明胶酶谱法 -回复
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
酶谱法检测金属蛋白酶活性
原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
2试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/LCaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）3实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
明胶酶谱法
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
明胶酶谱法
明胶酶谱法明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。
明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。
这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。
这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。
明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。
该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。
此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。
明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。
它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。
它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。
同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。
它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。
明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。
明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。
聚丙烯酰胺凝胶电泳目的及后续工作汇总
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
其应用可以分为两大类，一类是属于可以直接在凝胶上观察计算；另一类需要洗脱回收胶中特定的蛋白和核酸。
①蛋白质纯度分析②蛋白质分子量测定⑥蛋白质纯化分离直接观察③蛋白质定量洗脱回收蛋白④蛋白质水解分析⑦免疫印迹的第一步⑤ DNA测序1.蛋白质纯度分析根据聚丙烯酰胺凝胶条带个数来判断是一种蛋白质还是多种蛋白质的混合物。
2.蛋白质分子量测定采用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。
以迁移率Rf为横坐标，蛋白分子量的常用对数为纵坐标。
用已知分子量的蛋白测出迁移率，做标准曲线。
从而能根据未知分子量蛋白的迁移率计算出其分子量。
其中Rf=蛋白迁移距离/示踪染料迁移距离。
3.蛋白质定量蛋白质混合物中单个蛋白质的定量，通常是将染色后的凝胶蛋白质条带在分光光度计上进行扫描，然后对峰面积积分。
4.蛋白质水解分析蛋白质水解分析常用酶谱法。
明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
5.DNA测序目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。
这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。
Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书
基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。
产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。
技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。
其功能在于分解细胞外基质成分。
迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。
根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。
体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。
明胶酶谱法详解
ZymographyProvided by Hsu suo-wen一。
用品1.细胞培养或者提取组织2.试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括）ddH2o 1.5ml30%储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml10% SDS 50ul10%过硫酸铵（AP） 50ulTEMED 4ul1%明胶 0.5ml(or 100ul)(注意：天气如果较冷除TEMED，其他成分按顺序加完后要置于37度温育，最后加TEMED)B.浓缩胶的配制-同Western Blot浓缩胶 3mlddH2o 2.1ml30%储备胶 0.5ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml10% SDS 30ul10%过硫酸铵 30ulTEMED 3ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液20ml(不同于Western)0.32% Tris-HCL 6.4ml 50mM Tris 0.606g4%SDS（PH7.2） 8ml 2% SDS 0.2g16%甘油 3.2 ml 10%甘油 10ml溴酚蓝 0.024g 0.1%溴酚蓝 0.01gddH2o 2.4ml(20ml) (10mlsystem)(5) 洗脱液（1L）:2.5% Triton X-100（25ml），50mmol/L Tris –HCl（6.06g），5mmol/L CaCl2（or 10mMol 1.11g），1μmol/L ZnCl2，pH7. 6漂洗液（相比洗脱液，少了Triton）： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6注意：洗脱液不能重复使用，必须现配，尽可能多加洗脱液，温育摇动时注意Triton有毒。
明胶酶谱法
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5)洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
蛋白酶活性电泳实验
蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。
通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。
通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。
二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。
水为去离子水或超纯水。
主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。
使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。
其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。
由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。
在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。
肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。
最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。
Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。
同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。
2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。
铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。
3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。
4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。
5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。
6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。
血清明胶酶活性对急性心肌梗死后左室重构的预测价值
华 中 医学 杂志 ２ ０ 第 ３ ０ ８年 ２卷第 ３ 期
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２０ ・ ３
血 清 明胶 酶 活 性 对 急性 心 肌梗 死后 左 室 重构 的预 测价 值
（３０１ 武汉） 中国人民武装警察部队湖北省总队医院 陈剑峰 彭 程 ４０６
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明胶酶谱实验
1) 母液配制：1. 10X明胶溶液（50ml）：称取500mg明胶，加入高压灭菌三蒸水约40ml，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后置于65°C水浴，在15min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度10mg/ml，于4°C备用。
注：样本量较多时一次性配制50ml，分装于5ml EP管中-20°C备用。
2. 10X 50mM Tris-HCl母液（2L）：即0.5M Tris-Hcl。
称取121.14g Tris-base，双蒸水溶解后浓盐酸调节pH值至7.5，定容至2L。
3. 20X 5mM CaCl2母液（1L）：即100mM CaCl2（分子量111）。
称取11.1g CaCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
4. 2000X 1uM ZnCl2母液（1L）：即2mM/L ZnCl2（分子量136.30）。
称取0.2726g ZnCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
（注：使用浓度实在太小，只好配大体积的母液增加精准度。
ZnCL2在水中呈絮状，用前剧烈震荡均匀）5. 10X 2.5% Triton X-100母液（400ml）：即25%TritonX-100。
100mlTriton X-100原液双蒸水稀释至400ml。
4度保存备用。
6. 10X Brij-35 0.02%母液（500ml）：即0.2%Brij-35。
称取1g Brij-35至400ml双蒸水，65度水浴加热至完全溶解后定容至500mL。
4度保存备用。
2) 使用液配制：1. 5×loadingbuffer配方:用培养细胞上清等浓度较低样本检测Tris-HCl(PH6.8) 0.4MSDS 10%Glycerol 50%Bromophenol blue 0.03%2. 2×loadingbuffer配方:用血清、组织样本等浓度较高样本检测0.125 M Tris–HCl, pH 6.84% (w/v) SDS20% (v/v) glycerol0.04% (w/v) bromophenol blue.3. 洗脱缓冲液1L：4. 漂洗液1L：5. 孵育缓冲液1L：6. 考马斯亮蓝R-250染色液（可重复使用）：Methanol 30%Acetic acid 10%Coomassie R blue 0.25%7. 脱色液：Methanol 20%Acetic acid 10%3) 操作步骤：1. SDS-PAGE胶的灌制：灌制8%SDS-page分离胶（同western blot，现配现用）和5%浓缩胶，分离胶加入1/10体积的10mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为1mg/ml。
酶学实验
实验一、木瓜蛋白酶活性测定实验(明胶法)(一)实验原理木瓜蛋白酶从明胶中分解出氨基酸和肽，其氨基型氮可用甲醛复分解，产生氢离子，浓度可用氢氧化钠溶液滴定。
(二)定义一个木瓜蛋白酶单位相当于在规定条件下分解1ug分子量的肽键时所需的酶量。
(三)试剂1. 底物明胶2. 柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 取70.000g一水柠檬酸溶于720mL 1mol/L氢氧化钠溶液中。
用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至5.0，用蒸馏水定容至1000mL。
3. 37%甲醛溶液4. 酚酞溶液取0.5g酚酞溶于95%的乙醇中，并定容至50mL。
5. 0.1mol/L氢氧化钠溶液取4.0克氢氧化钠置于洁净干燥的烧杯中，加纯水稀释、搅拌溶解，将溶液移入1000ml洁净容量瓶中定容至刻度。
6. 酶溶液用蒸馏水溶解酶，每毫升配制溶液应含有40U左右。
酶的称量一定得按以下原则确定：用于主值和空白值试验的耗量之差应在1.8～2.2mL这一范围内。
此外需用一个合适的称量重复测定几次。
(四)操作步骤称取500mg明胶放入一只100mL锥形烧瓶内，加8mL蒸馏水，加热后明胶溶解。
待明胶完全溶解加2.0mL柠檬酸盐缓冲液，置于水浴中冷却至40℃。
加5.00mL已预热至40℃的酶溶液，于40℃下保温60min，加10.0mL甲醛溶液终止反应。
加0.5mL酚酞溶液后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，直至第一次出现明显的粉红色为终点。
用同样方法测定空白值，只是这里在添加酶溶液之前先添加甲醛溶液。
在空白值测定方面耗去大约5mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液。
(五)计算用以下公式计算酶活性：酶活力(U/mg)=(H-B)/E W×100式中：H-用于主值的滴定耗量(mL)；B-用于空白值的滴定耗量(mL)；100-相当于1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液；E W-每5.0mL所用酶液中含有酶的重量(mg)。
举例：测定一个木瓜蛋白酶样品。
从样品中称取68.2mg，定容100mL。
明胶酶谱检测实验服务
明胶酶谱MMP(2/9)检测实验
实验技术服务介绍：
酶谱法（Zymography）是基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法检测MMP-2、MMP-9 活性，其灵敏度可达10pg，高于ELISA 方法。
基本原理和程序：
以加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶分离含蛋白酶的样品，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。
凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，能同时指示MMP-2、MMP-9 的位置(酶谱)，可检测样本有血液、渗出液、细胞提取物等。
【晶莱生物】
样本提供需知：
1）客户告知实验分组、编号及背景设计资料，有具体要求请事先说明；
2）标本收集、保存与运送：
组织样品新鲜组织放入液氮或-70 度保存，组织不少于100mg；
培养细胞通过细胞计数取不少于2×106 个细胞于EP 管，加入0.5ml 生理盐水，混匀后保存于冰箱（-70℃，避免反复冻融）；
血液细胞标本以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml 生理盐水，保存（-70℃可长期保存，避免反复冻融）
血清或细胞培养液标本离心去掉杂质后取上清入EP 管，保存（4℃可保存15-20 天，-70℃可长期保存，避免反复冻融）
3）样本运输：
组织样本、细胞样本以干冰运输；
细胞样本也可直接寄送培养瓶（密封保证不污染、培养液不漏出）；
血清或上清液直接加冰袋寄（送视路程远近2-3 天可到达）。
明胶酶谱及MMP2免疫组化
⑶RIPA 蛋白裂解液：称取Tris 0.605g、NaCl 0.8775g、TritonX-100 1g、1%脱氧胆酸钠1g、SDS0.1g，加入60ml 去离子水，盐酸调pH7.5，定容100ml。
⒂明胶酶谱试验孵育液Tris 2.97g，CaCl2 0.353g，NaN3 0.1g，去离子水400ml，pH7.6，定容500ml。
⒃明胶酶谱试验复性液2.5ml TritonX-100 加入去离子水100ml。
⒄明胶酶谱试验脱色液甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml，混匀，室温保存。
⒅10%明胶储备液明胶5g，去离子水40ml，加热、磁力搅拌至完全溶解，定容50ml，4℃冰箱备用。
⒆考马斯亮蓝R250 染液取甲醇50ml、去离子水40ml、冰醋酸10ml、0.1g 考马斯亮蓝R250，混匀，室温保存。
⑵BCA 法测定组织提取液的蛋白浓度。
采用Pierce 蛋白测定BCA 法试剂盒，按照说明书进行操作。
同第一部分。
A．制作蛋白浓度标准曲线生理盐水稀释蛋白标准溶液，配成梯度蛋白标准溶液浓度分别为：0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml 作液。
10μ l 不同浓度的蛋白溶液分别加入96 孔板，加入200μ l 工作液，室温放置30 分钟，测定OD562。
以不同浓度蛋白溶液测得OD562 数值为纵坐标，对应标准蛋白浓度为横坐标，制备蛋白浓度标准曲线。
B．待测样品蛋白浓度测定待测样品用生理盐水稀释50 倍。
取稀释样品10μl 置96 孔板，与200μl 蛋白浓度测定工作液（A:B=50:1）混合，室温放置30 分钟，测定OD562，利用蛋白质浓度标准曲线计算待测样品蛋白浓度。
3.5 明胶酶谱法检测MMP2、9 活性3.5.1 蛋白样品准备上述UTMD 后3 天（缺血再灌注后6 天）收集大鼠心脏梗死和边缘区及远端非梗死区组织匀浆，加入组织裂解RIPA 液（不含蛋白酶抑制剂cocktail），混匀，置冰上2 小时，13000rpm/分钟、4℃离心20 分钟，取上清获得组织提取液。
尿液明胶酶变化在慢性肾脏病中的临床意义
（ 包头医学院第一 附属 医院， 内蒙古 包头 ０ １ ４ ０ １ ０ ）
摘 要 目的 ： 探讨 尿 ＭＭＰ一２ 、 ＭＭＰ一９的水平 和活 性变化 与慢 性 。 肾脏病 （ Ｃ Ｋ Ｄ ） 患者 肾功能 及尿 蛋 白的关 系。
方法 ： 用Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法及 明胶 酶谱 法检测 ９ Ｏ例 Ｃ Ｋ Ｄ患者尿 明胶酶 （ ＭＭＰ一 ２ 、 ＭＭＰ一９ ） 的水平 ， 其 中慢性 肾小 球肾炎（ ｃ ｈ ｒ ｏ ｎ ｉ ｃ
性别大致 匹配 的健康人 ３ ０例为对照组 ， 分析 Ｃ Ｋ Ｄ患者尿 明胶 酶与血 肌酐 、 尿蛋 白的相关性 。结果 ： Ｃ Ｇ Ｎ患者 Ｓ ｃ ｒ 与尿液
ＭＭＰ一 ２正相关 （ｒ＝ ０ ． ５ ０ ８ ， Ｐ＜ ０ ． ０ １ ） ， 与尿液 ＭＭＰ一 ９负相 关 （ｒ＝ 一 ０ ． ３ ６ １ ， Ｐ ＜０ ． ０ １ ） 。Ｃ Ｇ Ｎ患 者尿 蛋 白与尿 液 ＭＭＰ一 ２正相关 （ｒ＝ ０ ． ４ ２ ９， Ｐ＜ ０ ． ０ １ ） ， 与尿 液 ＭＭＰ一 ９无相 关性 （ｒ＝ 一 ０ ． ０ ９ ０ ， Ｐ＝ ０ ． ４ ９ ２ ） 。Ｃ Ｔ Ｉ Ｎ患者 Ｓ ｃ ｒ 与尿 液 ＭＭＰ一 ２正 相关 （ ｒ＝ ０ ． ５ ４ ７ ， Ｐ ＜０ ． Ｏ １ ） ， 与尿 液 ＭＭ Ｐ一９正相 关 （ｒ＝０ ． ５ ７ ０， Ｐ ＜０ ． ０ １ ） 。Ｃ Ｔ Ｉ Ｎ患 者 尿蛋 白与尿 液
Ｓ ＨＩ Ｙ ｉ ｎ ｇ ｊ ｉ ｎ， Ｄ ＯＮ Ｇ Ｙ ｕ ｈ ｏ ｎ ｇ ， Ｙ Ａ ＮＧ Ｇｕ ｏ ａ ｎ， ＷＡ Ｎ Ｇ Ｃ ａ ｉ ｌ ｉ （ Ｔ ｈ ｅ Ｆ ｉ ｒ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｂ ａ ｏ ｔ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｂ ａ ｏ ｔ ｏ ｕ ０ １ ４ ０ ６ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶活性
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大旳酶。
➢ NGAL能与MMP-9以二硫键旳方式结合，能起到保护和调整MMP-9功能旳作用，所以NGAL 与肿瘤旳侵袭移动有亲密旳联络。
➢ 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教讲课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体旳SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测成果表白，转染有pcDNA-NGAL (-) 旳SHEEC 细胞 分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显降低；而与此同步，转染有pcDNA-NGAL (＋) 旳 SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显升高。表白经过有义、反义技术使NGAL 基因体现发生变化能够对SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2 旳活性产生明显影响。
➢ 胶原是ECM旳主要成份，目前已发觉，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中旳主要成份。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞旳侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动旳有关基因及其体现调控模式旳变化 和增进细胞移动旳外界原因两者旳共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭旳分子机制还不是十分清楚，但已发觉许多调控细胞侵袭转移旳关 键分子及其信号通路。
脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中断脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到合适大小后，用凝胶图象处理系统分析成果，以白色条 带旳净光密度值相对定量样品中酶活性。
蛋白酶活性电泳实验
蛋白酶活性电泳活性电泳（明胶酶谱法）一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE （含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trit on中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。
通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。
通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。
二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine, TEMED，SDS,过硫酸铵，考马斯亮蓝R250 购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCI2 2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5 x蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。
水为去离子水或超纯水。
主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等 1.2溶液配制1.2.1 5X SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g,加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g,力卩水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。
使用时用去离子水稀释至1X,新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。
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明胶酶谱法 -回复
明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。
明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解
程度来反映明胶酶活性。
这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。
明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶
降解的速度来确定酶的活性。
在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保
最佳的测定结果。
明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活
性和特性。
这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶
酶的活性和质量。
明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作
技巧和对仪器的熟悉。
这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。
明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。
在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。
明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。
明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。
明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。
在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。
明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。
明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。
这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。
明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。
该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。
明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。
在明胶酶谱法中，还可以对酶的催化机制进行研究，探索明胶酶和底物之间的相互作用等。
明胶酶谱法还可以用于研究明胶酶在不同环境条件下的稳定性和适应性等。
该方法对明胶酶的质量控制和质量分析具有重要意义，可以帮助生产者保证产品的质量。
明胶酶谱法可以与其他测定方法相互补充，提高对明胶酶的分析效果。
明胶酶谱法的应用还可以推动酶工程和生物技术的发展，促进产业的发展。
明胶酶谱法可以用于研究明胶酶在不同物种中的分布和功能差异等。
在明胶酶谱法的研究中，还可以发现一些新的酶和底物适配体，推动酶学的发展。
明胶酶谱法是一个重要的工具，可以用来研究酶对明胶的降解机制和途径。
明胶酶谱法在工业生产中也有广泛的应用，用于监测酶的活性和产品质量。
明胶酶谱法在生命科学研究中的应用前景非常广阔，可以深入了解酶的功能和机制。
关于明胶酶谱法的研究还有许多待发掘的问题和挑战，需要继续努力和探索。
明胶酶谱法的发展为科学家们提供了一个重要的工具，用于研究酶的结构和功能。
明胶酶谱法的应用领域还在不断扩大和深化，可以为科学家们提供更多的研究机会和挑战。
明胶酶谱法的应用可以促进生物工艺学和生物医学领域的创新和发展。
明胶酶谱法在生物化学和分子生物学领域的应用也得到了广泛的肯定和应用。
明胶酶谱法的原理和操作流程对于初学者来说可能比较复杂，需要进行系统的培训和学习。
明胶酶谱法在研究领域的应用还存在一些争议和问题，需要进行更深入的探讨和研究。
明胶酶谱法对于提高明胶酶的生产效率和质量控制非常重要，可以为产业发展提供支持和指导。
明胶酶谱法在追踪酶活性和酶底物相互作用方面具有重要作用，
可以直观地显示酶的催化效果。
明胶酶谱法在测定酶活性和研究酶的功能特性方面具有独特的优
势和潜力。
明胶酶谱法在医药业的应用也受到广泛关注，可以用于药物研发
和酶抑制剂的筛选。
明胶酶谱法在环境科学中的应用也有一定的潜力，可以用于监测
和评估环境中的酶活性。
明胶酶谱法对于探索酶的催化机理和生物催化工艺具有重要的意
义和应用前景。
明胶酶谱法的应用也能够为食品安全和质量控制提供支持和保障。
明胶酶谱法的研究还有待于进一步的深入和拓展，能够为生物学
和工业界提供更多的创新和发展机会。