叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定

一、 实验目的

1. 了解分光光度计的工作原理；

2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计；

3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度法。

二、 实验原理

叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。

叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm ，645nm 有吸收峰，叶绿素a 和叶绿素b 的浓度符合以下公式：

C a =0.0127A 663-0.00259A 645

C b =0.0229A 645-0.00467A 663 浓度单位是：g/L

C a =12.7A 663-2.59A 645

C b =22.9A 645-4.67A 663 浓度单位是：mg/L

叶绿素总浓度为： C T =C a +C b

若以试液中色素含量来表示，则

1000

)()()/(/⨯⨯=g ml L mg C ）g （mg 样品重提取液总体积鲜样叶绿素含量

三、 仪器、试剂和材料

1. 仪器

紫外-可见分光光度计、研体、25ml 容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管

2. 试剂

丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮

2. 材料

滤纸、石英砂、碳酸镁

四、操作步骤

1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g；

2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色；

3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。

4. 以80%的丙酮为参比液，在663和645nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。

五、结果处理

按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。

六、注意事项

1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。

2. 对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，仔细研磨后加入丙酮进行抽提。

3. 分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。

七、思考题

1. 当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？

附属实验：

1.溶剂极性对有机物精细结构影响

苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水

2.溶剂pH对光谱的影响

苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）