(整理)链霉素的生产

项目名称：链霉素的生产

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编制时间：2012/10/23

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文件编码：JL-SXBG-2012-微生物药物的生产-链霉素的生产

一、链霉素的概述

链霉素的化学结构式

定义

基本解释:一种抗生的有机碱C21H39N7O12 ,是由土壤放线菌( Streptomyces griseus )产生的,能有效地抵抗许多细菌,主要用其盐治疗结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其它传染病。

详细解释:抗菌素的一种。白色粉末，有苦味，对结核杆菌、鼠疫杆菌、大肠杆菌等有抑制作用。

简介

链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。由于链霉素肌肉注射的疼痛反应比较小，适宜临床使用，只要应用对象选择得当，剂量又比较合适，大部分病人可以长期注射（一般2个月左右）。所以，应用数十年来它仍是抗结核治疗中的主要用药；链霉素由灰色链霉菌发酵生产。双氢链霉素可由湿链霉菌产生，但通常以半合成方法生产；由灰色链霉菌产生的广谱抗生素，分子由链霉胍、链霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺组成；链霉素分子中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，其抗菌效能与链霉素大致相同，但对听觉神经的毒性比链霉素大。药理作用

链霉素是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。使DNA发生错读，导致无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类进入菌体，细菌细胞膜断裂，细胞死亡。

作用机理

链霉素和其他的氨基糖苷类药物一样是通过干扰细菌蛋白质合成而发挥抗菌作用的。链霉素结合了细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，干扰formyl-methionyl-tRNA与30SrRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成。人类与细菌的核糖体结构不同，从而使链霉素选择性地抑制细菌繁殖。

注意：链霉素一般作肌肉注射；口服不易吸收，只适用于肠道感染。

不良反应：

⑴过敏反应

链霉素与双氢链霉素均可和血清蛋白质结合形成全抗原，但所产生的抗体不同，因此无交叉反应，对链霉素过敏者可用双氢链霉素。然而有对二者均过敏史，颇须注意。过敏反应

包括：皮疹(0.3%～11%)，可表现为斑丘疹、荨麻疹、红斑、麻疹样皮疹、猩红热样皮疹、天疱疮样皮疹、湿疹样皮疹、紫癜及血管神经性水肿等皮肤表现。严重者可发生过敏性休克，严重过敏者反应还可并发急性溶血性贫血、血红蛋白尿、休克、急性肾功能衰竭等。

⑵毒性反应

1)急性毒性反应：麻木、头晕、耳聋等为多见，多在用药后10天内出现，最短者于注射后20分钟内出现麻木，持续1～6小时，重者可延续24小时尚不消失。亦有发生口周麻木、头晕、运动失调、头痛、乏力、呕吐、颜面潮红，严重者亦有发生大汗、呼吸困难、痉挛不易与过敏性休克区分者。但急性反应多见累积或渐次加重现象，部分病例仅在开始注射时出现反应，以后即消失。链霉素的急性反应一般认为与其所含杂质有关。

2)慢性毒性反应：

①第八对颅神经损害；a)耳前庭系损害，主要表现眩晕、头痛、经常指误等。以后出现运动性共济失调等；b)耳蜗系损害：一般发生较迟，常在用药数月后或停药以后发生。其主要症状是耳鸣和耳聋。

②对局部的刺激：肌注局部疼痛、肿胀、无菌性脓肿等，鞘内注射可引起发热、苍白、激动、胃纳减退、抽搐、休克，严重者可导致死亡等。

③对肾脏的损害：链霉素对肾脏的损害较轻，表现为蛋白尿和管型尿，部分出现肾功能暂时减退，停药后可恢复，严重的永久性肾损害并不多见。

④对骨髓的抑制：表现为白细胞、血小板减少，再生障碍性贫血及血细胞全少症等。以白细胞减少常见，再障及全血细胞减少偶见。

⑤还有多毛症、结膜炎、关节痛、心肌炎、中毒性脑病等。

⑶其他

肠道菌群失调，二重感染，多种维生素缺乏、口角炎、皮炎、腹泻等。

抗生素类别

1.多肽类此类抗生素吸收差、排泄快、无残留、毒性小、不易产生抗药性，不易与人用抗生素发生交叉耐药性。属于此类抗生素的主要有杆菌肽锌、黏杆菌素、维吉尼亚霉素、硫肽霉素、持久霉素、恩拉霉素和阿伏霉素等。

2.四环素类四环素类抗生素是四环素、土霉素和金霉素等抗生素的总称，均由链霉菌发酵产生。四环素类抗生素为广谱抗生素，对畜禽呼吸系统疾病和家畜的细菌性腹泻非常有效，连续低浓度投药有好的促生长效果，而且还能促进产蛋和增加泌乳量。但因四环素类抗生素属人畜共用抗生素，易产生抗药性。欧洲已禁止该类抗生素作为促生长抗生素应用，美国和日本仍在使用金霉素和土霉素季按盐，我国仍大量使用土霉素钙盐。

3.大环内酯类此类抗生素类是利用放线菌或小单孢菌产生的具有大环内酯环的抗生素的总称，因含有氨基糖而呈碱性。该类抗生素对革兰氏阳性菌，一些革兰氏阴性菌，耐青霉素的葡萄球菌，支原体都有抑制作用。同类中不同的产品生物活性有很大差别，如十六环大环内酯类抗生素生物活性最强，对多种耐药细菌有抗药活性。此类抗生素主要从肠道中吸收，能产生交叉耐药性，主要包括泰乐菌素、北里霉素、红霉素、螺旋霉素。

4.含磷多糖类此类抗生素对革兰氏阳性菌的耐药菌株特别有效，因其分子量大，不易被消化吸收、排泄快，在欧美广泛使用。常用的有黄霉素和大碳霉素。

5.聚醚类抗生类此类抗生素分子含有众多的环状醚键，显酸性，具有亲脂性，不溶于水，可溶于有机溶剂，成盐后的溶解性也相似。聚醚类抗生素抗菌谱广，具有离子运输的作用，它既是很好的促生长剂，又是有效的抗球虫剂。在动物消化道内几乎不被吸收，无残留。常用的有莫能菌素、盐霉素、拉沙里霉素和马杜霉素。

6.氨基苷类氨基苷类抗生素是分子中含有一个环已醇的配基，以糖苷键或与氨基糖相结合

（有的与中性糖结合）的化合物，也称氨基环醇类抗生素。此类抗生素用饲料有两种完全不同的作用，一种是抗菌性抗生素如新霉素，状观霉素和安普霉素；一种是驱线虫性抗生素，如越霉素A和潮霉素B。尽管作用不同，但此类抗生素有一个共同点，即在肠道内不易被吸收。

7.化学合成类此类抗生素由于副作用大，正被逐渐淘汰。大部分只允许做兽药，而不用作饲料添加剂。此类抗生素有磺胺类、喹乙醇、呋喃唑酮、硝呋烯腙等。

防治措施

1)合理使用链霉素，严格掌握适应证。目前链霉素主要用于结核、鼠疫等。

2)要严格掌握剂量及疗程。治疗结核成人用0.75克/天已够，不要用1克，可减少副作用发生，老年及儿童、肾功能不全者均应慎用，剂量要小，疗程要短。

3)严密观察各种毒副作用的症状和体征，一旦发现应及时处理，必要时立即停用。

4)不宜采用静脉或皮下注射法给药。

5)发生过敏性休克应立即组织抢救。

6)孕妇禁用，婴幼儿应尽量避免使用。

二、链霉素的生产工艺

㈠工艺流程图

2、生产原理

①灰色链霉菌的培养

灰色链霉菌的直形孢子链

Ⅰ简介：链霉菌的一种，其外在表现色为灰色。灰色链霉菌的最适生长温度为37℃，但其生产抗生素的最适温度为28℃。

Ⅱ性质：过硫酸铵分级沉淀,CM-SephadexC-50、CM-SepharoseFast

Flow离子交换层析及SephadexG-75凝胶过滤层析,从灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)RX-17的发酵上清液中得到了电泳纯的溶菌酶R1,回收率 6.89%.测得该酶分子量和等电点分别为16.8kD和9.10,作用于变链球菌(Streptococcusmutans)Ingbritt的最适温度和pH分别为70℃和6.6.R1酶在50℃以下及pH6～9的范围内保持稳定,60℃保温1h,残存酶活20.3%.Mg2+对酶有激活作用,而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+则使酶完全丧失活性,螯合剂、盐酸羟胺、碘乙酸抑制酶活,β-巯基乙醇及表面活性剂则对溶菌有部分促进作用.R1酶溶菌谱广泛,对多种卵清溶菌酶不能作用的G+、G细菌均有溶解能力,对变链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、乳杆菌(Lactobacillus)等则呈现高活性.

Ⅲ形态特征：灰色链霉菌是链霉素的产生菌，是土壤习居菌，具有典型的链霉菌的特征，主要是用于防治细菌感染，而且本身灰色链霉菌也是研究链霉菌的次生代谢调控的材料，如链霉菌阿A因子的研究主要就是集中在灰色链霉菌中。

灰色链霉菌的特征

Ⅳ应用：由灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)培养液提取而得的微生物蛋白酶。白色粉末。分子量20000。易溶于盐水和稀盐溶液，最适pH值7.8～8.0，最适温度60～80℃。有极强的蛋白水解作用，可切断蛋白质所含肽键的80%。能水解纤维蛋白、黏蛋白。在体内能与其抑制物结合，使酶活性中心受到保护，输送至病变组织，又能同抑制物分离，恢复其酶活性。医学上用于抗炎消肿。

②灰色链霉菌的活化

高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。

③灰色链霉菌的摇瓶种子培养

种子扩大培养简称种子扩培，是发酵工程的一个组成部分，其只将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

④灰色链霉菌摇瓶发酵

链霉菌是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素，属于氨基葡萄糖形碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。

链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷，其结构式如下。链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素

的硫酸盐。

⑤离子交换法提取和精制链霉素

链霉素是一种有机碱，其盐类在中性及酸性水溶液中可解离成三价阳离子、故可用阳离子交换树脂提取。

链霉素在PH4~7时稳定，所以链霉素的吸附只能在中性条件下进行。氢型羧酸型树用脂在酸性条件下电离度都很小，交换容量很低，只有在碱性条件下才能其交换作用，而链霉素在碱性条件下很不稳定。因此应将其转成钠型并选择在中性条件下进行吸附。

链霉素是高价离子，配制较稀的溶液有利于链霉素的吸附而不利于杂志的吸附，从而得到某种程度的提纯。羧酸型树脂对氢离子的亲和力大，用酸洗脱能使链霉素洗脱完全。链霉素离子交换吸附和洗脱可用下列方程式表示：

吸附：3RCOONa+St+3 （RCOO）3Str+3Na

洗脱：(RCOO)3Str+3H+ 3RCOOH+Str+3

链霉素经过离子交换树脂处理后，体积缩小十分之一，得以浓缩，而且纯度也有所提高。

⑥灰色链霉菌发酵产物活性测定

抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”（U）。经过国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”（IU）。通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。

抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对待定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑制圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管，管内放入标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑制圈。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2：1或4：1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。

3、操作步骤

⑴培养基

斜面培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚镁0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2-7.4（配置时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）

配制：按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000ml。趁热分装于18ml*180ml 试管，斜面以8ml为宜。分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2、摇瓶种子培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000ml、PH7.2-7.4。

配制：取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1Mpa下灭菌45-60min。

3、发酵培养基：葡萄糖4% 黄豆饼粉0.8% 硫酸铵0.5% 玉米浆1.5% 磷酸盐0.01% 碳酸钙0.04% 豆油0.2%

⑵发酵工艺

斜面孢子培养

将砂土管（或冷冻管）保持的链霉菌孢子接种到斜面培养基，于27℃下培养7天。

摇瓶种子培养

待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45-48小时，待菌丝生长旺盛。

种子罐扩大培养

取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种10%于种子罐内已灭菌的培养基，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62-63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温27℃下，发酵约7-8天。

⑶提取工艺

发酵液的预处理

发酵液用水稀释，草酸酸化至pH3.0左右，加热至75～80"C，通过离心分离或板框过滤，除去大量不溶性菌丝体、酸性蛋白、钙镁离子、培养基残渣等杂质，冷却至15℃以下，再用NaOH中和，得到符合离子交换工艺要求的澄清链霉素原液。

离子交换

应用钠型弱酸性阳离子交换树脂110树脂或大孔D一152树脂进行交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液--链霉素硫酸盐溶液。此时链霉素含量由不到1％浓缩到20％。然后让霉素硫酸盐溶液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和，得到提纯液。或用强酸性阳离子交换树脂1×25树脂和弱碱性阴离子交换树脂703树脂组成的混合床脱盐中和得到提纯液。

脱色及精制

将提纯液先经药用活性炭脱色处理，吸附色素和细菌内毒素，经减压蒸发，在45℃以下浓缩，得到精制液。此时链霉素含量由10％左右浓缩到45％。再经喷雾干燥得到白色或类白色的无菌粉末状的产品。

四、链霉素的规格

抗生素是一种生理活性物质, 可以利用抗菌性能表示它的效价, 通常以“单位”来表示。每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位u表示

以注射用硫酸链霉素为例

(1)0.75g(75万单位) (2)1g(100万单位)

(3)2g(200万单位) (4)5g(500万单位

五、质量标准及检测方法

1、性状：白色或类白色粉末，无臭或微臭，有苦味。

2、酸度：取本品，加水制成每1ml 中含20万单位的溶液，依法测定pH值应为4.5 ～7.0 。

3、溶液的澄清度与颜色：取本品5 份，分别加水5ml，溶解后,溶液应澄清无色；如显浑浊，与2 号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与各色5 号标准比色液比较，均不得更深。

4、干燥失重：取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在60℃减压干燥4 小时，减失重量不得过6.0 ％。

5、异常毒性：取本品，加氯化钠注射液制成每1ml 中含2600单位的溶液，依法检查按静脉注射法给药，观察24小时，应符合规定。

6、热原：取本品，加灭菌注射用水制成每1ml 中含2万单位的溶液，依法检查。

剂量按家兔体重每1kg 注射0.5ml ，应符合规定。

7、降压物质：取本品，依法检查，剂量按猫体重每1kg 注射3000单位，应符合规定。

8、无菌：取本品，分别加入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，使溶解，用薄膜过滤法处理后，依法检查应符合规定。另取装量10ml的0.5 ％葡萄糖肉汤培养基6 管，分别加入每1ml 中含2万单位的溶液0.25～0.5ml ，3 管在30～35℃培养，另3 管在20～25℃培养，应符合规定。

六、生产组织

申文娟、俞靖、贡静、顾海彬、杨恪鉴

七、成本核算

1、材料成本

2、人工成本

3、制造费用

八、EHS(环境、健康、安全)

1、废液、废料、发酵菌种要处理达标后排放。

链霉素生产废水是一类含硫酸盐的高浓度有机废水，ＣＯＤ／ＳＯ２－比值一般为５～７，碳氮比偏低，ＢＯＤ５／Ｎ在４左右，同时废水中含有较多生化抑制物质，如甲醛、草酸、链霉素单位及其降解物等。较高浓度硫酸盐的存在对正常的厌氧消化可能会造成严重影响。

2、对链霉素过敏的生产人员应避免直接接触药品。

3、各项操作严格遵循SOP严防安全事故的发生及应急预案制定。

注意事项

对患者应注意监测：①听电图，对老年患者需在用药前，用药过程中定期及长期用药后进行听电图检测高频听力损害；②温度刺激试验，在用药前、用药过程中定期及长期用药后用以检测前庭毒性；③肾功能测定，在用药前、用药过程中定期测定肾功能，以防止严重肾毒性反应。

(1)应监测血药浓度、血药峰浓度超过50μg/ml时引起毒性反应的可能性增加，对肾功能不全的患者应经常监测血药峰浓度，以不超过20—25μg/ml为宜。(2)不能测定血药浓度时，应根据肌酐清除率调整剂量，肌酐清除率可由本章氨基糖苷类所附公式计算而得。

(3)给予首次饱和剂量后，有肾功能不全、前庭或听力减退的患者应减量或停用，由于链霉素在体内不被代谢，主要由尿液排出，肾功能不全的患者体内可能积聚而达到中毒浓度。

(4)患者应给予充足的水分，以减少肾小管损害的程度。

(5)当用药数日或数周(结核病)后患者感觉病情有所好转时，仍需继续完成规定的疗程。这一点极为重要，尤其是结核病治疗过程中。治疗结核病必须持续用药1一2年，有时甚至需用数年或长期持续应用。但在已出现或即将出现中毒症状时或细菌已产生耐药性时，应即停用链霉素。

(6)肌注应经常更换注射部位，药液浓度一般为200—250mg/ml，不宜超过500mg/ml。

(7)长期用药可能导致不敏感细菌过度生长。