生命科学研究进展论文

RNA干涉及其应用

摘要 RNA干涉（RNAi）是将双链导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉默的一种。RNAi发生过程主要分为3个阶段:起始阶段，扩增阶段，效应阶段。RNAi在生物界中广泛存在.综述RNAi现象的发现、发生机制及其应用,并展望未来的研究.

关键词 RNA干涉 RNA干涉应用

RNA interference and its application

Abstract Introduction of double-stranded RNA into cells can induce specific mRNA degradation. This process is called RNA

interference(RNAi). It is a kind of post-transcriptional gene silencing. RNAi patlway can be divided into three step: initiation step, amplification step and effector step . RNAi exists in a wide variety of organisms. The discovery , mechanism and application were reviewed in the paper . In addition, the out look of RNAi was introduced .

Key words RNA interference application

RNA 干涉(RNA interference ,简称RNAi) 是将双链RNA(dsRNA) 导入细胞引起特异基因mRNA 降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉默(PTGS)的种.1998 年, Fire 等人[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现,由正义和反义RNA 退火形成dsRNA 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA 强10 倍以上. dsRNA 引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA 引起的基因表达抑

制在数学上的叠加,这就说明dsRNA 触发了细胞内的一些反应机制,

从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果. 当时,他们就把这种现象命名为RNA 干涉.RNAi 最早是在线虫C.elegans 上发现的[1 ].此后,人们发现在水蛭、锥体虫、涡虫、果蝇等无脊椎动物RNAi 都非常有效. 并且线虫和果蝇成为研究RNAi 的两个最常见的模式生物. 然而,在脊椎动物RNAi 研究却呈现阶梯式的发展. 开始,较长dsRNA(大于30 bp) 只能引起少数胚胎细胞(如斑马鱼和小鼠胚胎) 的RNAi 现象[2 ].然后,人工合成的21 nt 长的RNA 二合体(又称为small interfering RNA ,简称siRNA) 在培养的哺乳动物细胞(如人胚肾293 细胞和HeLa 细胞) 成功进行了RNA 干涉[3 ].最近,利用载体表达的small hairpin RNA(shRNA) 在许多培养的人源,猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi 实验取得了成功[4 ]. RNAi不仅存在于动物界,它还存在于植物界.在RNAi发现以前,人们已经发现,当植物被转移一个体内业已存在的基因以后,该基因的表达水平不但不升高,反而出现降低,这种现象在植物学中称之为共抑制(cosuppression).同样,转基因引起真菌的基因沉默现象被人们称之为quelling. RNAi发现以后,人们相继在烟草[5 ]和拟南芥[6 ]等植物证明dsRNA 可以引起植物的RNAi 现象. 由此可见,RNAi 是生物界广泛存在的一种现象. 许多和共抑制、quelling 相关的基因也和RNAi 相关,这也说明共抑制、quelling 和RNAi 等依赖同源序列的基因沉默有可能沿用了同一个反应机制. 1.RNAi 作用机制

近年来研究发现,干扰性小RNA( small interfering RNA ,或short

interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸( nt ) 的特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基

( Fig.1) [3～5 ]

Fig.1 The tructure of siRNA

RNAi 的主要过程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干扰

性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 细胞中dsRNA 可通过多

种途径形成,如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物;同时转录反

义和正义RNA ;病毒RNA 复制中间体;以及以细胞中单链RNA 为模板

由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在

线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA[6 ] .现已初步阐明RNAi 的作用机制[6 ]. RNAi 的第一步是,dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶)作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性dsRNA ,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在

Arabidopsis , C. elegans , Schizosac2charomyces pombe 以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反

义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA 诱导的沉默复合体( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介导切割靶mRNA 分子中与siRNA 反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用. RISC 由多种蛋白成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性等. 线虫C. elegans 中的MUT7 (一种RNase D 样蛋白) 可能是一种3′5′2 外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis 中的AGO1; N. Crassa 中的QDE2;C. elegans 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源.最新的研究[5 ] 进一步揭示,ATP 在siRNA 介导RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体;随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步

具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且

对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很

可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子.siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降

解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称