细胞游离Ca的测定方法
杂种鹅掌楸花粉发育过程中细胞游离Ca 2+的动态变化
Ａ ｓｒｃ ： Ｆｕ ｒｓｅｔ ｒｂ ｃｔｘｍｅ ｙ ｅｔｒ ｆ ｕ 一 Ｆｕ 一／ Ｍ）ｗ ｓｌ ｄ ｄｉｔ ｔｅｃｌ ｆ ｉｏｅ ｄｏ ｌ ｉ ｒ ｘ ｂ ｔａ ｔ ｌｏｅｃ ｎ ｏｅａｅｏｙ ｔ ｌ ｓ ｏ３（ ｏ３ Ａ ｐ ｈ ｅｏＦ ｌ ｌ ａ ａ ｅ ｏ ｈ ｅｌ ｏ ｒ ｄｎ ｒｎｔ ｉｆ ａ ｏ ｎ ｓ Ｌｉ ｕｐ ｅ
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尹 增 芳 宁代 锋 李 玉 春 席 梦 利
摘
施 季 森
南 京 ２ ０３ ） １０７
（ ． 京林 业 大学 森林 资 源 与环 境 学 院 南 京 ２ ０３ ； ２ 国 家 林 业 局 林 木 遗 传 与 基 因 工 程 重 点 实 验 室 １南 １０７ ．
要 ： 利 用 钙 离 子 荧 光 探 针 Ｆ ｏ ／Ｍ 低 温 装 载 技 术 ， 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 杂 种 鹅 掌 楸 花 粉 发 育 不 ｌ Ａ ｕ３ 在
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生物制品生物活性效价测定方法验证指导原则
生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则一、前言对药品质量控制分析方法进行验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。
生物制品质量控制中生物活性/效价为反映生物制品有效性的关键质量属性，对相应的测定方法进行规范的验证是保障其适用性的前提。
本指导原则从验证方案的制定、各验证指标的具体验证策略、验证结果的记录和方法的监控及再验证的角度阐述了生物活性/效价测定方法验证相关的要求，旨在对新建的或拟修订的生物制品生物活性/效价测定方法所开展的验证工作进行规范与指导。
本指导原则中的生物活性/效价测定主要是指相对效价测定，该法系将供试品的生物反应与已知标准品产生的反应相比较，从而定量测定供试品相对于标准品的效价。
二、方法验证的基本要素1.验证方案方法验证需根据验证方案来完成。
验证方案不仅应包括验证设计、验证指标、合理的可接受标准和数据分析计划，还应涵盖不符合可接受标准时可采取的措施等。
1.1验证设计验证设计主要涉及样品的选择、实验变异来源的考量及试验重复策略等。
应采用具有代表性的样品进行验证试验，并在验证方案中注明所需样品的类型及数量。
实验变异的来源主要包括样品的制备、试验内和试验间的影响因素。
试验内变异可能受方法开发阶段所确定的实验条件（温度、pH、孵育时间等）、实验设计（动物数量、稀释度组数、每个稀释组的重复数、稀释度间隔等）、试验过程、系统适用性和样品适用性要求、统计分析等因素的影响。
而试验间变异主要受不同分析人员、不同试验时间、不同仪器设备和试剂批次等因素的影响。
因此，一个设计良好的验证方案应综合考量试验内和试验间变异的来源。
此外，每轮验证试验中标准品和供试品均应独立制备。
验证中使用的重复策略应尽量反映影响效价测定结果的实验因素。
1.2验证指标与可接受标准由于相对效价测定方法各具特点，并随分析对象而变化，因此需视具体方法拟订具体的验证指标，关于常见验证指标的具体讨论见本节“2.各验证指标的验证策略”项下。
钙离子测定
用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。
根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。
其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth．Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。
Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。
Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。
以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。
为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+浓度的动态变化。
结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。
该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。
水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。
ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有氧情况下，自发组成功能全蛋白，具有三个Ｃａ２＋结合手性位点。
共聚焦原理及操作
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
细胞内ca离子的检测方法
细胞内钙离子的检测方法包括荧光探针法、放射性同位素示踪法、电极法等。
下面我将结合以上方法给出详细的说明：
1. 荧光探针法：这是一种应用广泛的细胞内离子检测方法，主要应用于钙离子检测。
钙离子荧光探针如BCECF、Fluo-3、Fura-2等可以嵌入细胞，特异性地与细胞内的钙离子结合，从而改变其荧光特性。
例如，当钙离子结合到Fluo-3等染料上时，染料的吸收和发射光谱会发生变化，使其在细胞内的钙离子浓度变化时可以被仪器检测到。
这种方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也有一定的局限性，如细胞内钙离子浓度变化时可能伴随其他离子浓度的变化，导致结果复杂。
2. 放射性同位素示踪法：这种方法需要使用放射性标记的物质，如Ca45，将其引入细胞内，通过放射自显影技术检测细胞内钙离子的变化。
这种方法操作相对复杂，且有一定的放射性污染风险，因此较少使用。
3. 电极法：这是一种通过在细胞内放置一个微电极，该电极可以测量钙离子的电化学变化。
这种方法主要用于体外实验，如组织块或单个细胞的钙离子测定。
在实际操作中，荧光探针法更为常用，因为其灵敏度高、操作简便。
然而，任何一种方法都有其局限性，需要在实验设计和实际操作中根据具体情况进行选择和调整。
以上就是细胞内钙离子检测的一些常见方法，希望能对你有所帮助。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测在宫颈癌筛查中的应用
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测在宫颈癌筛查中的应用细胞游离亚铁原卟啉（f-PI）是一种在细胞内的铁离子螯合物，其浓度与细胞内代谢活性有一定的相关性。
在宫颈癌发展的早期阶段，宫颈细胞代谢活跃，f-PI的浓度会显著升高。
通过检测f-PI浓度变化可以间接反映出宫颈细胞的代谢状态，从而实现对宫颈癌的早期筛查和诊断。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测可以提高宫颈癌的筛查特异性。
传统的宫颈液基细胞学检测在筛查宫颈癌时，容易受到炎症、感染和其他非癌症病变的干扰，从而导致假阳性结果的出现。
而细胞游离亚铁原卟啉检测与宫颈细胞的代谢活性相关，对于非癌症病变有一定的区分度，可以有效降低假阳性结果的发生，提高筛查的特异性。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测具有较高的筛查敏感性。
宫颈癌的早期阶段细胞代谢活跃，f-PI的浓度升高，可以导致该检测方法对宫颈癌的早期变化具有较高的敏感性，能够有效发现癌前病变和早期宫颈癌。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测简单易行，操作便利。
该检测方法可以在宫颈液基细胞学检测的基础上进一步构建，只需对采集的宫颈细胞进行简单的预处理和f-PI浓度检测即可，操作相对便利且成本较低。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测具有一定的前瞻性。
随着分子生物学和细胞代谢研究的不断深入，对于宫颈细胞的代谢活性和相关标志物的研究将会越来越丰富，从而可以进一步完善和提高该检测方法的准确性和可靠性。
宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测在宫颈癌筛查中具有较高的潜力和应用前景。
目前国内外一些研究机构和学术团体也在积极开展相关研究工作，以验证该方法在临床中的可行性和价值。
相信随着研究工作的不断推进，宫颈微环境中细胞游离亚铁原卟啉检测将成为宫颈癌筛查的重要补充，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供更加精准的辅助手段。
十大常见肿瘤指标
十大常见肿瘤指标导言：肿瘤是近年来人们关注的热点话题之一。
早期发现和诊断肿瘤对于患者的治疗和康复至关重要。
在临床医学中，肿瘤指标成为了一种快速、可靠的手段，用于判断患者是否患有肿瘤。
本文将为您介绍十大常见肿瘤指标，希望能帮助您更全面地了解和认识肿瘤。
一、癌胚抗原（CEA）癌胚抗原是一种常见的肿瘤标志物，广泛应用于结肠癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤的早期筛查和诊断。
其检测方法主要基于鳞状上皮癌细胞的分泌物，可通过血清样本检测其水平，从而判断患者是否存在潜在的肿瘤。
二、癌抗原（CA）癌抗原是一类与各种肿瘤相关的标志物，例如CA19-9与胰腺癌相关、CA15-3与乳腺癌相关。
这些指标的检测方法与CEA类似，通过血清样本测定其水平，对于肿瘤的筛查、辅助诊断和监测疗效有着重要价值。
三、前列腺特异抗原（PSA）前列腺特异抗原是男性前列腺癌的特异性标志物，在早期筛查和诊断中具有重要作用。
常见的前列腺癌指标包括总PSA和游离PSA水平，通过测定血清中的PSA含量，可以辅助判断男性患者是否存在前列腺癌的风险。
四、甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白是一种胎儿期的蛋白质，在成年人中应该是不存在的。
当肝细胞癌或睾丸癌等恶性肿瘤发生时，AFP的水平会升高。
因此，AFP可以用作肝癌和睾丸癌的辅助诊断指标。
五、白血病相关标志物（WBC）白血病是一种常见的恶性肿瘤，白血病相关标志物包括白血病细胞的表面抗原和酶，例如淋巴细胞酶、髓过氧化物酶等。
测定这些标志物有助于白血病的早期诊断和鉴别诊断。
六、神经内分泌肿瘤标志物（NET）神经内分泌肿瘤是一类源于神经内分泌细胞的肿瘤，如胰岛细胞瘤、类癌瘤等。
NET标志物的检测包括胰岛素样生长因子、内生素等，可用于早期诊断和监测治疗效果。
七、绒毛膜癌标志物（HCG）绒毛膜癌是一种妊娠相关肿瘤，产生大量的绒毛膜癌标志物HCG。
通过HCG水平的测定，可以辅助绒毛膜癌的早期诊断和治疗监测。
八、骨肉瘤相关标志物（BMP）骨肉瘤是一种恶性肿瘤，常见于儿童和青少年。
输尿管部分梗阻后平滑肌细胞中游离Ca 2+浓度改变
只 随机分 为 ４组 ： ８周 Ｐ ＵＯ组 ２ Ｕ ０只 ，６周 Ｐ Ｕ １ Ｕ Ｏ组 ２ ０只 ， 同期对 照组 各 ２ ０只 Ｐ Ｕ Ｕ Ｏ组采 用将 大 鼠左侧 上 １ ＼ ２段 输尿 管包埋 入腰 大肌 造成 单侧 输尿 管部 分梗 阻 的动物模 型 ， 照组仪 分 离左侧 输尿 管 。成模 后分别 于 ８周 和 １ 对 ６周 分离取 出输 尿管 ，分 离单 个输 尿管平 滑肌 细胞 应用 Ｆ ｒ一 ／ ｕａ ２ＡＭ荧 光探 针 负载 检测 输 尿管 平滑 肌 细胞 中游 离 Ｃ ２ ａ＋ 的 浓度 。结 果 ：输 尿管平 滑 肌静态 细胞 内 Ｃ 光 比值测 定结 果显示 ： ａ荧 ８周 的 Ｐ Ｕ Ｕ Ｏ大 鼠组 与对 照组 大 鼠之 间 细胞 内 游离 Ｃ “ 度 的差 异 无 统计 学意 义 ， １ ａ浓 而 ６周 的 Ｐ ＵＯ大 鼠组细 胞 内游 离 Ｃ 的浓度 显 著升 高 ， Ｕ ａ’ 且差 异 具有 统 计学 意 义 （ ＜ ．５ 。结 论 ： 胞 内 钙 超 载 是 输 尿 管 梗 阻 后 平 滑 肌 功 能 损 害 病 理 过 程 的 重 要 原 因 ， 是 发 生 较 晚 ， 能 在 输 Ｐ ００ ） 细 但 可
血清钙(Ca)偶氮胂Ⅲ法测定
血清钙（Ca）偶氮胂Ⅲ法测定1. 实验原理偶氮胂Ⅲ比色终点法。
钙与偶氮胂Ⅲ在中性条件下形成蓝色复合物，显色强度与钙浓度成正比。
加入8-羟基喹啉-5-磺酸掩蔽镁的干扰。
2. 标本采集2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 类型：血清、肝素血浆或尿液。
3. 标本存放：血清/血浆稳定性：20～25℃保存可稳定7天；4～8℃保存可稳定3周；-20℃保存可稳定8个月。
尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定4天；-20℃保存可稳定3个月；对24h尿液标本加浓盐酸10ml，并加热标本，使草酸钙溶解。
4. 标本运输：室温条件下运输5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：6.1 上海申能钙测定试剂盒（货号：111 1137170 试剂：8×70ml）6.1.1 试剂组成磷酸盐缓冲液pH7.5 50mmol/L8-羟基喹啉-5-磺酸5mmol/L偶氮胂Ⅲ120mmol/L表面活性剂适量6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
开盖后应避免污染。
6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：由于钙离子到处都有，必须严加注意采取避免污染。
只使用一次性检测用品。
微量螯合剂(如EDTA等)都会阻碍显色复合物的生成。
须严加注意。
试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：贝克曼AU680生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见AU680生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2仪器操作步骤：参见AU680生化分析仪操作规程.SOP文件9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
血清钙Ca比色法测定
血清钙Ca比色法测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理在碱性条件下，加入8-羟基喹啉能防止镁和铁的干扰钙离子的测定情况下，Ca2+和邻甲酚酞络合酮形成紫色复合物钙 +O-CPC 碱性环境钙－O-CPC复合物其钙离子与邻甲酚酞络合酮复合物的颜色与钙浓度成正比，可用利用其吸光度的变化来测定钙离子的含量。
3 标本采集3.1 病人准备：无特殊要求。
3.2 类型：血清、肝素血浆或尿液。
3.3 标本存放：血清/血浆稳定性：20～25℃保存可稳定7天；4～8℃保存可稳定3周；-20℃保存可稳定8个月。
尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定4天；-20℃保存可稳定3个月；对24h尿液标本加浓盐酸10ml，并加热标本，使草酸钙溶解。
3.4 标本运输：室温条件下运输3.5 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
4. 实验材料：4.1 试剂：上海罗氏诊断产品有限公司CA试剂盒,国械注进20142405056YZB/GER 5724-2014）4.1.1 试剂组成R1 氨基乙醇缓冲液:1mol/L，pH10.6R2 邻甲酚酞络合酮:0.3mmol/L;8－羟基喹啉:13.8mmol/L;盐酸:122mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：15－25°C下保存期限：见试剂标签上的有效期机上稳定期：42天。
4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
4.2 校准品：使用罗氏多项生化校准品提供的Ca校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪。
6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
细胞代谢检测方法
细胞代谢检测方法
细胞代谢检测方法用于测量细胞内的代谢活动，包括能量产生、底物利用和代谢产物的生成等。
以下是常用的细胞代谢检测方法：
1. 测定氧消耗率和二氧化碳产生率：通过监测细胞培养液中的氧气和二氧化碳浓度变化，计算细胞的氧消耗率和二氧化碳产生率，从而得到能量产生的信息。
2. 测定ATP含量：ATP是细胞内能量的主要来源之一，可以通过ATP酶反应或火焰原子吸收光谱法对细胞样品中的ATP含量进行测定。
3. 测定底物和产物浓度：通过色谱、质谱等分析方法，测定细胞培养液中的底物和产物浓度的变化，以反映细胞的代谢活性。
4. 细胞酶活性测定：使用特定的酶活性检测试剂盒，测定细胞样品中酶的活性，如葡萄糖酸脱氢酶活性检测用于测定葡萄糖代谢活性。
5. 测定细胞内标志物：通过分析细胞内特定代谢标志物的含量，如
NADH/NAD^+比值、AMP/ATP比值等，来评估细胞的代谢状态。
6. 流式细胞术：利用流式细胞术结合荧光标记的底物，测定细胞内特定代谢酶的活性或特定代谢物的变化，如测定细胞内ROS水平。
7. 核磁共振技术：通过核磁共振谱分析技术，可以定量分析细胞内特定代谢物的含量及其代谢速率的变化。
这些方法可以单独应用或结合使用，以全面了解细胞的代谢状态和活动。
ft3生物化学检验方法
ft3生物化学检验方法
FT3（游离三碘甲状腺原氨酸）是甲状腺功能检测中的一项重要指标，其浓度的测定对于评估甲状腺功能异常具有重要的临床意义。
生物化学检验方法是测定FT3浓度的主要手段之一。
FT3是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素之一，约占T3（三碘甲状腺原氨酸）的0.3%，能透过细胞膜进入组织细胞，发挥生理效应。
其浓度与组织中的T3浓度一致，也与机体代谢状态一致，对于非甲状腺疾病的诊断也具有一定的价值。
生物化学检验方法主要通过测定血清中FT3的浓度来评估甲状腺功能。
常用的方法有放射免疫法（RIA）和化学发光法等。
其中，RIA法是最常用的方法之一，其原理是利用放射性同位素标记的T3与血清中的FT3竞争结合抗体，通过测量放射性同位素的活度来推算血清中FT3的浓度。
化学发光法则是利用化学发光原理，通过特定的试剂与血清中的FT3反应，产生光信号，从而测定FT3的浓度。
在进行FT3生物化学检验时，需要注意一些干扰因素，如血清中存在的高浓度的甲状腺结合球蛋白、异位甲状腺素等，都可能影响FT3的测定结果。
因此，在进行FT3测定前，通常需要进行一些预处理步骤，如稀释血清、去除甲状腺结合球蛋白等，以提高测定的准确性和可靠性。
总之，FT3生物化学检验方法是评估甲状腺功能的重要手段之一，通过准确的测定血清中FT3的浓度，可以为临床诊断和治疗提供重要的参考信息。
第十二章钙磷镁和微量元素检验
EDTA-Na2络合滴定法 在碱性溶液中，血清钙与钙红指示剂结合成可溶性的复合物，使溶液呈淡红色，EDTA-Na2对钙有很大的亲和力，能与复合物中的钙络合，使钙红指示剂重新游离，溶液变蓝色，根据EDTA-Na2滴定用量可计算出血清钙含量。 钙 ＋ 钙红 钙-钙红复合物 淡红色 钙-钙红复合物＋EDTA-Na2 EDTACa＋钙红 蓝色
第一节 概 述
一、钙、磷代谢及调节 （一）含量与分布 钙是体内含量最多的无机盐，占体重的1.5%～2%，总量约700～1400g，其次是磷，占体重0.8%～1.2%，总量约400～800g。99%以上的钙和86%以上的磷是以羟磷灰石形式沉积于骨、牙。
（二）吸收与排泄 吸收：在pH较低的小肠上段，钙的吸收率随年龄的增长而降低，每增加10岁减少5%～10%，婴儿吸收率可达50%以上，儿童40%，成人20%左右，故老人易发生骨质疏松症。 磷的吸收率约70%，低磷时可达90%。 排泄：主要通过肠道和肾脏。 钙： 80% 肠道 20% 肾脏 磷： 30% 肠道 70% 肾脏
发挥生理作用的是离子钙，但临床实验室测定的大多数是总钙。血浆中[Ca2＋]、[H＋]、[HCO3－]的关系可用下式表示。 血磷是指血液中的无机磷酸盐（HPO42－、H2PO4－）正常人血清无机磷0.97～1.61mmol/L（3～5mg/dl），儿童稍高。
[H＋]
三、微量元素与疾病 （一）体内化学元素组成和分类 人体约含有50多种元素。 主要元素 含量＞0.1g/kg体重 C、H、O、N、S、P、Ca、 K、Na、Cl、Mg等 必需的 Fe、Cu、Zn、Mn、 Co、Ni、Se、I、F等14种 微量元素 含量＜0.1g/kg体重 非必需的 Si、As、Rb、 B、Al等 有害的 Bi、Hg、Pb、Be等
Fura-2测钙原理
测钙原理：Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发，即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。
因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而利用Grynkiew icz公式可求游离Ca2+的浓度。
Grynkiew icz公式：〔Ca2+〕i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）其中，Kd为Fura-2和Ca2+结合的平衡解离常数,β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值,R是Ratio比值，Rmin是零钙时Ratio值，Rmax是饱和钙时的Ratio值。
Fura-2 Ratio法可用于测定组织块、器官、人工培养的单层贴壁细胞、血小板等胞内的游离钙。
以下以人工培养的单层贴壁细胞为例介绍实验方法：此检测方法定量，具有快速，灵敏等优点。
测钙样品准备：材料与方法试剂：1. DMSO 溶液：配置 10 ml 的含 20％ F127 的DMSO母液。
2. Fura-2/AM溶液：使用含20％F127 的DMSO 溶液溶解成 1 mM 的母液。
如：使用 1 ml 20％ F127 的DMSO 溶液溶解 1 mg Fura-2 AM。
分装 Fura-2 AM （1 mM 的 stock solution）成 1 ul 一管，储存于－70度冰箱，可以使用1年以上。
此试剂购自molecular Probe公司。
3. K2H2EGTA，K-MOPS，KCI，CaCl2，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），多聚赖氨酸，Tris等均购自sigama公司。
Pluronic F-127（表面活性剂有助于负载染料进入细胞），牛血清蛋白（albumin bovine，BSA，电泳纯）（与Pluronic F-127的功效类似）等试剂可购自Amresco公司。
细胞胆固醇分泌的测量方法
细胞胆固醇分泌的测量方法
1. 放射性标记法。
放射性标记法是一种常用的测量细胞胆固醇分泌的方法。
该方法利用放射性同位素标记胆固醇，然后将其添加到培养基中与细胞共培养。
细胞摄取标记的胆固醇后，通过测量培养基中的放射性活性来确定细胞胆固醇的分泌量。
2. 色谱法。
色谱法是另一种测量细胞胆固醇分泌的常用方法。
该方法利用气相色谱或液相色谱技术，将细胞培养基中的胆固醇分离并定量分析。
通过比较不同样本中胆固醇的峰值面积或浓度，可以确定细胞胆固醇的分泌量。
3. 荧光染料法。
荧光染料法是一种简便、快速的测量细胞胆固醇分泌的方法。
该方法利用荧光染料与胆固醇结合，并通过荧光信号的强度来定量测量细胞胆固醇的分泌量。
荧光染料法不需要昂贵的设备和复杂的
操作，因此在实验室中得到广泛应用。
综上所述，测量细胞胆固醇分泌的方法多种多样，研究人员可以根据实验的需要和条件选择合适的方法。
这些方法的应用将有助于深入了解细胞胆固醇代谢的调控机制，为相关疾病的治疗和预防提供理论依据。
游离葡聚糖检测方法
游离葡聚糖检测方法
游离葡聚糖的检测方法主要包括以下步骤：
1.提取细胞培养液中的葡聚糖。
这通常涉及将细胞收集到合适的
体积，离心去除沉淀后，用预冷的PBS洗涤一次，并调整细胞浓度至适当水平。
然后将细胞接种在培养瓶中，于适宜条件下培养一段时间。
之后收集上清液，按厂家提供的方法提取葡聚糖。
2.用苯酚红外分析仪检测葡聚糖浓度。
首先，用移液枪准确吸取
一定体积的样品液，加入离心管中，然后加入与样品液体积比为1:1的苯酚试剂，混匀。
接着，将混匀后的样品液在适宜温度下恒温放置，并在苯酚试剂空白位置测定波长。
然后，将离心管中溶液进行离心，离心后将上清液去除，再将样品管放入红外分光光度计中检测苯酚-葡聚糖复合物的最大吸收值。
最后，根据红外分光光度值计算出葡聚糖浓度。
此外，也可以使用葡聚糖浓度测定试剂盒来检测葡聚糖，只需按照说明书操作即可。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结1. 几种细胞凋亡检测方法中TUNEL法的优点和缺点是什么？2. TUNEL法的实验原理是什么？3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k 的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
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一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。
但优于Fura-2/AM 的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。
图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。
具体过程如下：1 Ca2+荧光探针负载1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i1.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
2.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
3.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
4.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为R max；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i1.对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光强度及分布变化，拍照。
2.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。
激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。
细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。
为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(R-R min)/(R max-R)](F min/F max)其中，K d为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；R max、R min分别为上述测定的最大和最小荧光比值；F min、F max 分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。
实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(F-F min)/(F max-F)]其中，K d为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，F max、F min分别为加0. 程如下：1 Ca2+荧光探针负载1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i5.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
6.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
7.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
8.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为R max；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i3.对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光强度及分布变化，拍照。
4.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。
激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。
细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。
为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(R-R min)/(R max-R)](F min/F max)其中，K d为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；R max、R min分别为上述测定的最大和最小荧光比值；F min、F max 分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。
实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(F-F min)/(F max-F)]其中，K d为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，F max1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。