MiRNA-125a-5p对大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障及运动功能的影响

MiRNA-125a-5p对大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障及运动功能
的影响
Dai Guoyu;Liu Jisong;Li Jian;Liu Wenrui;Li Gang;Bi Yunlong;Cao Yang
【摘要】目的:通过干预大鼠脊髓中miRNA-125a-5p的表达量,探讨miRNA-125a-5p在脊髓损伤(SCI)后对血脊髓屏障(BSCB)的作用及对大鼠运动功能的影响.方法:SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、miRNA空载组(NC组)和miRNA-125a-5p agomir鞘内注射组(miRNA组).RT-PCR检测miRNA-125a-5p在各种大鼠脊髓中的表达,免疫印迹和免疫荧光实验检测脊髓微血管内皮细胞间紧密连接蛋白(ZO-1)表达,尼氏染色观察脊髓前角运动神经元的数量以及通过BBB评分评价大鼠运动功能恢复.结果:MiRNA组的miRNA-125a-5p 的相对表达量明显高于SCI组,且ZO-1的mRNA的相对表达量和相对蛋白质表达量较SCI组和显著增加.MiRNA组的脊髓前角运动神经元相对数量明显多于SCI 组.MiRNA组大鼠脊髓损伤后1d、3d、7d、14d、21d和28 d运动功能恢复明显优于SCI组.结论:MiRNA-125a-5p可以有效保护脊髓损伤大鼠的血脊髓屏障功能并促进运动功能恢复.
【期刊名称】《解剖学杂志》
【年(卷),期】2019(042)003
【总页数】6页(P225-230)
【关键词】脊髓损伤;血脊髓屏障;miRNA-125a-5p;紧密连接蛋白ZO-1
【作者】Dai Guoyu;Liu Jisong;Li Jian;Liu Wenrui;Li Gang;Bi Yunlong;Cao Yang
【作者单位】;;;;;;
【正文语种】中文
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）主要包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤主要是指脊髓受到直接的外力作用而造成的脊髓机械性损伤并伴有直接的肢体感觉异常和运动障碍[1]。

继发性损伤主要是指在脊髓损伤后损伤部位向头尾纵轴
方向蔓延并继发性出血水肿以及炎症浸润等不良反应所造成的损伤[2-3]。

在继发
性损伤中血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）内皮细胞功能的减弱
直接导致了脊髓血管通透性增加造成脊髓微环境的改变；有害物质大量沉积再次加重脊髓的损伤；这些情况对脊髓损伤的预后产生了极其不良的影响[4]。

因此在治
疗原发性脊髓损伤的同时，有针对性的维持BSCB的功能可能是治疗脊髓损伤的
切入点[4-5]。

但目前能够改变BSCB作用的有效方法很少。

MicroRNA-125a-5p （miRNA-125a-5p）是miRNA-125家族中的一员，它是1种大小约22个碱基组成的单链小分子内源性具有调控功能的非编码RNA[6]。

目前研究表明miRNA-125a-5p在脊髓损伤后72 h明显下调，此时也是脊髓损伤后BSCB开放的高峰期，因此推测miRNA-125a-5p可能与BSCB的作用有关[7-8]。

本研究是在大鼠鞘内注射miRNA-125a-5p的模拟物（miRNA-125a-5p agomir）增加脊髓的miRNA-125a-5p的含量后检测紧密连接蛋白（tight junction protein，ZO-1）的表达、前角神经元数量和对大鼠进行BBB评分，观察和评价miRNA-125a-5p
在大鼠脊髓损伤中的作用，为脊髓损伤的研究提供新的方向。

1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
48只150～180g SPF级SD大鼠由锦州医科大学实验动物中心提供。

大鼠随机分
为假手术组（Sham组）、脊髓损伤组（SCI组）、miRNA空载组（NC组）和miRNA-125a-5p agomir鞘内注射组（miRNA组），每组12只。

采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，注射剂量为3 μl/g，其中Sham组为只去除第11胸椎（T11）节段椎板暴露第10胸椎（T10）节段脊髓且不对脊髓进行打击的空白对照组；SCI组为去除椎板暴露T10节段脊髓后用自制的Allen打击器进行脊髓打击的单纯脊髓损伤的对照组；NC组为在脊髓打击前3 d每隔24 h注射1OD无功能miRNA空载基因的鞘内注射的阴性对照组，miRNA组为脊髓打击前3 d每隔24 h注射1OD的miRNA-125a-5p agomir的miRNA-125a-5p高表达组。

其中miRNA空载组是含miRNA成熟体的双链无功能基因序列并不表达基因功能，miRNA-125a-5p agomir是根据miRNA-125a-5p成熟体设计并针对提高体内稳定性而进行化学修饰合成的双链miRNA模拟物，agomir是在miRNA反义链上进行化学修饰，3'端胆固醇修饰，5'端2个硫代修饰，3'端4个硫代修饰的1种新型的miRNA模拟物。

miRNA-125a-5p agomir由江苏吉玛生物公司提供。

注射部位为大鼠第3腰椎与第4腰椎椎骨间隙。

打击方式均对暴露节段中心进行垂直打击，打击重量为20 g、打击高度为2 cm，打击后大鼠双侧后肢和尾部均有强直而后瘫痪，造模时对不标准的模型给予剔除并及时添加。

待各组实验动物苏醒后安放回鼠笼，正常水食精心饲养72 h，其中每组各随机抽取3只饲养至28 d并按时间点记录大鼠运动功能的变化情况。

1.2 RT-PCR检测
1.2.1 miRNA-125a-5p 造模后72 h取各组损伤点前后1 cm的新鲜脊髓液氮研磨，TRIzol法分别提取总RNA后分别进行miRNA和mRNA的检测，miRNA逆转录成cDNA，体系为20 μl。

以cDNA为模板，再以miRNA-125a-5p和U6的引物进行扩增，体系为50 μl。

扩增后取产物20 μl行RNA凝胶电泳并观察凝胶成像结果。

所用引物序列如表1。

表1 引物序列Tab1 Sequences of the primersGene Primer sequence
MiRNA-125a-5p Forward：5'-CACAGTTCCCTGAGACCCT-3'Reverse：5'-TATGGTTGTTCTGCTCACTGTCTC-3'U6 Forward：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'Reverse：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3' 1.2.2 ZO-1 mRNA mRNA的逆转录以随机引物为模板逆转录合成cDNA，体系
为20 μl，以此cDNA产物为模板以ZO-1和β-actin的引物扩增，体系为50 μl。

取产物20 μl进行RNA凝胶电泳并成像观察结果。

所用引物序列如表2。

表2 引物序列Tab2 Sequences of the primersGene Primer sequence ZO-1 Forward：5'-ATCCCACAAGGAGCCATTCC-3'Reverse：5'-GTCACAGTGTGGCCAAGCGTA-3'β-actin Forward：5'-CTCTGTGTGGATTGGTGGCT-3'Reverse：5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3' 所有引物均由北京鼎国昌盛公司提供，TRIzol、miRNA和mRNA的逆转录和扩
增试剂盒购于TaKaRa公司。

1.3 免疫印迹法检测ZO-1蛋白的表达
72 h取损伤点脊髓在RIPA裂解液中匀浆、提取总蛋白，定量后制备样品。

样品
采用6%SDS-PAGE电泳，时长90 min，0.45 μm孔径的PVDF膜湿转150 min 继而用1%胎牛血清白蛋白封闭2 h，1∶250的ZO-1一抗和1∶1 000的β-
actin一抗4℃孵育过夜。

次日TBST洗5 min×3次，二抗室温孵育2 h，化学发光法显色。

1.4 免疫荧光组织化学法检测ZO-1蛋白的表达
72 h后取各组大鼠3只麻醉，左心室插管灌注预冷的0.9%生理盐水待流出液清澈后4%多聚甲醛灌流直至大鼠颈部强直四肢尾部僵硬。

取材浸泡于4%多聚甲醛中48 h后于30%蔗糖溶液中待组织悬浮。

擦干组织OTC包埋后速冻，徕卡冰冻切
片厚度为6 μm。

取切片恢复至室温，10%山羊血清封闭2 h，1∶50的ZO-1 一
抗4℃孵育过夜。

滴加1∶50的FITC标记的二抗，室温避光孵育2 h。

DAPI染色1 min并用50%甘油封片。

荧光显微镜下观察荧光强度和血管形态。

1.5 尼氏染色
取冷冻切片室温干燥1 h后浸染于60℃焦油紫染液1 h。

取出切片蒸馏水洗涤3 min×2次后擦去多余染液，浸入分化液分化，分化时间根据染色程度进行调整，通常情况下不超过3 min。

分化后依次乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜镜下观察。

1.6 BBB评分
取各组大鼠3只标记后混合单盲法观察分别在1、3、7、14、28 d 5个时间点观察其爬行并记录各组大鼠髋、膝、踝关节活动度每项计2分；记录大鼠步态的协调能力计5分；躯体的负重能力计5分以及后肢小关节精细运动能力计5分。

根据BBB评分核定后肢各功能情况总分为21分，计算各组大鼠BBB分数进行统计分析。

在观察前需排空大鼠膀胱，观察地点应选取宽敞无障碍且清洁的空地。

1.7 统计学处理
采用SPSS16.0软件分析处理，所有数据均采用±s表示，利用Image J软件求出各组灰度值，PS6.0统计荧光强度，并用GraphPad软件做出相应统计图并计算P 值。

两组之间采用t检验。

2 结果
2.1 miRNA-125a-5p的相对表达水平
脊髓损伤后的SCI组中miRNA-125a-5p的相对表达量明显低于Sham组。

SCI 组和NC组miRNA-125a-5p的相对含量差异没有统计学意义（P＞0.05）。

脊髓鞘内注射miRNA-125a-5p agomir后，脊髓损伤部位的miRNA-125a-5p相对含量为1.37±0.04，是SCI组（0.55±0.06）的2.4倍，差异具有统计学意义（P ＜0.05，图1）。

2.2 ZO-1 mRNA的相对表达水平
损伤后ZO-1 mRNA的相对表达量明显下调；SCI组和NC组的ZO-1 mRNA的
相对表达量差异没有统计学意义。

MiRNA组中ZO-1的mRNA相对表达量为
0.90±0.10，是SCI组（0.55±0.06）的1.6倍，且二者之间的差异具有统计学意
义（P＜0.05，图2）。

图1 大鼠脊髓miRNA-125a-5p相对表达量的RT-PCR分析Fig1 RT-PCR analysis of the relative expression of miRNA-123a-5p in the spinal cord of each group of rats*P＜0.05 vs SCI group
2.3 ZO-1的蛋白表达水平
图2 大鼠脊髓紧密连接蛋白ZO-1相对表达量的RT-PCR分析Fig2 RT-PCR analysis of the relative expression of tight junction ZO-1 gene in the spinal cord of each group of rats*P＜0.05 vs SCI group
免疫印迹法结果显示ZO-1的相对表达量同ZO-1 mRNA的相对表达量趋势相同，Sham组ZO-1的相对表达量为1.46±0.25。

SCI组和NC组ZO-1的相对表达量分别为0.73±0.06和0.72±0.02；miRNA组ZO-1的相对表达量1.16±0.10相
比SCI组增加明显，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 紧密连接蛋白ZO-1的免疫印迹分析Fig3 Western blotting analysis of tight juction protein ZO-1△P＜0.05 vs sham ；*P＜0.05 vs SCI group
2.3 ZO-1的免疫荧光检测
正常组脊髓微血管丰富，分布均匀，管径清晰，灰质白质清晰，无新生小血管。

SCI组和NC组相同区域内ZO-1阳性的血管大量减少，且出现微血管明显皱缩，环状结构不清晰，灰质和白质的交界区不明显，且无完整结构的新生血管生成，管道不清晰。

MiRNA组的ZO-1荧光强度均匀且有明显的环状结构，血管分布广泛，腔隙明显。

灰质白质交界区分区明显，交界区血管呈纤维条索状，可视管径（图
4）。

通过对各组相对荧光强度数据的统计结果显示Sham组的ZO-1相对荧光为26.63±1.63；SCI组和NC组ZO-1相对荧光强度分别为14.66±2.68和
15.07±1.56；而MiRNA组ZO-1的相对荧光强度24.32±1.36，与SCI组比较显著增高且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 尼氏染色观察大鼠脊髓前角运动神经元
Sham组脊髓前角灰质白质分界清，运动神经元形态结构正常，尼氏颗粒分布均匀，没有明显空泡。

SCI组和NC组脊髓灰质白质界限不清晰，灰质区运动神经元缺失明显，残存的运动神经元皱缩且分布不均，尼氏颗粒分部杂乱。

MiRNA组脊髓前角灰质区与白质区交界区明显，但灰质区整体有形态改变，结构略肿胀，运动神经元较多，尼氏颗粒分布均匀，但仍未达到正常水平。

观察并统计各组脊髓前角运动神经元的相对数量（图5）。

Sham组前角运动神经元的相对数量为15.00±1.00，而SCI组和NC组分别为4.67±1.53和4.33±1.53，而MiRNA组前角运动神经
元的相对数量与SCI组比较明显增加且已经达到了9.67±1.53，两者的差异具有
统计学意义（P＜0.05）。

2.6 BBB评分评价大鼠运动功能
各组大鼠BBB评分显示，Sham组大鼠在损伤1～28 d内均无明显变化。

SCI组
和NC组大鼠后肢运动情况均有所恢复，BBB评分在1～14 d内呈明显升高趋势，14～28 d相对平稳，部分关节可轻微活动，负重能力有限，无精细运动能力。

MiRNA组大鼠早期恢复情况较SCI组和NC组快速，14 d后肌力明显的恢复，
后肢可见收缩有支撑力，腹部可离地且有一定的平衡协调能力以及精细运动能力，7～28 d时恢复水平均明显高于SCI组，二者之间差异具有统计学意义（P＜0.05，图6）。

3 讨论
3.1 血脊髓屏障功能
BSCB与血脑屏障类似，主要都是由内皮细胞、外膜细胞、星形胶质细胞以及基膜组成。

BSCB的保护作用中内皮细胞起到了关键性作用[9-10]，屏障的通透性主要由血管内皮细胞之间的紧密连接结构以及内皮细胞腔面的糖-蛋白质复合物的含量决定[11]。

糖-蛋白质复合物带负电荷排斥同样带负电荷的血浆蛋白，有效减弱了血浆蛋白向血管壁的运动，减少了血管壁与大分子血浆蛋白的接触。

此复合物既受到BSCB紧密连接结构的影响，又与BSCB的紧密连接结构相辅相成共同限制和调节血液成分进入神经系统，共同维护中枢神经系统的内环境的稳定[12]。

急性SCI后出现的BSCB的破坏程度直接影响患者预后与功能恢复，其中损伤后往往会出现大量血管内皮细胞因子和炎性介质以及伴随着局部化学因素的改变，多种因素继发了BSCB的破坏而电荷结构发生改变和血管通透性的改变。

因此SCI急性期内保护BSCB中紧密连接结构是维护脊髓内环境稳定以及保留大部分神经功能的根本手段[13]。

3.2 MiRNA-125a-5p在BBB中的作用
MiRNA-125a-5p在细胞的分化、增殖、凋亡以及新生组织的发育中有重要的调节作用其中在BBB的微血管内皮细胞中具有很强大的表现力。

Che等认为miRNA-125a-5p可沉默转录增强因子-1（RTEF-1），通过沉默RTEF-1可上调内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的表达，随后导致血管增生受损微血管系统得以修复，BBB功能重新的建立。

miRNA-125a-5p很有可能通过相同的通路调节BSCB的功能[16]。

对BBB的研究中miRNA-125a-5p和许多其他的miRNA在星形胶质细胞释放的细胞因子的影响下调节BBB，可以导致BBB中的紧密连接、特定转运蛋白包括P-糖蛋白和葡萄糖转运蛋白-1发生改变从而调节BBB的功能。

目前在针对BBB和BSCB的研究中还是存在很多的未知领域仍需要逐步的探索。

图4 大鼠脊髓T10节段矢状面ZO-1免疫荧光图，×200。

A1～D1：ZO-1；
A2～D2：Dapi；A3～D3：Merge。

A：Sham组；B：SCI组；C：NC组；D：miRNA组；E：各组相对荧光强度统计.Fig4 Immunofluorescence of T10 segment of the spinal cord in four groups of rats，× 200.A1-D1：ZO-1；
A2-D2：DAPI；A3-D3：Merge.A：Sham group；B：SCI group； C：NC group；D：miRNA group；E：Relative fluorescence intensity statistics of each group.*P＜0.05 miRNA group vs SCI group.
图5 大鼠脊髓前角运动神经元的尼氏染色，×200。

A：Sham组；B：SCI组；C：NC组；D：miRNA组；E：各组神经元相对数量统计.Fig5 The Nissl's staining of motor neurons in the anterior spinal cord of rats in each group，×200.A：Sham group；B：SCI group；C：NC group；D ：miRNA group ；E ：Relative number of neurons in each group.*P＜0.05 miRNA vs SCI group.
图6 大鼠0～28 d不同时间点的运动功能评价分析Fig6 Evaluation and analysis of motor function of rats at different time points from day 0 to 28*P＜0.05 miRNA group vs SCI group
3.3 MiRNA-125a-5p对BSCB的影响
以前研究证实了miRNA-125a-5p有助于调节BBB的功能，大量的miRNA-
125a-5p在BBB功能受损后的脑内皮细胞中下调，BSCB功能可能与miRNA-
125a-5p的表达有关[15]。

BSCB和BBB的作用类似，本实验探讨了miRNA-
125a-5p对BSCB的影响。

本实验结果显示，SCI后ZO-1的含量明显下降影响BSCB的功能，血管内有毒有害物质进入细胞间隙影响细胞生理功能，不利于损伤后运动功能的保留，目前的研究数据表明通过在大鼠鞘内导入miRNA-125a-5p
的模拟物miRNA-125a-5p agomir后miRNA-125a-5p在SCI的大鼠脊髓中的
高表达，且ZO-1的相对表达量明显增加，血脊髓屏障的通透性减弱。

通过对各组的比较显示导入miRNA-125a-5p agomir后脊髓前角运动神经元的保有量增加且
28 d后脊髓运动功能的恢复也有很大程度的提高。

本实验寻求了一种可以改变BSCB功能的方法并且在SCI的治疗中通过提高miRNA-125a-5p的含量调节BSCB的通透性对SCI的恢复和运动功能的保留具有积极意义。

调控miRNA-
125a-5p无疑会成为治疗SCI的一种新的思路和方法。

参考文献
【相关文献】
[1]Mcdonald J W，Sadowsky C.Spinal-cord injury[J].Lancet，2002，359（9304）：417-425.
[2]Yuan Q，Su H，Chiu K，et al.Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats.[J].Neurosci Bull，2013，29（4）：509-516.
[3]刘明明，程建，马勇，等.脊髓损伤后血脊髓屏障病变机制研究进展[J].安徽医科大学学报，2015，50（12）：1827-1830.
[4]李禾，邢更彦，杨传铎，等.大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障通透性变化的观察[J].中国脊柱脊髓杂志，2001，11（4）：216-218.
[5]Abbott N J，Patabendige A A，Dolman D E，et al.Structure and function of the blood-brain barrier[J].Neurobiol Dis，2010，37（1）：13-25.
[6]Yi F，Fuhua C.MicroRNA-125a-5p regulates cancer cell proliferation and migration through NAIF1 in prostate carcinoma[J].OncoTargets Therapy，2015，17（8）：3827-3835.
[7]Nakkeeran S，Kavitha K，Chandrasekar G，et al.Induction of plant defence compounds by Pseudomonas chlororaphis PA23 and Bacillus subtilis BSCBE4 in controlling damping-off of hot pepper caused by Pythium aphanidermatum.[J].Biocontrol Sci Technol，2006，16（4）：403-416.
[8]Carthew R W，Sontheimer E J.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell，2009，136（4）：642-655.
[9]Bartanusz V，Jezova D，Alajajian B，et al.The blood-spinal cord barrier：morphology and clinical implications[J].Ann Neurol，2011，70（2）：194-206.
[10]张永涛，高渊涛，李宵，等.miR-126促进脊髓损伤模型神经干细胞的生长增殖和分化[J].解剖
学杂志，2018，41（3）：297-302.
[11]Bartanusz V，Jezova D，Alajajian B，et al.The blood-spinal cord barrier：morphology
and clinical implications[J].Ann Neurol，2011，70（2）：194-206.
[12]Kuntner C，Bankstahl J P，Bankstahl M，et al.Dose-response assessment of tariquidar and elacridar and regional quantification of P-glycoprotein inhibition at the rat blood-brain barrier using（R）-[11C]verapamil PET[J].Eur J Nuclear Med Mol Imag，2010，37（5）：942-953.
[13]Zheng B，Ye L，Zhou Y，et al.Epidermal growth factor attenuates blood-spinal cord barrier disruption via PI3K/Akt/Rac1 pathway after acute spinal cord injury[J].J Cell Mol Med，2016，20（6）：1062-1075.
[14]Wu L，Fan J，Belasco J G.MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA[J].Proc Nat Acad Sci U S A，2006，103（11）：4034-4039.
[15]Reijerkerk A，Lopez-Ramirez M A，van Het Hof B，et al.MicroRNAs regulate human brain endothelial cell-barrier function in inflammation：implications for multiple sclerosis[J].J Neurosci，2013，33（16）：6857-6863.
[16]Che P，Liu J，Shan Z，et al.miR-125a-5p impairs endothelial cell angiogenesis in aging mice via RTEF-1 downregulation[J].Aging Cell，2014，13（5）：926-934.。