【微生物实验】实验三微生物的接种分离和纯培养wzj
微生物的分离、接种及培养技术
实验微生物的分离、接种和培养技术一、目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理，掌握常用的分离纯化微生物的方法2、学习掌握微生物的接种技术，建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。
接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
三、实验器材培养基：营养琼脂培养基，伊红美蓝培养基器皿：培养皿，接种环，酒精灯，玻璃涂棒，显微镜四、操作方法1、倒平板：将已经制备好的营养琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时倒入灭过菌的培养皿中。
2、涂布：在上述培养基中用无菌吸管吸取湖水的稀释液0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。
室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
3、培养：上述培养基平板倒置于37℃温室中培养24h。
4、伊红美蓝培养基准备：在已经制备好的伊红美蓝培养基中加入乳糖，加热溶化琼脂，冷却至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板；5、分离：将培养后长出的单个菌落挑取少许细胞，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在伊红美蓝培养基上将少许细胞先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，置37℃温室培养24h。
实验三、微生物的接种、分离和培养以及无菌操作
实验三、微生物的接种、分离和培养以及无菌操作一、实验目的1、掌握几种常见的菌种分离纯化、接种方法。
2、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。
二、实验原理微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞(或孢子)尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、YPD培养基、LB培养基。
4、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、实验方法(一)接种的操作1、斜面接种(接酵母菌)(1)操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
(2)将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
(3)先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
(4)左手拿接种环(如握钢笔一样)，以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
(5)用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出(图7-1.2)，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧过烫)。
(6)将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
(7)迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
(8)接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
(9)将接种环烧红灭菌。
放下接种环，再将棉花塞旋紧。
图1. 斜面接种示意图2、液体接种(1)由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物的接种分离纯化与培养方法
微生物的培养方法实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。
一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图1）图1 接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
微生物的纯种分离培养及接种技术
四、实验报告要求
1) 实验名称，学生姓名，学号，班号和实验日 实验名称，学生姓名，学号， 期 2) 实验目的和要求 3) 实验仪器，设备和材料 实验仪器， 4) 实验原理 5) 实验步骤 6) 实验原始记录 7) 实验数据计算结果 8) 实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思 实验结果分析， 考题， 考题，写心得体会
2.稀释平板分离法 2.稀释平板分离法 (1) 取样 … (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管 和无菌水将10 倍的水样稀释至10 和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓 将三套无菌培养皿编号， 度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基， 度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基， 待其冷至约45℃时以无菌操作倾注10~15ml 养皿中， 待其冷至约45℃时以无菌操作倾注10~15ml 入培 养皿中， 马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 动使之混合均匀， 成平板。 冷却后 成平板。 倒置， 37℃ 倒置，于 37℃培 样 品 48小时后观察 养48小时后观察 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 结果。 结果。
实验四
微生物的纯种分离培养 及接种技术
一．实验目的
通过学习学习微生物的纯 种分离，培养和接种技术， 进而学会微生物生理生化 反应的实验，为废水处理 服务。在水处理的细菌检 查中，细菌的分离，培养 和接种也是一个重要的环 节。微生物的纯种分离的 方法有两种：稀释平板法 和平板划线法。
二. 实验器材
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
实验微生物接种技术讲解
实验微生物接种技术讲解实验微生物接种技术讲解微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。
以下是小编为大家整理的实验微生物接种技术讲解，仅供参考，希望能够帮助大家。
实验微生物接种技术讲解1一、目的：学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌”概念，掌握无菌操作技术。
二、原理：所谓接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作条件下转移到另一已灭菌，并适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。
本实验要求严格进行无菌操作，一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。
根据不同的实验目的和培养方式，可以采用不同的接种工具和接种方法。
三、实验材料：斜面培养基、液体培养基、平板培养基、记号笔、酒精灯、接种针、消毒酒精、涂布棒等。
四、操作步骤（一）无菌操作菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。
用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。
可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。
操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。
（二）接种方法（1）斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。
此法用于好气性微生物的接种。
左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。
用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。
图1.斜面接种示意图（2）液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。
操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
微生物的分离与纯化实验报告
微生物的分离与纯化实验报告实验目的：
通过实验了解微生物分离的基本原理和方法；掌握微生物纯化方法，了解常用的分离培养基和微生物培养条件。
实验原理：
微生物的分离和纯化是微生物学中的基本实验技术之一。
微生物分离的基本原理是把混合菌落使之分离成单一菌落，并将分离出的单一菌落进行种类鉴定。
微生物纯化是指从混合菌落中将目标微生物菌种分离出来并纯化到原核培养物中。
实验步骤：
1. 原始样品的处理
将样品取一定量于无菌 Erlenmeyer瓶内，加入相应容积的生理盐水，均匀搅拌，并制成1：10、1：100、1：1000等稀释液。
2. 稀释液接种分离培养基
将稀释液通过平板涂布法、斜面培养法或混悬液播种法接种于相应的分离培养基中。
3. 观察菌落生长情况
分别观察不同菌液在不同培养基中生长情况，并根据菌落特征确定是否为单一菌种。
4. 分离纯化单一菌落
通过稀释、涂片和感染小白鼠等方法，将菌落分离纯化并制备鉴定鉴定纯菌株。
实验结果：
通过实验，我们成功地从样品中分离出多种微生物，并用分离纯化方法分离出了单一的微生物菌种。
结论：
通过微生物的分离和纯化实验，我们掌握了微生物分离的基本原理和方法，成功分离出单一菌种并加以鉴定。
这对于微生物学基础研究和其它相关领域具有重要的意义。
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
实验三 细菌的分离培养、纯培养和生化试验.
实验三 细菌的分离培养、纯培养和生化试验
一、 目的
掌握细菌培养、纯培养与基本微生物操作技能，了解生化试验原理、方法和意义。
二、实验内容
（一）细菌的分离培养：倾注法和划线法（倾注法：此法很少应用）本次试验采用前一种方法）划线法：融化普通琼脂培养基，倒平板，杂检。
取1号菌如下图之一划线，37℃培养24h 。
(二)钓菌和纯培养：观察菌落，选单个菌落，标记后，钓取目的菌落，如下图之一接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24h 。
（三）生化实验
1、糖发酵实验：原理。
将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组将1.2菌接种于两套糖发酵管中，倒立37℃培养24h 。
2、靛基质实验：原理。
每组将2、3号菌接入蛋白胨水培养基中，37℃培养4天后，
加入靛基质试剂，观察结果，
3、VP、MR实验：原理。
每组分别将1、2号菌接入2管葡萄糖蛋白胨中，37℃培养2天分别加入VP、MR试剂，观察结果。
4、H2S实验：原理。
每组分别将1、2号菌接入普通肉汤培养基中，无菌操作插入Pb(AC)2纸条，37℃培养24h，观察结果。
三、实验报告内容
1、说明平板划线法分离培养细菌的方法及注意事项，描述你的实验结果并分析原因。
描述所钓取菌落的特征。
2、描述生化实验现象、结果，并用原理分析各生化实验结果及出现非理论结果的原因。
附表：理论结果
2大肠杆菌○+○+○+○+○++ －+ －
沙门氏菌○+- ○+○+－－－+ +。
微生物的接种、分离和培养
实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理与操作要领。
2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。
3．了解微生物需氧培养的方法。
4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。
二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。
根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。
2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。
常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。
平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。
本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。
4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。
平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。
菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。
菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。
微生物 接种、分离纯化与培养
（2）分离现象 通过遗传育种获得的多核（或是单核） 菌种，由于其DNA双链中仅一条单链发生突 变，随着传代，其生产性状也将发生退化。 这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身 不纯，高产突变只发生在一个核和一条DNA 单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因 而突变基因与未突变基因发生分离，于是 就出现了突变的高产菌株和未突变的低产 菌株。
（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这 样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇 冷形成冰晶而伤害细胞。 美国 ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低 1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管 放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升， 冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮 的残存量，定期补加。 （4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管 从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速解冻，当升温至 0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。
项目六 接种、分离纯化与培养
学习目标 • 了解微生物的遗传和变异 • 熟悉微生物保藏的原理和方法 • 掌握微生物接种、分离与培养的 方法
微生物的遗传和变异
遗传： 亲代与子代相似
亲代与子代、子代间不同 变异： 个体不完全相同
微生物遗传和变异的物质基础：
染色体
质粒
微生物变异的类型：
表型变异
环境发生变化 暂时 可逆 不可遗传
物品清点与摆放超净工作台的消毒手消毒接种微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体通过在平板上划线可得到单个菌落因此可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物融化培养基倒平板做分区标记分区划线操作恒温培养菌落清理涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液置于已凝固的无菌平板培养基表面然后用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平板表面禁培养或在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落然后挑取典型的代表移至斜面经培养后保存适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离与计数倒平板菌液稀释涂布平板平板培养菌落滴加菌液
实验三微生物的分离纯化与观察
六 思考题
• 1、分析阿斯毕培养基成分，说明其适用于 分离自生固氮菌的原因。
• 2、划线分离时，为什么每次都要将接种环 上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？
• 3、如何从自然界中分离自己所需要的纯培 养？应注意哪些问题。
12
3
有利于获得其纯培养。
平板分离的方法主要有：
1、平板划线分离法； 2、稀释涂布平板法。
除能有效分离纯化微生物外， 还可用于测定样品中活菌数 量。
4
•
土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料
是由微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。
•
要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，
实验二 微生物的分离纯化、
接种培养与保藏
2021/8/11
1
一 实验目的
• 1、了解微生物分离和纯化的原理 • 2、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的
无菌操作技术 • 3、
2
二 实验原理
• 为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微 生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方 法称为微生物的分离。
• 3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，2 8oC培养3~4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。
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五 注意事项
• 在微生物分离、纯化每一操作环节，要严 格按照无菌操作进行。
• 平板划线时，划线部位不可重叠。 • 划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧
掉。 • 培养皿要贴标签，包括班级、姓名
• 为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一 种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条 件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能 含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生 物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制 人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往 往在分离真菌的PDA培养基中加入适当的孟加拉红，链霉 素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术之欧阳道创编
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术之欧阳法创编
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
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接种无菌操作步骤
3. 右手无名指、小指和手掌边夹住两试 管棉塞，轻轻拔出，试管口过火后移开， 仍靠近并面向火焰；
4. 将接种环伸入试管，稍冷后沾取少量 菌体。 5. 以下详见不同接种方法。
斜面接种技术
1. 用接种环经无菌操作从菌种斜面挑取少量 菌体； 2. 将接种环引入待接种的斜面，自下而上在 斜面上划一直线，再垂直于该直线连续划线； 3. 取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉 塞，灼烧用过的接种环并放回原处； 4. 将棉塞塞紧，将斜面放入培养箱中培养。
平板活菌计数法步骤
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
菌悬液 10- 10- 10-
12
3
冷却至45 ℃左右
每皿约倒入15ml
沙保培养基
10- 10-5 10-6
40.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
平板活菌计数法
待凝后倒置于28℃恒温培养48 hr后计数。 （选择菌落数在25～250个左右的平板计数）
3. 左手取一无菌培养皿，在火焰边稍稍打开 皿盖，倒入培养基15ml左右，放在桌面上 轻轻摇匀，待凝后即成平板；
琼脂平板划线分离法
4. 以无菌操作用接种环沾取待分离的混合 菌液；
5. 左手持培养皿底并使其面向火焰，依次轻 轻而迅速的一条条紧接着划线，划线距离 恰当（尽量靠近，但线与线勿碰到），划 过下面后不要回上去重复划；
实验菌种：大肠杆菌一支 酵母菌一支
斜面接种技术
斜面划线示意图
液体接种技术
1. 以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液 体培养基中，在接近液面处的试管壁上轻 轻摩擦，适当摇动，使之均匀分布在液体 中；
2. 塞紧棉塞后，放入恒温培养箱内培养。 实验菌种：大肠、酵母各一支
穿刺接种技术
1. 用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺 与半固体培养基中间，刺至管底，再按 原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻 巧、快速；
其中N为每中格内菌数的平均值。
注数法
一、实验原理
微生物在固体培养基上形成的单 菌落，
一般认为是由一个细胞繁殖而来，及一 个菌
落代表一个细胞。计数时，将待测菌样 做一
系列稀释，再取一定稀释度一定量的稀 释液
接种到平板上，使其均匀分布。经培养
菌液浓度计算 菌液浓度（菌数/mL) = 菌落数×稀释倍数×2 注：只数浓度合适的两个平板取平均值
注意事项
1. 过程的无菌操作 2. 稀释分离法中熔化后的培养基倒平板前温度控制 3. 稀释法中用吸管取试管中液体的顺序从稀到浓 4. 取样前注意摇匀待测菌液 5. 取样时都要无菌操作。注意取菌液时移液管不要
实验内容： 微生物接种，分离和计数
远离酒精灯的情况下， 不得打开桌上的任何器皿
接种
接种技术是将微生物接到适于生长繁殖的 人工培养基或生物体内的过程。 接种方法：斜面接种、液体接种、半固 体穿刺接种等 接种工具：接种环、接种针、移液管和刮 铲等
接种必须在严格无菌的环境中进行！
接种方法
斜面接种技术：从已长好的菌种斜面上挑取 少量菌种移至另一新鲜斜面 培养基上；
液体接种技术：从菌种斜面上接入到液体培 养基中；
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出；
2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
方法有琼脂平板划线分离、稀释分离、选择性 培养基分离、单细胞挑取、菌丝切割法等。
分离
琼脂平板划线分离法
稀释分离法 实验菌种：大肠、枯草、四联混合菌 菌液
琼脂平板划线分离法
1. 将熔化好的肉汤培养基，冷却至45℃左右； （触摸不烫手）。
2. 左手持盛培养基的三角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
2. 塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培 养24小时观察结果。 实验菌种：四联、变形杆菌各一支
纯种培养
自然界中的微生物通过分离，使之在固体 培养基上成为一个菌落，便可获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释， 使之分散，在固体培养基上形成单个菌落， 再转接到适当的培养基上，我们一般就认为 是纯种。
2.无菌操作取混合菌液一环于Ⅰ中，摇匀；
3.同法自Ⅰ管至Ⅱ，自Ⅱ管至Ⅲ；
4.用1ml无菌吸管，分别从
管中吸
取0.2ml于三个无菌培养皿中，编号；
5.倒入熔化冷却至45℃左右的肉汤培养基Ⅲ15m、l左Ⅱ右，、轻Ⅰ轻摇匀，待凝
后倒置培养,24-48小时观察结果。
稀释分离示意图
一环
一环
一环
菌悬液
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法 计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片， 上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后， 由 于两者之间存在着距离使之形成一定容 积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充
血球计数法
二、血球计数器的构造
0.1mm 1/400mm2
盖玻片
25*1 6
计数室体积 =(1×1×0.1)m m3 = 10-4cm3
1mm
1mm
血球计数板
血球计数法
三、血球计数法的步骤
1、取待测啤酒酵母菌液，摇匀。并 做适 当稀释（以每个中格内20左右为宜）。
2、取洁净干燥的血球计数器，盖上 盖玻 片，用滴管吸取少量菌液沿盖玻片边 缘滴入
6. 盖上培养皿盖，倒置于37℃恒温培养箱中 培养24-48小时后观察结果；
琼脂平板划线分离法
每种划 一块
实验安排（两人一组）
斜面接种：两人1支 液体接种：两组1支（大肠） 平板划线分离：每人划两块平板
稀释分离法
1.取无菌生理盐水（NaCl0.85%)试管三支（每
支4.5ml)，编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；
血球计数法
示范动作
血球计数法
3、先在低倍镜下找到计数室，注意光线不 能太亮，再转到高倍镜下，取5个中格进行 计数（每个中格取4个小格）。
计数时注意调节焦距，使不同焦距的菌 体都计入，在线上的菌，数上不数下，数 左不数右。
血球计数法
4、菌液浓度计算
菌液浓度 (菌数/mL) = N×25×104×稀 释倍数