微生物学实验-2培养基的制备与高压蒸汽灭菌

3.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的制备
实验器材
1．溶液或试剂： 牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性 淀粉，葡萄糖， NaCl ， KNO3 ， K 2 HPO 4 · 3H2 O， MgSO 4 · 7H 2 O ， FeSO 4 · 7H 2 O ， lmol/L NaOH lmol/L HCl。 2．仪器或其他用具： 试管，三角瓶，烧杯，量筒， 玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，电炉，高 压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.5—9.0），棉花， 牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加热灭 菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。 待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭 排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌 器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导 致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除 是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，
牛肉膏蛋白胨培养基配方
牛肉膏 蛋白胨 3.0g 10.0 g
NaCl
琼脂
5.0 g
15.0~ 20.0 g
水
pH
1000 ml
7.4～7.6
高氏一号培养基配方
可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0 g NaCl 0.5 g K2HPO4· 3H2O 0.5 g MgSO4· 7H2O 0.5 g FeSO4· 7H2O 0.01 g 琼脂 15.0~ 20.0 g 水 1000 ml pH 7.4～7.6
0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21
实验器材
牛肉膏蛋白胨培养基
高氏一号培养基 PDA培养基 培养皿、试管、三角瓶、移液管 手提式高压蒸汽灭菌锅等
实验方法
1. 加水：将内层锅
取出，再向外层锅
内加入适量的水使
水面与三角搁架相
平为宜。
2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品。
微生物学实验-2
实验三 培养基的制备
实验四 高压蒸汽灭菌
实验目的
实验内容
Biblioteka Baidu
实验器材
实验方法 注意事项 实验报告 思考题
实验三 培养基的制备
实验目的
明确培养基的配置原理。 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基 的一般方法和步骤。
实验内容
1. 牛肉膏蛋白胨培养基的制备 2. 高氏一号培养基的制备
8. 灭菌 将上述培养基以 0.103 MPa 121℃， 20min高压蒸汽灭菌。
9. 摆斜面 将试管口端搁在玻棒或其他合适高度 的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长 的一半为宜。
注意事项
1. 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品 时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。 2. 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而 溢出容器。配置培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化， 以免离子进入培养基中，影响细菌生长。 3. pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的 浓度。 4. 分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以 免沾污棉塞而引起污染。
思考题
1．高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅 内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待 压力降低为“0”时才能打开排气阀，开盖 取物？
4. 过滤 用滤纸或多层纱布过滤。一般无特殊 要求的情况下，这一步可以省去。
5. 分装 按实验要求，可将配制 的培养基分装入试管内或三角烧 瓶内。分装试管，其装量不超过 管高的1/5，灭菌后制成斜面。
6. 加塞 在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以 阻止外界微生物进人培养基内而造成污染，并保 证有良好的通气性能。 7. 包扎 在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时 冷凝水润湿棉塞，其外再用绳子扎好。注明培养 基名称、组别、配制日期。
4.试管4支（内装9ml水 ）
5.培养皿2包（20个）
注意事项
1．切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以
防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，
开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容 器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口 或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚 至灼伤操作者。
3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的
排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相
对的两个螺 栓。
4. 通电加热，待冷空气完全排尽后，关上排气 阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维
持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，
20min灭菌。
5. 灭菌所需的时间到后，关闭电源，让灭菌锅
思考题
1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如 何检查灭菌后的培养基是无菌的？
2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么
问题？为什么？
实验目的
实验原理
实验器材
实验方法 注意事项 思考题
实验四
高压蒸汽灭菌
实验目的
了解高压蒸汽灭菌的基 本原理及应用范围。 学习高压蒸汽灭菌的操
作方法。
实验原理
内温度自然下降，当压力表降至“0”时，打开
排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
6. 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h， 经检查若无杂菌生长，即可待用。
每组准备下列物品（灭菌）
1.培养基2瓶（ 500ml培养基用250ml三角瓶分装）
2.试管10支（内装3ml培养基）
3.无菌水1瓶（150ml三角瓶，内装99ml水、玻璃珠）
所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽
的温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压 力 数
MPa
kg/c m2 1b/in2
0.35 0.70 1.05 1.40 1.75 2.10 5 10 15 20 25 30
1/3空 空气全 全部空 2/3空 l/2空气 气排出 气排出 气排出 不排出 排出时 时的温 时的温 时的温 时的温 的温度 度 度 度 度 (℃ ) (℃ ) (℃ ) (℃ ) (℃ ) 108.8 115.6 121.3 126.2 130.0 134.6 100 109 115 121 126 130 94 105 112 118 124 128 90 100 109 115 121 126 72 90 100 109 115 121
PDA培养基的配方
马铃薯（去皮）
葡萄糖
200g
20 g
琼脂
水 pH
15~20 g
1000 ml 自然
制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小 薄片，称200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后过滤， 其滤汁为马铃薯煮汁，然后加琼脂和葡萄糖煮溶，后 补足水分至1000毫升，装管（瓶）灭菌备用。
脱脂乳培养基配方
Na2HPO4· 12H2O 1.3 g KH2PO4· 3H2O 0.36 g NaCl 0.5 g 脱脂牛奶 100ml 琼脂 15.0~ 20.0 g 水 900 ml pH 7.2
实验方法
1.称量 在上述烧杯中先加人少于所需要的水量，按培养
基配方比例依次准确地称取放入烧杯中用玻棒搅匀。 2.溶化 在石棉网上加热使其溶解，并加水补足体积。 3.调pH 在未调 pH前，先用 pH试纸测量培养基的原始 pH ，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 lmol ／ L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其pH，直至 pH达7.6。反之，用 lmol／L HCl进行调节。