖溶液：根据需要选择合适浓度（通常为0.5%至2%）的琼脂糖溶液，并加热至完全溶解。
2.倒入凝胶模具：将热溶解的琼脂糖溶液倒入水平电泳槽中的凝胶模具内，等待其固化。
3.注入电泳缓冲液：在固化后的琼脂糖凝胶上方注入电泳缓冲液。
3. 电泳缓冲液电泳缓冲液是用于维持凝胶pH值稳定和提供离子传导性的溶液。
常用的电泳缓冲液包括Tris-Glycine和Tris-Tricine缓冲液。
3.1 Tris-Glycine缓冲液Tris-Glycine缓冲液的制备步骤如下：1.准备Tris溶液：将适量的Tris粉末加入蒸馏水中，调节pH值至所需范围。
2.加入甘氨酸：将适量的甘氨酸加入Tris溶液中，搅拌使其完全溶解。
3.调节pH值：根据实验需要，使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH值。
wb蛋白免疫印迹涉及到的名词解释
wb蛋白免疫印迹涉及到的名词解释
WB（Western Blot）蛋白免疫印迹是一种利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。
此外，在WB过程中，涉及到以下名词：
1. 蛋白质：由氨基酸组成的大分子生物分子，是生命活动的主要承担者。
2. 抗体：一种蛋白质分子，能特异结合抗原，具有免疫原性和反应原性。
3. 抗原：能刺激机体产生特异性免疫反应，是一种大分子蛋白质。
4. SDS-PAGE电泳凝胶：一种电泳技术，利用SDS（十二烷基硫酸钠）将蛋白质在电场中分离。
5. PVDF或硝基纤维素膜：一种用于蛋白质转移的膜，具有较好的化学稳定性和热稳定性。
6. 荧光或化学发光检测：利用荧光物质或化学发光物质标记抗体，以便在免疫检测中检测到信号。
总之，WB是一种广泛应用于细胞和分子生物学研究的免疫检测技术，用于研究蛋白质的表达、修饰和相互作用等。
荧光Western免疫印迹方法(第一抗体在牛奶中孵育)
荧光Western免疫印迹方法（第一抗体在牛奶中孵育）做Western免疫印迹时，将膜泡在用稀释抗体中4°C孵育过夜并轻轻晃动。
抗体稀释在含5% w/v 脱脂奶粉的1X TBS, 0.1% Tween-20当中注意：双荧光Western中两种一抗需要是不同物种来源的而且对应的二抗应标记有不同荧光。
如果两种一抗相应推荐使用的一抗稀释液不同，则将两种抗体单独在两种稀释液中试验，选用效果更好的稀释液用于双荧光实验。
以下方法中的试剂可以根据货号从Cell Signaling Technology (CST)公司购得。
A.所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。
1.1X磷酸盐缓冲生理盐水2.1X SDS 上样缓冲液(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
3.转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。
4.10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。
5.脱脂牛奶: (#9999)6.封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。
配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解。
7.漂洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
8.Antibody Dilution Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% nonfat dry milk; for 20 ml, add2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g nonfat dry milk and mix well. While stirring,add 20 μl Tween-20 (100%).抗体稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
Western-blot（WB）实验步骤有哪些？
Western-blot（WB）实验步骤有哪些？
B通常广泛用于检测复杂样品中的少量目的蛋白，或监测蛋白表达与纯化。
它通常被认为是评估新抗体及其蛋白检测分析方法（如ELISA）的标准之一。
WB的主要步骤大致分为以下三步：SDS-PAGE分离蛋白样品、蛋白样品转移至膜上以及鉴定膜上的目的蛋白。
根据WB的这几大步骤，我们总结出一个成功的WB需要具备大致四个要求：
1.蛋白样品的分离及洗脱。
一个复杂的蛋白样品在凝胶电泳中根据其分子大小分离，之后在转移过程中从凝胶上洗脱，如果仍保留在凝胶上则影响WB实验；
2.吸附于膜。
蛋白从凝胶上洗脱后吸附于膜上，转移时电极方向、转移时间、膜的处理等都将影响蛋白的吸附；
3.实验过程中蛋白的截留，在转移后的后续处理过程中蛋白持续吸附于膜上，过分冲洗等做法都将导致蛋白脱落；
4.在实验过程中，吸附的蛋白样品能直接与其检测试剂接触，比如不适当的封闭等操作将使蛋白样品被掩蔽，无法得到WB结果。
因此，在WB的实际操作中都应注意以上要求为前提进行，以期得到良好的**印记。
WB检测全攻略
WB检测全攻略Western Blot,对于任何一个科研君都不陌生，但是，为甚么别人的实验时间短、跑胶快、成像显影辣么好看活生生的羡慕，嫉妒，hen (哼)，足足被甩了几篇SCI…内情你知否？除了实验精细化操作，选择合适的实验试剂，还有呢？当然离不开你的优化设计你对关键步骤的步步为营。
本文旨在通过提供建议，帮助您在短时间、以更少的终端用户优化调整得到预期结果，提升免疫印迹效果。
PS：科研是不断进步的过程，有不当之处，望指正。
何为蛋白印迹（WB）蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。
这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。
抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。
一句话讲完WB：就是抗原抗体反应！Western Blot 可以：1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
▲WB涉与的领域▲WB操作关键步骤以下，会从关键步骤入手，我们将给出试剂和实验过程的建议，逐一介绍每个步骤中的一些关键注意点以与给出对应优化后的图表，供大家参考一、裂解产物制备1.组织裂解常见破碎组织的方法：机械法、匀浆法、超声波破碎解、研磨法，反复冻融法等；实验室常用的破碎方法：1.超声波；2.电动研磨；3.磁珠破碎法。
（注意磁珠高速旋转时产生的热量比较多，需提前把机器放在冰箱制冷）以上主要注意发热引起的蛋白变性和聚集，操作过程中尽量减少细节上的差异，这样才能保证实验结果的重复性比较一致。
2.细胞裂解一般裂解液包含以下几个组分:1. 缓冲系统；2. 盐离子；3. 离液剂；4. 蛋白酶抑制剂；5. 还原剂▲根据目的蛋白选择合适的裂解液▲常见蛋白酶磷酸酶抑制剂二、凝胶电泳1.加入足量的样品和分子量大小标记物SDS-PAGE 根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。
WB干货总结-II
WB干货总结-II各位童鞋，上一期我们解析了WB实验中仪器、耗材和试剂的选择，相信各位在实验过程中还有还会有遇到各种各样的小问题，今天为大家整理一些WB实验中的常见问题和处理方案。
一、样本制备1.硬组织或样本量多应选择液氮研磨，样本量少为避免损失选择玻璃匀浆器。
使用玻璃匀浆器时注意冰上研磨减少蛋白降解。
2.提取过程中加入EDTA等蛋白酶抑制剂，避开蛋白酶最适温度（斑马鱼等冷血动物组织蛋白酶），快速提取。
3.研磨后还需要超声破碎，由于核酸和脂类都能与蛋白质结合，形成大分子复合物，使电泳速度拖慢或蛋白无法进入浓缩胶。
尤其是核蛋白提取时，超声破碎必不可少。
4.上样前BCA法测定样本浓度，计算上样量。
在这里为大家提供一个小技巧：可以测量吸光度，将样品浓度调整一致后再上样。
二、凝胶电泳1.选对凝胶，跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。
2.目的蛋白大小与凝胶浓度成反比，蛋白分离范围越大需要凝胶浓度越低。
3.内参蛋白的选择应与目的蛋白分子量相差5kDa以上。
4.电泳后凝胶不易长时间放置在电泳装置内，应及时放入转膜液中固定防止蛋白扩散。
三、转膜1.选择合适的膜，膜一般有PVDF膜或NC膜。
跑大分子蛋白选择PVDF膜，孔径尺寸最常见的是0.2μm和0.45μm，大多数蛋白质都可用0.45μm膜转移。
2.转膜有半干转和湿转两种，半干转方便快捷但不适用于大分子蛋白。
3.一般转膜电流在200-300mA左右，转膜时间在30-60min，或15-20mA过夜。
大分子蛋白转移时间慢，推荐350-400 mA转移90min或4°C，40 mA，转印过夜。
四、常见问题赫贝科技2017年终特惠活动火热进行中WB 798/膜最低的价格享受最专业的服务专业的事交给专业的人，思考留给科学，实验外包出去。
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教你如何进行WB实验
教你如何进行WB实验WB，蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
实验步骤蛋白质样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1.培养细胞或药物处理。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。
注意：冰上操作。
4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5.煮沸样品5min。
6.离心12000g，5min，取上清。
SDS-PAGE电泳一、清洗玻璃板二、灌胶与上样1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2. 配 10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3. 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4. 配 4％的浓缩胶, 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6. 在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7. 连接电泳槽到电泳仪。
上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm 时，停止电泳。
WB试验基本步骤
.实验基本步骤提取细胞蛋白↓BCA定量↓制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）↓蛋白样品变性↓电泳↓转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓二抗↓TBST洗涤↓显影↓结果分析;..试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾 0.24g磷酸氢二钠 1.44g氯化钠 8g氯化钾 0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L,高压蒸汽灭菌2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-203.电转液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷4.电泳液（1X）10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-207.封闭液TBST1X+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热;..WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。
重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。
3.按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，于4℃下12000 rpm离心5 min。
7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
二、蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA 标准液1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,;..2 是两个箭头图标,1R>0.98才有用,酶标仪操作:以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。
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教研室意见Βιβλιοθήκη 教研室主任：年 月 日院系意见
院系领导：年 月 日
本次期末采用闭卷笔试考核，由平时成绩和期末考试成绩构成，分别占到该门课程期末总评成绩的40%和60%。其中平时成绩由三部分构成，即作业成绩、考勤成绩和课堂问答与讨论成绩，分别占平时成绩的30%、30%和40%。作业成绩和课堂问答成绩均采用五级制方式记录，最终成绩取各次成绩的平均分，考勤成绩根据每次课堂情况记录考核。平时成绩能够有一定的依据作为支撑，基本可以相对公正的反映学生平时的各项表现。
根据专项检查要求，组织相关人员进行调研，逐一填写如下表格且写出分析报告；建议从试题与大纲的符合度、试题的难易程度、教学内容与方法、对学生学习的指导、平时成绩的信度、学生学习态度等方面分析；一门课程填写一张表格
专业
班级
课程名称
课程编码
任课教师
参加考试学生人数
卷面不及格人数
总评不及格人数
本试卷主要由五部分构成，分为选择题、判断题、简答题、计算题和综合分析题，主客观题分别占到了试卷的40%和60%。试卷所涉及内容覆盖教学大纲中所涉及的全部章节，符合人才培养方案的要求，且试题难易适中。本次试题较往年最大的变化是注重学生实际应用能力的考核及对知识点的理解和应用。简答题共3题，全部可以根据实际体会总结和回答；计算题第2题综合了排队论和流程设计两个章节的内容；分析题的背景也相对开放，需要学生“看图说话”，读懂，理解，并能分析和提出建议。
2、综合运用知识能力还不强。主要体现在最后的综合分析题，因为涉及到对知识点的理解和应用，往往无法清楚表达其理由；在分析中不能切中要害，往往没有阅读清楚背景材料就动笔，导致回答问题不全面，不能准确作答。
3、本次试题的选择上，记忆性的少，综合应用的多，学生在此方面依然表现出薄弱，虽然在日常教学中有所侧重，但还需进一步加强。这可能也是导致卷面整体分数不高的主要原因之一。
从试卷本身来看，卷面整体成绩看，及格率不高，仅达到%，总体卷面平均分为分，其中最高分分，最低分分，整体分数不够理想。从改卷过程中的得分情况看，分数差异主要表现为选择题得分差异较大，另外综合分析题和计算题第2题失分较严重，分析原因可能表现为以下几点：
1、基本概念理解不清。选择题和名词解释考核的都是基本概念的理解和识记，但是单选个别题目错误严重，可见对相关知识点掌握不全面、不准确。日后教学应加强这方面的练习力度。
该门课程为信息管理与信息系统专业的专业必修课，日常教学主要采用讲授为主，适当案例分析、课内外练习和企业运营模拟综合训练的方式进行。本学期共布置4次课外作业，全收全改2次；平时出现的共同问题，利用课上时间集中讲解；此外，全班共分成6组，进行两次生产运营模拟训练。该班学生整体学习态度认真，课堂表现较好，无迟到、旷课等现象，但课堂问答不够活跃，学习技巧和灵活运用能力还有待进一步提高，这也是后续教学设计想达到的目标。