单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定
相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定张立营;赵怀龙;马凤龙;傅兴伦;孙英姿;高波【摘要】目的制备相思子毒素单克隆抗体并鉴定其特性.方法以甲醛处理的相思子毒素毒蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果获得了4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2D3、4E6、1C8和1E5,诱生的腹水效价分别为1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106,亚类鉴定表明2D3为IgG1,其余3株均为IgG2b;特异性鉴定显示它们与多种毒素均无交叉反应,经过亲和层析,获得了纯化的单抗.结论获得了特异性的相思子毒素单克隆抗体,为建立相思子毒索的检测及纯化方法奠定了基础,其中4E6的效价最高,可作为检测相思子毒素的核心试剂.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2010(027)009【总页数】3页(P828-829,832)【关键词】相思子毒素;单克隆抗体;制备【作者】张立营;赵怀龙;马凤龙;傅兴伦;孙英姿;高波【作者单位】266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科【正文语种】中文【中图分类】R392.11相思子毒素是从豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8%～3.0%。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体
克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一 般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞 有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤 细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所 以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性 强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、 软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
周期第1天采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清） 第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂） 第14天第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第21天采血和ELISA检测 第35天第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第42天采血和ELISA检测 第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水） 第61天细胞融合
细胞融合
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或 5:1最为常用。
1．试剂与材料 (1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (2)1640培养液100ml。 (3)完全1640液100ml。 (4)2.5%FCS－1640液50ml。 (5)HAT培养液100ml。 (6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热 于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。 (7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。 (8)40孔塑料培养盘。
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。
本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。
其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。
随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。
相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则引言：单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是一种由单一细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力，被广泛应用于医学研究和临床治疗。
然而，为了确保单克隆抗体的质量和安全性，需要建立一套严格的质量控制技术指导原则。
本文将详细介绍人用单克隆抗体质量控制技术的原则和方法。
一、生产过程质量控制1. 细胞系的选择和鉴定选择适合的细胞系是制备高质量单克隆抗体的关键。
应选择已经鉴定并验证的细胞系，确保其稳定性和一致性。
常用的细胞系包括CHO细胞和NS0细胞等。
2. 培养条件的优化为了获得高产量和高质量的单克隆抗体，需要对培养条件进行优化。
包括培养基的配方、温度、pH值、气体环境等。
此外，还需要对培养过程中的营养物质和代谢产物进行监测和控制。
3. 细胞培养过程监测监测细胞培养过程中的关键参数，如细胞密度、细胞活力、细胞代谢产物等。
通过定期取样并进行分析，及时发现并解决问题，确保培养过程的稳定性和一致性。
4. 细胞培养过程中的污染控制细胞培养过程中的污染会对单克隆抗体的质量产生严重影响。
因此，需要采取措施防止细菌、真菌和病毒的污染。
包括严格的无菌操作、培养基和培养器具的消毒等。
二、单克隆抗体质量控制1. 抗体纯化和纯度分析单克隆抗体的纯化是确保其质量的重要步骤。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
纯化后，需要对抗体的纯度进行分析，如SDS-PAGE和Western blot等。
2. 抗体活性和特异性检测抗体的活性和特异性是评估其质量的关键指标。
常用的检测方法包括ELISA、流式细胞术和免疫组化等。
通过与目标抗原的结合能力和特异性进行检测，评估抗体的活性和特异性。
3. 抗体稳定性评估抗体的稳定性是其在储存和使用过程中的重要性能之一。
需要对抗体在不同条件下的稳定性进行评估，如温度、pH值和离子强度等。
通过稳定性评估，确定抗体的适宜储存条件和有效期限。
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用
抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用1. 抗CD19单克隆抗体概述在免疫疗法领域，抗CD19单克隆抗体被广泛应用于治疗B细胞相关的疾病，尤其是B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病。
CD19是B细胞表面的一种标志性蛋白，它在B细胞的发育、激活和功能中扮演重要角色。
抗CD19单克隆抗体可以选择性地杀伤CD19阳性的B细胞，而对其他细胞几乎没有影响，从而成为治疗B细胞相关疾病的有效手段。
2. 抗CD19单克隆抗体的制备方法抗CD19单克隆抗体的制备主要通过以下步骤实现：1.免疫原：首先需要获得CD19的免疫原，常见的方法包括从CD19表达的细胞中提取膜蛋白或人工合成片段。
2.免疫动物：将免疫原注射到小鼠或大鼠等实验动物体内，触发其免疫系统产生抗CD19抗体。
3.融合细胞：从免疫动物中获取B细胞，并将其与瘤细胞或其它细胞融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞能够不断产生具有特异性的抗CD19抗体。
4.提取与纯化：从培养基中提取并纯化目标抗体，经过一系列的纯化步骤，最终得到高纯度的抗CD19单克隆抗体。
3. 抗CD19单克隆抗体的临床应用抗CD19单克隆抗体作为治疗B细胞相关疾病的新战略，已在临床上取得了显著的成果。
以CAR-T细胞疗法为代表的治疗手段，就是通过将患者自身的T细胞进行基因改造，使其表达抗CD19单克隆抗体，从而实现对恶性B细胞的杀伤。
在自身免疫疾病的治疗中，抗CD19单克隆抗体也展现出了良好的疗效。
通过选择性地清除异常活化的B细胞，可以有效地控制自身免疫疾病的发作和进展。
4. 个人观点和理解抗CD19单克隆抗体作为一种新型的免疫治疗药物，不仅在临床上展现出了显著的疗效，而且为免疫疗法领域带来了新的活力和希望。
在未来，随着对其作用机制和临床应用的进一步深入研究，相信抗CD19单克隆抗体会在更多疾病的治疗中发挥重要作用，并为患者带来更好的治疗效果。
结语通过对抗CD19单克隆抗体的概述、制备方法和临床应用的全面探讨，我们对其在治疗B细胞相关疾病中的重要作用有了更深入的理解。
单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定
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２３ ・ ２
中国生物制 品学杂志 ２０ ０ ２年第 １ ５卷第 ４期
Ｇｒ ｉｌ ｉ ｌ２０ ， ｏ ．５ Ｎ ． ｉ ＪＢｏｏ ｃ ｓ ０２ Ｖ １ １ ． ｏ４ ｎ ｇａ
单纯 疱 疹 病 毒 单克 隆 抗 体 的 制备 及 鉴 定
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【 ｅ ｏｄ 】 Ｈ ｒ ｓ ｉｐ ｘ ｉｓ ｃｂ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｅ ｅ ｓ ｌ ｒ Ｍ Ａ ｐ ｍ ｅ ｖｕ
单 纯疱 疹 病 毒 （ ｅ ｅ ｉｐ ｘＶｒｓＨ Ｖ） 有 Ｈ ｒ ｓｓ ｌ ｉ ， ｓ 是 ｐ ｍ ｅ ｅ 包 膜 的双 链 Ｄ Ａ病 毒 ， 分 为 Ｈ Ｖ一１Ｈ Ｖ一２两 Ｎ 可 Ｓ 、Ｓ 型 ，Ｓ Ｈ Ｖ一１主 要 感 染 人 腰 部 以上 的粘 膜 及 神 经 系 统 ，Ｓ Ｈ Ｖ一２主 要 引起 生 殖 道感 染 Ｌ Ｊ １ 。利 用 杂 交瘤 技 术 可获得 多 种 Ｈ Ｖ一１ Ｈ Ｖ一２的单 克 隆 抗 体 ， Ｓ 和 Ｓ 这 些单 克隆 抗 体 的 获 得 是 单 纯 疱 疹 病 毒 分 型 、 检测 以及研 究 病毒 蛋 白结 构 与功 能 的 重要 工具 。 本 实 验 利 用 免 疫 学 方 法 ， 过 细胞 融 合 的杂 交 通 瘤 技术 制备 抗单 纯 病 毒 的单 克 隆 抗 体 ， 以后 开 发 为 诊 断试 剂 打下 基 础 。
Ｂ ＡＬＢ ｃ ｍｉｅ ｗｅ ｅ ｉ ／ ｃ ｒ ｍｍｕ ｉｅ ｉ ｅ ｐ ｒ ｅ ａ ｉｅ ｆＨｅｐ ｓ ｓ ｐ ｅ ｉ ｓ， ｎ ｅ ｓ ｌｅ ｅ ｆｔ ｅ ｎｚ ｄ ｗ ｔ ｔ ｕ ｉ ｄ ｎｔ ｎ ｏ ｒ ｅ ｉ ｌｘ ｖｒ ａ ｄ ｔ ｐ ｅ ｎ ｃ Ｈｓｏ ｍ ｈ ｈ ｉ ｆ ｇ ｍ ｅ ｈ ｈ ｗｅ ｅ ｆ ｅ ｔ ｌｍａ ｃ ｌ Ｔ ｙ ｒｄ ｍａ ｃ ｌ ｔａｎ ｒ ｓ ｒ ｎｅ ｙ ｉ ｄ ｒｃ Ｉ Ａ ｄ ｕ ｔｒ ｄ ｂ ｒ ｕｓ ｄ ｗ ｈ ｍｙｏ ｅｌ ｗｏ ｈ ｂ ｉｏ ｅｌｓｒｉ ｓ ｗｅ ｉ ｓ． ｅ ｃ ｅ ｄ ｂ ｎ ｉｅ ｔＥＬ Ｓ ａ ｃ ｌｕ ｅ ｙ ｎ ｃｏ ｉ ｇ ａ ｄ ｔｅ Ｍｃ ｓ ｓ ｃｅｅ ｙ ｔｅ ｗｅ ｕ ｉ ｅ ｒｍ ｅ ａ ｃｔｓ ｏ ｃ ｄ ｄ ｔｃｅ ｏ ｐ ｃｆｃｔ ｌｎ ｎ ， ｎ Ａｂ ｅ ｒ ｔｄ ｂ ｍ ｒ ｐ ｒｆ ｈ ｈ ｅ ｉ ｄ ｆｏ ｔ ｓ ｉｅ ｆｍ ｅ ａ ｅｅ ｔ ｆｒ ｓ ｅ ｉ ｉ ｈ ｉ ｎ ｄ ｉ ｙ． Ｒｅ ｕ ｔ Ｎｏ ｃ ｏ ｓ ｒａ ｔｏ ｓ ｏ ｓ ｒ ｅ ｍｏ ｇ ｔｅ Ｍｃ ｓ ｓ ｃｅｅ ｙ ｔ ｅ ２ ｓＩ ｉｓ ａ ｄ ｏ ｅ ｅｅ ａ ｔａ ｔ— ｓ ｌｓ ｒｓ ｅ ｃｉｎ ｗａ ｂ ｅ ｖ ａ ｎ Ａｂ ｅ ｒ ｔ ｂ Ｉａｎ ｄ ｈ ｄ ｈ ｎ ｔ ｒ ｒ ｌｖ ｉ ｈ ｎ ｎ ｇ ｎ ． ｓｅ ｂｏ ｈ ｗｅ ａ ｏ ｆ ｔｅ ｒ ｃ ｇ ｉｅ ｅ ＨＳＶ ｒ ｔｉ ｔ ｅａ ｖ ｌｃ ｌ ｒ ｗｅｇ ｔｏ ｅ ｓ Ｗｅ ｔｍ ｌｔｓ ｏ ｄ ｔ ｔｂ ｔ ｏ ｍ ｏ ｎｚ ｄ ｔ ｈ ｈ ｈ ｅ ｈ ｐ ｏｅｎ ｗ ｈ ａ ｒ ｌｄ ｅ ｍｏｅ ｕ ａ ｉｈ ｆ ｉ ５ ０ ０． ｎｃｕ ｉ ｎ Ｔｈ ｒｐ ｒ ｔ ｎ ｉ ｄ ｎｉ ｅ ｓ ｔ ｅ Ｍｃ ｏ ＨＳＶ． ０ ０ Ｃｏ ｌ ｓｏ ｅ ｐ ｅ ａ ａ ｏ ｓ ｉｅ ｔ ｄ ａ Ａｂ ｔ ｉ ｉ ｆ ｈ
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维普资讯
中国免疫学杂志 ２Ｏ Ｏ ８年第 ２ 卷 ４
・
免疫 学 技术 与 方 法 ・
ｐＣｎ蛋 白单 克 隆 抗体 的 制备 及 初 步鉴 定 ① Ｉｌ
李 晓梅 李 俐 马颖 哲② 郗 艳 丽 张 蒙
（ 吉林 大学 白求 恩 医学 院生物 化学教 研 室 、 二综合 实验 室 ， 春 １ｏ２） 第 长 ３ｏ１
中国图书分类号 １ ９ ．１ １ ２１ ３ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０－８ Ｘ（０ ８０ ． ４ －４ ００４ ４ ２ ０ ）７０ ００ ６
［ 摘
要 ］ 目的 ： 制备特异性 的抗 ｐＣｎ 白的单克 隆抗 体 （ Ａ ） 为 ｐＣｎ的纯 化及检测 等提供 必要 的工具 。方法 ： Ｉｌ蛋 Ｍｃ ｂ ， Ｉｌ 以
Ｌ Ｘａ — ｉ Ｕ Ｌ ， Ａ Ｙｎ －ｈ ， ｌＹ ｈＬ ， Ｈ Ｎ ｎ Ｄｐ ｒ ｅｔｏ ｉ ｈｍｓｙ Ｓｈ ｏ ｏ ａｉ ｎＭｅｉ ｌ ／ ／ Ｍｅ， ／ Ｍ ｉ Ｚ ｅ Ｘ ａ —ｉ Ｚ Ａ Ｇ Ｍｅｇ． ｅａｔ ｎ Ｂｏ ｅ ｉｒ ． ｃｏｌｆ Ｂ ｑｕ ｄ ａ ｏ ｇ ｍ ｆ ｃ ｔ ｅ ｃ
Ｗｅｔ ｌ 等 检测 。结果 ： ｓｒ ｂ ｔ ｅ ｏ ｎ 获得 了稳定 的分泌型杂交瘤 细胞株 大２ ７和 ４ ３ ２ ７培养 上清液单抗效价为 １６ ， ｉＣ 亚型 ， Ｂ Ａ ，Ｂ ：４ 属 ｇ ｌ 其 腹水抗体效价及纯化抗体 的效价分别 为 １ １２ Ｏ、 ：． Ｏ， ｓ ｒ ｌ 及 免疫 耗竭实验 呈现一条 约 ４ Ｄ的特异性 带 ， ： ．８ ｌ４ １６４Ｘｌ３Ｗｅｔ ｂ ｔ Ｘ ｅ ｏ ｎ ０ｋ 免疫组织 化学 染色显示 在细胞核和细胞质 中呈现 阳性反应 。结论 ： 本次制备 的单抗具 有特异性 、 高效 价 ， 可应用于 ｐａｎ 白 Ｉ 蛋 的纯 化及 检测 等研 究。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理引言：单克隆抗体是一种与特定抗原高度亲和的抗体，它由单一的B细胞或其衍生的细胞克隆产生。
单克隆抗体制备是一项重要的生物技术手段，广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
本文将介绍单克隆抗体制备的原理及其在科学研究和医学应用中的重要性。
一、单克隆抗体的起源和背景抗体是机体免疫系统中产生的一种特殊蛋白质，可以识别和结合抗原，从而参与免疫应答。
传统的抗体制备方法主要依赖于动物免疫，但存在许多局限性，如免疫反应的不可控性、抗体来源有限等。
为了解决这些问题，科学家发展出了单克隆抗体制备技术。
二、单克隆抗体制备的原理单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术。
具体步骤如下：1. 抗原免疫：将目标抗原注射到小鼠等哺乳动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
2. 细胞融合：从免疫小鼠体内提取B细胞和骨髓细胞，将它们与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞株SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮于含有选择性培养基的培养皿中，使非杂交细胞死亡，只留下杂交瘤细胞。
4. 单克隆细胞扩增：将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每孔只包含一个细胞，培养并扩增单克隆细胞。
5. 单克隆抗体收集：从培养上清中收集单克隆抗体，经过纯化和鉴定，获得纯度较高的单克隆抗体。
三、单克隆抗体制备的重要性1. 高亲和力和特异性：与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的亲和力和特异性，可以更准确地结合目标抗原。
2. 可重复性和稳定性：单克隆抗体制备的过程可以被重复进行，从而获得相同的抗体产品。
此外，单克隆抗体也具有较长的稳定性，可以在不同实验条件下保持一致的性能。
3. 应用广泛：单克隆抗体广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
例如，单克隆抗体可以用于肿瘤标记、疾病诊断、药物靶点鉴定等。
4. 抗体工程的基础：单克隆抗体的制备为后续的抗体工程提供了基础。
通过改变单克隆抗体的结构和功能，可以获得更加理想的抗体产物。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
本文将介绍杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理、流程及其应用。
一、原理单克隆抗体是指来自同一B细胞克隆的抗体，它具有高度的特异性和稳定性，广泛应用于生物医学、生命科学和工业等领域。
杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理是将体外免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，使其继承了B细胞产生抗体的能力和骨髓瘤细胞的不死性，从而长期稳定的产生单克隆抗体。
二、流程制备单克隆抗体的流程主要分为以下五个步骤：1. 免疫动物：将抗原注射于小鼠等哺乳动物体内，诱导其产生抗体。
2. 分离B细胞：从免疫动物体内获取脾脏，制备成单细胞悬浮液。
3. 融合细胞：将分离的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤细胞：用选择性培养液筛选并纯化杂交瘤细胞，使其长期稳定的产生单克隆抗体。
5. 鉴定鉴定单克隆抗体：对产生的单克隆抗体进行鉴定，并获取其蛋白质序列，以便制备大规模的单克隆抗体。
三、应用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体已广泛应用于许多领域。
在医学上，单克隆抗体已成为重要的诊断和治疗工具。
例如，抗癌单克隆抗体可以选择性地靶向癌细胞，疗效显著。
在生命科学领域，单克隆抗体也广泛应用于分子生物学、组织学和免疫学等方面。
在工业领域，单克隆抗体可以用于生化工业、食品工业和环保等方面。
综上所述，杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
它的原理简单、流程清晰，经过鉴定的单克隆抗体具有高度的特异性和稳定性，有着广泛的应用前景。
简述单克隆抗体技术的基本原理
简述单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用和前景。
单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单克隆抗体。
下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。
一、鼠源性单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化，即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。
鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应，从而限制了其在临床应用中的使用。
二、嵌合型单克隆抗体为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。
嵌合型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。
嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。
嵌合型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。
嵌合型单克隆抗体的制备过程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。
随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。
人源性单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产，另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。
人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。
由于人源性单克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的价值。
蛋白单克隆抗体的制备过程
蛋白单克隆抗体的制备过程一、抗原制备在制备蛋白单克隆抗体之前，需要先制备抗原。
抗原的制备通常包括选择目标蛋白、获取抗原、免疫原性检测等步骤。
目标蛋白可以是从天然产物中提取的纯蛋白，也可以是重组蛋白。
获取抗原的方法包括化学合成、基因工程表达等。
免疫原性检测主要通过动物免疫实验来评估抗原能否诱发免疫反应。
二、免疫动物免疫动物是制备单克隆抗体的关键步骤之一。
通常选择小鼠或大鼠作为免疫动物，用制备好的抗原对其进行免疫注射。
免疫注射的途径可以是腹腔注射、肌肉注射等，免疫剂量和免疫次数需要根据抗原的性质和目标抗体亲和力等因素进行确定。
三、细胞融合细胞融合是将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞的过程。
骨髓瘤细胞是用来提供细胞增殖能力的，而B淋巴细胞则提供产生抗体的能力。
细胞融合方法包括化学融合法和电融合法。
四、克隆筛选克隆筛选是在融合后的细胞群体中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞的过程。
筛选方法包括间接ELISA、抗体捕获ELISA、放射性同位素等方法。
筛选出的阳性克隆需要经过进一步的验证和鉴定。
五、抗体检测与纯化在确定阳性克隆后，需要对其产生的抗体进行检测和纯化。
抗体检测可以通过Western blot、ELISA等方法进行。
抗体纯化可以通过色谱技术、离子交换等方法进行。
六、冻存与保存最后，将制备好的单克隆抗体冻存并保存。
冻存时需要添加保护剂，如二甲基亚砜（DMSO）等，以保护抗体不受损伤。
保存温度通常为-70℃至-196℃。
为了保证单克隆抗体的长期保存和稳定性，可以在液氮中保存抗体。
在使用抗体时，需要注意温浴、稀释等操作步骤，以确保抗体的稳定性和效果。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体的制备过程包括鉴定抗原、免疫动物、制备抗体、纯化抗体和评价抗体等步骤。
鉴定抗原：鉴定抗原是单克隆抗体的制备过程中的第一步，需要确定免疫动物对抗原的反
应性。
免疫动物：免疫动物是单克隆抗体的制备过程中的第二步，需要选择具有良好免疫反应的
动物。
制备抗体：制备抗体是单克隆抗体的制备过程中的第三步，需要将抗原注射到免疫动物体内，以诱导动物产生抗体。
纯化抗体：纯化抗体是单克隆抗体的制备过程中的第四步，需要对制备的抗体进行纯化，
以得到高纯度的抗体。
评价抗体：评价抗体是单克隆抗体的制备过程中的第五步，需要对纯化的抗体进行评价，
以确定其性能。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、引言在生物医学研究和临床治疗中，单克隆抗体被广泛应用。
它可以通过与特定的抗原结合来识别和定位目标分子，为研究人员提供了重要的工具。
在本文中，我们将深入探讨单克隆抗体的制作流程，包括免疫原选择、免疫动物制备、细胞融合和单克隆抗体筛选等环节。
二、免疫原选择免疫原的选择对于制备具有高特异性和亲和力的单克隆抗体至关重要。
首先要确定所需的抗原特征，例如结构域、修饰形式等。
常见的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、小分子化合物等。
在选择免疫原时，需考虑其易得性、免疫原性、纯度、稳定性等因素。
2.1 蛋白质和多肽免疫原蛋白质和多肽通常是制备单克隆抗体最常用的免疫原。
选择合适的蛋白质或多肽，可以根据目标蛋白的功能域、线性表位或立体结构等特征。
对于复杂的蛋白质，可以选择亲和纯化后的特定结构域或表位作为免疫原。
2.2 糖类免疫原糖类通常具有较复杂的结构，选择适当的免疫原十分关键。
在制备糖类免疫原时，可以选择与糖链特异性结合的蛋白质作为载体，通过共价结合将糖类连接到蛋白质上，并保持其天然的空间构象。
2.3 小分子化合物免疫原小分子化合物通常具有较弱的免疫原性，需要通过与载体结合形成分子复合物来增强免疫性。
常用的方法包括与大分子带电载体或蛋白质偶联，或通过共价结合形成分子复合物。
三、免疫动物制备合适的免疫动物选择和制备是单克隆抗体制备的重要环节。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
3.1 小鼠小鼠是最常用的免疫动物，且易于操作。
在选择小鼠品系时，需考虑其免疫反应能力、抗原耐受性和容易获得的特点。
通常使用BALB/c小鼠或nude小鼠。
3.2 兔子兔子具有较强的免疫反应能力和较大的体积，可以提供大量的抗体。
但兔子对某些抗原可能产生耐受性。
3.3 大鼠大鼠易于操作且免疫反应充分，但体积较小，提供的抗体量相对较少。
四、细胞融合细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤之一。
通过将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，可以获得具有免疫动物和癌细胞特点的杂交瘤细胞。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗，也被称为抗体药物，是一种能够识别和结合特定分子的抗体衍生物。
制备单抗的过程通常涉及从动物源中获得特异性抗体、制备抗原以及进行抗体组装和纯化等步骤。
下面是单抗制备的详细步骤：第一步：抗原选择与制备抗原是单抗开发的基础，因此抗原选择至关重要。
一般来说，抗原可以是多肽、蛋白质、细胞表面蛋白或其他重要的识别物质。
抗原的制备可以通过合成化学方法或从相关生物样本中提取制备。
第二步：免疫化学动物一旦获得了抗原，下一步是选择合适的实验动物，并进行免疫化学动物。
常见的实验动物包括小鼠、兔子、狗、大猩猩等。
免疫化学动物的目的是刺激动物的免疫系统产生特异性抗体。
第三步：抗体筛选与克隆在动物体内完成免疫程序后，需要收集动物的血浆或脾细胞等样本，进行抗体的筛选和克隆。
常用的抗体筛选方法包括ELISA、免疫磁球分离等。
选出具有高效结合抗原且具有特异性的单克隆抗体细胞，并将其单克隆化。
第四步：抗体生产与纯化一旦获得了单克隆抗体细胞，接下来就需要进行大规模的抗体生产。
最常用的方法是将单克隆抗体细胞悬浮于培养基中，并使用细胞培养技术进行大规模培养。
培养时间可以根据需要进行调整，通常需要数天至数周。
之后，可以通过离心、滤过等方法收集抗体，然后进行纯化。
第五步：抗体表征为了确保获得的单克隆抗体质量良好，需要进行抗体的表征。
常用的表征方法包括西方印迹分析、免疫组化等。
这些方法可以检验抗体在特定条件下的表达水平、特异性和亲和力等相关特性。
第六步：药物开发与临床研究一旦获得了具有良好特性的单克隆抗体，接下来就可以进行药物开发和临床研究。
在这个阶段，需要进行药物的安全性和疗效评估，以及大规模生产和制药工艺的优化。
单抗制备是一个复杂而严谨的过程，涉及到多个步骤和技术。
制备出高质量的单抗药物对于疾病治疗和生物医学研究具有重要意义。
随着技术的不断进步，单抗制备的效率和质量将不断提高，为医药领域带来更多机会和挑战。
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单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。
2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。
就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。
Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。
大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。
现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。
免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。
正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。
因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。
所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。
B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。
有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。
故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。
3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
(6) 以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8) 重复⑹、⑺步骤。
(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好10 6个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。
目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO 以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。
为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。
取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。
饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。
在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。
许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。
应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。
腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。
也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
（5）1 000r／min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。
台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。
如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。
4、细胞融合；小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。
经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，P EG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。
这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。
（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3）、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4）、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。
注意尽可能不搅动细胞；5）、再经100转/分离心10分钟。
弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；6）、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。
CO2含量为5%；7）、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。
2周后使用HT培养基。
5、杂交瘤细胞的选择培养；6、杂交瘤细胞的筛选；7、杂交瘤细胞的克隆化；8、单克隆抗体的检定；9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10、单克隆抗体的大量制备。
五、关键步骤与注意事项：1、整个制备过程需严格无菌2、细胞传代培养时注意适时更换培养液杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。
不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。
而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。
杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。
如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。
产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。
1．材料（1）经高压灭菌的降植烷。
（2）Balb/c鼠：5~8周龄。
（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。
（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清2．操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。
(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r /min离心10min。
(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。
(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。
血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
单克隆抗体的提纯1．材料(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。