(推荐)乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

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乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。

我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。

研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。

同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

乙肝的治疗方式有哪些？HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。

由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。

但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么？HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。

通常分为以下几种：（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

基因芯片检测乙肝病毒分型和耐药突变的准确度灵敏度分析

62安全、有效的抗病毒治疗对于延缓乙型病毒性肝炎病情进展具有重要意义[1]。

然而，HBV 包括多种基因型，不同基因型耐药特点存在差异，耐药严重影响了抗病毒治疗效果[2]。

当前临床明确HBV 耐药突变检测的金标准为DNA 直接测序法，但存在成本高、耗时久等弊端，无法满足快速诊断、大规模推广要求[3]。

本研究就基因芯片检测HBV 分型及耐药突变的准确度及灵敏度进行分析，旨在评估该技术的临床应用价值。

1　资料与方法1.1　一般资料以我院2014年5月—2016年9月参照2010年全国传染病与寄生虫病学术会议拟定的《病毒性肝炎防治方案》确诊的乙型病毒性肝炎患者为研究对象。

入组患者乙肝表面抗原（HBsAg ）及HBV DNA 检测均为阳性（HBV DNA ≥1×103 IU/mL ），排除合并其他类型肝炎及免疫性肝病、胆汁型肝硬化患者及基因芯片检测无信号者[4]共351例入选。

其中男189例，女162例，年龄17～71岁，平均年龄（48.42±10.58）岁。

351例患者均有长期（≥48周）核苷类抗病毒药物使用史，其中208例接受拉米夫定治疗，143例接受阿德福韦酯治疗。

本研究已征得我院医学伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2　研究方法1.2.1　标本采集　抽取患者入组次日空腹静脉血4 mL ，分装于4支抗凝管内，分别用于基因芯片法HBV 基因分型、耐药突变检测及基因测序法HBV 基因分型、耐药突变检测。

1.2.2　标本检测　基因芯片：HBV 基因分型及耐药突变检测试剂均购自深圳亚能生物技术有限公司，使用Biomctra基因扩增仪及FYY-3型分子杂交仪（兴化市分析仪器厂），操作均严格按照试剂使用说明书。

扩增循环条件：95℃ 10 min →94℃ 34 s →56℃ 30 s →72℃ 30 s ，重复循环50次。

结果分析使用光学扫描仪[5]。

HBV 膜条探针排列顺序设计见表1。

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流行病学研究。

三．临床意义：HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。

与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。

核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。

但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。

HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。

乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。

四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。

五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am八．送检地点：检验科三楼服务台九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。

乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。

由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。

通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

摘要：目的建立直接测序法检测ＨＢ区耐药变异情况并分析基因型。探讨ＨＢ基因型与临床病情的关系。方法ＶＰＶ
检测４６例乙肝患者血清样本，用特异的引物对待检标本ＨＢ区进行ＰＲ扩增后作基因序列检测，用Ｃｒｍａ２２采ＶＰＣ利ｈｏｓ．３软件对测序结果进行分析有无突变产生，序结果用软件ｃｕｔｌ１８测ｌｓｘ．１进行基因分型分析。结果可通过一次测序反应完成对ａＨＢＤＮＡＰ区的基因检测及基因型分析。检出ＹＭＤ变异株８例，中ＹＩ例，ＶＤＶ．Ｄ其ＤＤ５ＹＤ３例。在检测的４６例标本中２３例为Ｂ基因型，阳性率为５．；２例为ｃ基因型，阳性率４．；基因型２，００有１其５６Ｄ例阳性率４４。Ｂ基因型ＨＢ感染者中ＨＣ．ＶＣ２例，８７；占．Ｃ基因型ＨＢ感染者中ＨＣＶＣ８例，３．。结论直接测序法分析ＨＢ常见耐药突变位点及基因型准确可占８１Ｖ
ｔｅｅｗｅｅ２ｈｐｔｃｌｌｒｃｒｉｏｈｒｒｅａｏｅｌａａｃｎｍａ（．）ｉｅｏｙｅＢｐｔｎ，ｅａｏｅｌｌｒｃｒｉｏｕ８７ｎｇｎｔｐａｉｓ８ｈｐｔｃｌａａｃｎｍａ（８１）ｉｅｏｙｅＣａｉｎｓｅｕ３．ｎｇｎｔｐｐｔｔ．ｅ

武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析

武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【总页数】4页(P969-972)【关键词】肝炎病毒;乙型;HBV DNA;基因型;耐药【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型测定对评估慢性乙型肝炎感染者的疾病进展和制定最佳抗病毒治疗方案很重要，相比而言，肝硬化和原发性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多为基因C型和D 型［1-3］。

乙型肝炎病毒基因分型与耐药突变基因位点的检测分析

乙型肝炎病毒基因分型与耐药突变基因位点的检测分析姚玮;王久香;霍星星;周秋梅;黄开泉【摘要】目的分析乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐药突变基因位点,为指导临床抗病毒治疗合理用药提供依据.方法回顾分析2014年3月～2016年10月安徽中医药大学第一附属医院114例乙型肝炎患者HBV基因分型和拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韦酯(ADV)和恩替卡韦(ETV)四种核苷类药物(NAs)耐药及耐药突变位点分布情况、HBV核酸(HBV DNA)定量、HBVE抗原(HBeAg)定量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的浓度、血小板(PLT)的含量.结果 114例乙型肝炎患者中检测出HBV基因C型61例,B型45例,D型3例,B+C混合型1例,B+D混合型1例,其他基因型5例.其中C型多于B型(P<0.05).检出39例NAs耐药,耐药率为34.21％;C型与B型耐药无显著差异.C型患者HBeAg定量高于B型患者(P<0.05),PLT计数低于B型患者(P<0.05).耐药突变位点最多见于rt204I;C型多位点突变高于B型(P<0.05).LAM和LdT联合耐药最多见,两种及两种以上多重耐药高于单一耐药(P<0.01).结论本研究中乙型肝炎患者HBV基因型多为C型,其次为B型.C型患者容易发生肝纤维化,更易发生多位点突变.NAs耐药以LAM和LdT联合耐药为主,多为两种以上联合耐药.检测HBV基因型和耐药突变基因位点对评价乙型肝炎临床治疗效果和指导临床抗病毒治疗合理用药具有十分重要的意义.【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2019(021)004【总页数】4页(P428-431)【关键词】乙型肝炎病毒;HBV基因分型耐药突变位点核苷类药物【作者】姚玮;王久香;霍星星;周秋梅;黄开泉【作者单位】230031 安徽中医药大学第一附属医院;230031 安徽中医药大学第一附属医院;230031 安徽中医药大学第一附属医院;230031 安徽中医药大学第一附属医院;230031 安徽中医药大学第一附属医院【正文语种】中文【中图分类】R512.62HBV是乙型病毒性肝炎的主要病因，全世界约有20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者。

PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型

出血临床观察［Ｊ］．中国当代医药，２０１０，１７（１）：４３ — ４４．
［１Ｏ］林道浙，徐定银，陈积贤．泰绫在甲状腺手术中的应用［Ｊ］．中
华普外科手术学杂志，２０１０，４（２）：２００－２０３．［１１］ＳｉｌｖｅｖｓｔｅｉｎＭＥ，ＣｈｖａｐｉｌＭ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｅｘｐｅｉｒｅｎｃｅｓｗｉｓｈｃｏｌｌａｇｅｎｌｆｅｅｃｅａｓａｈｅｍｏｓｔａｔｉｃａｇｅｎｔ［Ｊ］．ＪＴｒａｕｍａ，１９８１，２１
［７］刘远成，叶伟明，沈奎．痔术后出血的预防及治疗［Ｊ］．中医药
临床杂志，２０１０，２２（３）：２５４－２５５．［８］贺平，谢敏江，张桢，等．地奥司明用于痔外剥内扎术后４７（９）：１０８１－１０８２．［９］卢本银，李扬轶，赖彪，等．痔上动脉缝扎术预防外剥内扎术后
血绫是由纯天然再生纤维素经化学变性后而成，无毒、无害，不含任何药物，遇血后与手术创面贴敷严
密，然后逐渐溶化膨胀成半透明凝胶样，具有很好的物理、生理、化学止血功效，除用于一般止血外，还用于创面广泛渗血和体内某些特殊部位的止血。本研究显示，治疗组术后１、３、５ｄ出血症状

乙型肝炎病毒耐药及监测

乙型肝炎病毒耐药及监测张欣欣　于德敏作者单位5　上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科目前国内外批准上市的慢性乙型肝炎治疗药物有6种:普通干扰素、聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。

治疗应答包括血清H BV D NA 的阴转、A LT 的正常化、H BeAg 的血清学转换和肝组织学的改善。

然而随着核苷(酸)类药物治疗时间的延长,乙肝病毒的耐药株有可能被筛选出来,并因此导致H BV D NA 水平的再次升高(病毒突破)、A LT 的反弹和H BeAg 血清学转换的逆转,已成为影响抗病毒疗效的主要因素而受到广泛关注。

一、抗病毒治疗失败的定义抗病毒治疗失败可分为原发性治疗失败和继发性治疗失败[1]。

原发性治疗失败指抗病毒治疗6个月后病毒载量的下降<1log10I U Πm L 。

继发性治疗失败是指在开始治疗有效(H BV D NA 下降≥1log10I U Πm L)后,病毒复制的反弹≥1log10I U Πm L 。

病毒反弹应当至少重复1次,每次间隔至少1个月的H BV D NA 定量检测来确定,但如果同时伴随着A LT 的升高则例外。

H BV D NA 检查方法的敏感性决定了确诊的时间,因此要早期诊断治疗失败必须要有高灵敏度和高特异性的检查方法。

对用干扰素治疗的病人,考虑到药物作用的机制,抗病毒治疗失败需要进一步的定义。

α干扰素治疗失败是指在6个月时H BV DN A 下降<1log10I U ΠmL 或病毒载量>109I U Πm L 。

目前各种临床试验对治疗失败的定义不尽相同。

可有检测H BV D NA 方法不同,耐药基因型检测和表型检测方法多样性,检测H BV D N A 所采用时间点差异等。

因此,为避免这些不一致性,治疗病人应当使用同一种实验室检查方法进行监测,并且病毒载量应当使用国际单位来计算。

二、H BV 准种动力学变化和耐药的产生乙肝病毒的复制是通过逆转录方式进行的,在这个阶段病毒逆转录酶的自发出错率可导致点突变的累加。

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。

2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。

3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。

5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。

通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。

5.3 性能参数3 copies /ml 。

5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1 标本类型：血清或血浆。

5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。

5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。

5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。

5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。

HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用课件

对于阿德福韦酯耐药者，可加拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦联合治疗；
对于未应用过其他核苷（酸）类药物者，亦可换用恩替卡韦。
对于核苷（酸）类药物发生耐药者，亦可考虑改用或加用IFN类联合治疗，但应避免替比夫定和PegIFN联合应用，因为可导致外周神经肌肉疾病。
HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用
Marc Chany, T. Jake Liang. Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B. Gastroenterology,2007(132):1574-1585.
HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用
HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用
6
病原学
♣ HBV侵入肝细胞后，部分双链环状HBV DNA在细胞核内以负链 DNA为模板延长正链以修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状 DNA (cccDNA)；然后以cccDNA 为模板，转录成几种不同长度的 mRNA，分别作为前基因组RNA 和编码HBV的各种抗原。
3. 流行病学调查研究
HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用
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产品性能指标
1. 准确性：检测105例临床慢性HBV感染阳性样本，结果与测序比较显示为相同的基因型和耐药突变类型，准确率为100%。 2. 特异性：检测50例临床HBV阴性样本结果全部为阴性；检测非HBV 感染性病原体DNA，包括C型肝炎病毒（HCV）、乙型脑炎病毒、梅毒螺旋体和HIV，结果均为阴性。 3. 灵敏度：能稳定检测血清HBV的最低检出限为1.0×103IU/mL。 4. 精密度：检测2.0×103IU/mL的血清HBV，批内和批间的一致性好。 5. 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。

乙肝病毒基因分型、耐药突变基因检测与临床

乙肝病毒基因分型、耐药突变基因检测与临床摘要】目的:通过对地区慢性乙型肝炎患者HBV病毒基因分型、耐药突变基因的检测，明确其基因型，确认患者是否耐药，从而指导临床抗病毒治疗。

方法:采用荧光定量PCR和基因芯片反向斑点杂交技术检测102例慢性乙型肝炎患者血清HBV基因型和耐药突变基因型。

结果:102例慢性乙型肝炎患者中（1）血清HBVDNA定量为（4.5±2.3）×103～（5.8±1.5）×108copies/ml（2）HBV基因型C型77例占77.5％，B型24例占23.5％，D型1例约占1％（3）其中79例未采取过核苷（酸）类药物抗病毒治疗的患者未出现耐药，23例使用过核苷（酸）类药物抗病毒治疗一个疗程以上的，耐药突变点变异为M204V/I型的13例，L180M 型的为5例，L180M+M204VI的为5例，未检出其他突变基因型。

23例耐药基因型中HBV-C基因型占20例，3例为HBV-B基因型。

结论:本地区HBV基因型以C型为主，核苷（酸）类药物抗病毒治疗过程中HBV-C基因型容易发生基因突变而耐药，且以M204V/I突变型为主。

检测HBV基因型和耐药突变型是指导临床抗病毒治疗的重要指标。

【关键词】HBVDNA HBV基因型耐药基因【中图分类号】R512.6+1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）18-0208-021.资料与方法1.1 一般资料病例选择2011年6月－2013年6月在本院检测的102例血清HBSAG（+）,HBVDNA定量为（4.5±2.3）×103～（5.8±1.5）×108copies/ml的慢性乙型肝炎患者，慢性乙型肝炎的诊断依照《病毒性肝炎诊断标准》[1]。

其中男性为74例，女性为29例，年龄为18～59周岁。

留取血清标本作基因分型，耐药突变基因检测。

（102例慢性乙型肝炎患者中23例采取过核苷（酸）类药物抗病毒治疗一个疗程以上）1.2 方法1.2.1 标本采集采集慢性乙型肝炎患者空腹不抗凝静脉血3ml,3000r/min离心10min分离出血清检测。

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。

乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。

利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测

龙源期刊网利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测
作者：鲁旖
来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第10期
【摘 ;要】目的：建立利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法。

方法：查阅文献及利用NCBI设计引物，摸索和优化PCR扩增条件，PCR产物用一代测序进行测序分析。

结果：本方法所用引物及PCR产物能用于一代測序进行HBV基因分型和耐药检测。

结论 ;建立了利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法，为临床诊治提供个性化诊疗依据。

【关键词】乙型肝炎病毒;基因测序;基因分型
【中图分类号】R54 ;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）10-0286-02
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因组DNA是不完全双链的环状DNA，由一条不完整的正链和一条不闭合的负链组成。

;;HBV基因型包括A～I，我国以B型和C为主。

甘肃地区乙型肝炎病毒分型和耐药突变分析

㊃42㊃检验医学与临床2024年1月第21卷第1期 L a b M e d C l i n,J a n u a r y2024,V o l.21,N o.1㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.01.006甘肃地区乙型肝炎病毒分型和耐药突变分析*丁丽,陈俏丽ә,田鹏飞,张旭强,雷志萍甘肃省兰州市第二人民医院肝病研究所,甘肃兰州730046摘要:目的探讨甘肃地区乙型肝炎病毒(H B V)基因型分布特征及耐药情况,为乙型肝炎患者抗病毒用药提供指导依据㊂方法选择2018年1月至2019年8月于该院就诊的131例乙型肝炎患者,通过S a n g e r测序法分析患者H B V基因型和耐药突变位点分布情况㊂结果131例乙型肝炎患者共检出B㊁C㊁D3种基因型㊂其中B型2例(1.53%),C型126例(96.18%),D型3例(2.29%)㊂检出51例核苷酸类似物耐药,总耐药率为38.93%,其中B型1例,C型49例,D型1例㊂耐药突变位点最多见于M204V/I,多位点突变以M204V/I+ M204V联合突变多见,常在此基础上发生3位点㊁4位点甚至5位点突变㊂与阿德福韦酯相关的A181V/T㊁N236T㊁A181V/T+N236T耐单药突变最常见,共15例(29.41%)㊂耐多药突变36例(70.59%),主要以拉米夫定和替比夫定联合耐药为主,在此基础上多有恩替卡韦联合耐药发生㊂结论甘肃地区H B V患者基因型以C型为主,耐药形势严峻,突变组合模式复杂多样,应及时检测患者H B V基因型及耐药突变位点,以评价乙型肝炎患者临床疗效,并指导临床抗病毒治疗合理用药㊂关键词:乙型肝炎病毒;S a n g e r测序;耐药突变;基因型;甘肃中图法分类号:R446文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)01-0024-04G e n e t y p i n g a n d d r u g r e s i s t a n c e m u t a t i o n a n a l y s i s o f h e p a t i t i s B v i r u s i n G a n s u a r e a*D I N G L i,C HE N Q i a o l iә,T I A N P e n g f e i,Z HA N G X u q i a n g,L E I Z h i p i n gI n s t i t u t e o f L i v e r D i s e a s e s,L a n z h o u M u n i c i p a l S e c o n d P e o p l e's H o s p i t a l,L a n z h o u,G a n s u730046,C h i n a A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o a n a l y z e t h e g e n o t y p e d i s t r i b u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d d r u g r e s i s t a n c e s i t u a t i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s(H B V)i n G a n s u a r e a,s o a s t o p r o v i d e a g u i d a n c e b a s i s f o r a n t i v i r a l m e d i c a t i o n f o r t h e p a-t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B.M e t h o d s A t o t a l o f131p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B a d m i t t e d t o t h i s h o s p i t a l f r o m J a n u-a r y2018t o A u g u s t2019w e r e s e l e c t e d.T h e d i s t r i b u t i o n s i t u a t i o n o f H B V g e n o t y p e s a n d d r u g-r e s i s t a n t m u t a-t i o n s i t e s w a s a n a l y z e d b y t h e S a n g e r s e q u e n c i n g m e t h o d.R e s u l t s A m o n g131p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B,t h e g e n o t y p e B,C a n d D w e r e d e t e c t e d o u t,i n c l u d i n g2c a s e s(1.53%)o f t y p e B,126c a s e s(96.18%)o f t y p e C a n d3c a s e s(2.29%)o f t y p e D.F i f t y-o n e c a s e s o f n u c l e o t i d e d r u g r e s i s t a n c e w e r e d e t e c t e d w i t h a t o t a l d r u g r e s i s t a n c e r a t e o f38.93%,i n c l u d i n g1c a s e o f t y p e B,49c a s e s o f t y p e C a n d1c a s e o f t y p e D.M204V/I w a s t h e m o s t c o mm o n d r u g-r e s i s t a n t m u t a t i o n s i t e,a n d t h e M204V/I+M204V c o m b i n e d m u t a t i o n w a s m o r e c o m-m o n i n m u l t i-s t i e m u t a t i o n.T h e m u t a t i o n s a t t h r e e s i t e s,f o u r s i t e s a n d e v e n f i v e s i t e s o f t e n o c c u r r e d o n t h i s b a s i s.A d e f o v i r d i p i v o x i l-r e l a t e d A181V/T,N236T,a n d A181V/T+N236T s i n g l e-a g e n t m u t a t i o n s w e r e t h e m o s t c o mm o n,w h i c h h a d15c a s e s(29.41%).T h e r e w e r e36c a s e s(70.59%)o f m u l t i-d r u g m u t a t i o n s,w h i c h w a s d o m i n a t e d b y l a m i v u d i n e(L AM)a n d t e l b i v u d i n e(L D T)c o m b i n e d r e s i s t a n c e,o n t h i s b a s i s m o r e E n t e-c a v i r(E T V)c o m b i n e d r e s i s t a n c e o c c u r r e d.C o n c l u s i o n T h e g e n o t y p e i n t h e p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B i n G a n-s u a r e a i s m a i n l y t h e g e n o t y p e C,t h e d r u g r e s i s t a n c e s i t u a t i o n i s s e v e r e,a n d i t s m u t a t i o n c o m b i n a t i o n f o r m s a r e c o m p l e x a n d d i v e r s e.T h e r e f o r e,t h e H B V g e n o t y p e a n d d r u g r e s i s t a n c e m u t a t i o n s i t e s h o u l d b e d e t e c t e d i n t i m e t o e v a l u a t e t h e c l i n i c a l e f f i c a c y o f t h e p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B a n d g u i d e t h e d r u g r a t i o n a l u s e i n c l i n i c a l a n t i v i r a l t h e r a p y.K e y w o r d s:h e p a t i t i s B v i r u s;S a n g e r s e q u e n c i n g;d r u g-r e s i s t a n t m u t a t i o n;g e n o t y p e; G a n s u乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(H B V)引起的可导致肝损伤的慢性传染性疾病㊂全球约有20亿人既往*基金项目:甘肃省兰州市卫生健康指导项目(2022-Z D-20);甘肃省兰州市卫生健康行业科研项目(2023-019)㊂作者简介:丁丽,女,主任药师,主要从事肝病分子诊断相关研究㊂ә通信作者,E-m a i l:405895928@q q.c o m㊂或正在感染H B V,每年约有82万人死于H B V相关的肝衰竭㊁肝硬化和肝癌[1]㊂我国属于H B V感染高发国家,约有2000万人为携带H B V的慢性乙型肝炎患者[2]㊂核苷酸类似物(N A s)是治疗慢性乙型肝炎患者的主要药物,且不同基因型患者对N A s的治疗应答有所差异㊂相关研究报道,H B V会产生耐药突变甚至多重耐药[3],给临床治疗带来了困扰㊂因此,本文采用S a n g e r测序法就目前甘肃地区H B V感染者体内H B V基因型及耐药情况进行统计分析,为临床慢性乙型肝炎患者的个体化治疗提供数据支持㊂1资料与方法1.1一般资料纳入2018年1月至2019年8月在本院就诊的H B V感染者131例,其中男101例㊁女30例,年龄15~74岁㊁平均(45ʃ12)岁㊂所有患者均符合2015年中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学会联合修订的‘慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)“[4]中的诊断标准,同时排除甲㊁丙㊁丁㊁戊型肝炎病毒感染,排除自身免疫性肝炎㊁酒精性肝炎㊁药物性肝炎等疾病㊂本研究经医院医学伦理委员会审核通过(审批号:l z s d e r m y y y x l l w y h202308)㊂1.2仪器与试剂3500D x基因分析仪(美国A B I公司)㊁E p p e n d o r f C e n t r i f u g e5430R404A离心机㊁E p-p e n d o r f R e s e a r c h p l u s加样枪㊁L i f e t e c h n o l o g i e s2720 T h e r m a l C y c l e r P C R仪㊂H B V耐药基因突变检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)㊁H B V核酸提取试剂盒(湖南圣湘生物技术有限公司)㊁S a n P r e p 柱式P C R产物纯化试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)㊂1.3方法1.3.1 D N A的提取严格按照圣湘生物技术有限公司产品说明书进行操作,取H B V患者分离血清1 m L,采用磁珠法提取患者H B V D N A㊂1.3.2 P C R测序按照中山大学达安基因产品说明书取37L反应液㊁3L反应酶㊁10L核酸产物加入P C R反应管中,充分混匀后瞬时离心,上机运行P C R 程序;P C R扩增结束后,按照P C R产物纯化试剂盒步骤纯化获得P C R产物,鉴定后立即进行P C R测序;按照1L P C R纯化产物㊁2L B i g D y e㊁3L B i g D y e缓冲液㊁1L测序引物㊁13L灭菌纯化水的比例配制测序P C R体系,混匀后上机运行测序程序㊂1.3.3测序产物纯化各P C R反应管分别加入2L 125mm o l/L乙二胺四乙酸(E D T A)㊁2L3m o l/L醋酸钠(p H值5.2)和50L100%无水乙醇,短时振荡,室温避光放置15m i n㊂4ħ12000r/m i n离心30 m i n,去上清液,加入150L预冷70%乙醇,4ħ12000r/m i n离心10m i n,立即去上清液,室温避光放置15~30m i n;加入10L甲酰胺,短时振荡溶解D N A,短时离心后95ħ变性5m i n,迅速置冰水中冷却4m i n,取样电泳分析㊂1.3.4基因分析仪测序变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板,盖好,按加样顺序编辑样品列表㊂根据测序仪型号选用具有I V D标志的测序程序进行测序㊂1.3.5结果分析测序结束后运用美国国家生物技术信息中心网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ p r o j e c t s/g e n o t y p i n g/f o r m p a g e.c g i)及生物信息分析云平台(h t t p s://w w w.c e l l o u d.c n/#/a p p/d a s h-b o a r d/l i s t)进行测序结果的基因分型和耐药突变位点分析㊂常见耐药突变位点的信息参考‘欧洲肝病协会H B V感染临床操作指南“及试剂盒说明书㊂1.4统计学处理采用E x c e l2010软件进行统计分析,计数资料以例数或百分率表示㊂2结果2.1 H B V感染者病毒基因型及耐药情况131例乙型肝炎患者中男性占比(77.10%)显著高于女性(22.90%),40岁以上中老年患者比例(67.18%)高于青年(32.82%)㊂131例H B V感染者中产生耐药突变51例,耐药率为38.93%㊂此外,共检测出B㊁C㊁D 3种基因型别,其中C型是主要基因型㊂见表1㊂表1不同基因型突变及耐药情况基因分型n构成比(%)耐药突变例数(n)耐药率(%) B型21.53150.00C型12696.184938.89D型32.29133.33合计131100.005138.93 2.2不同基因型耐药突变模式分析51例耐药患者中检出M204I(10例)㊁M204V/I(29例)㊁M204V(10例)㊁M250V/L/I(10例)㊁S202G/I(3例)㊁T184A/G/ S/(2例)㊁A181V/T(17例)㊁N236T(11例)㊁L180M (13例)㊁V173L(2例)及I160T(1例)共11个耐药突变位点㊂其中突变频率最高的位点是M204V/I(29例),这种高频突变主要引起拉米夫定(L AM)和替比夫定(L D T)耐药;其次为A181V/T(17例),这种突变主要引起阿德福韦酯(A D V)耐药㊂此外,共检出19种耐药突变位点组合模式,其中单一位点突变17例(33.33%,17/51),双位点突变17例(33.33%,17/ 51),3位点突变12例(23.53%,12/51),4位点及以上突变5例(9.80%,5/51)㊂多位点突变以M204V/I+M204V联合突变多见,常在此基础上发生3位点㊁4位点甚至5位点突变,未检出与富马酸替诺福韦酯(T D F)耐药相关位点㊂见表2㊂㊃52㊃检验医学与临床2024年1月第21卷第1期 L a b M e d C l i n,J a n u a r y2024,V o l.21,N o.12.3 H B V感染者耐药情况突变位点分析51例耐药患者中,耐单药突变15例,突变率为29.41% (15/51);耐多药突变36例,突变率为70.59% (36/51)㊂其中与A D V相关的A181V/T㊁N236T㊁A181V/T+N236T以耐单药突变最常见,共15例(29.41%,15/51)㊂混合突变主要以L AM和L D T联合耐药为主(21.57%,11/51),在此基础上多有A D V (5.88%,3/51)㊁恩替卡韦(E T V,9.80%,5/51)以及与A D V㊁E T V联合耐药(5.88%,3/51)发生㊂此外,还有L AM和E T V联合耐药(13.72%,7/51),A D V㊁E T V联合耐药(13.73%,7/51),未检出T D F耐药株㊂见表2㊂表2 H B V感染者耐药突变情况(n)突变位点耐药情况B型C型D型合计A181V/T A D V1809 A181V/T+M250V/L/I A D V+E T V0404 A181V/T+N236T A D V0202 N236T A D V0404 N236T+M250V/L/I A D V+E T V0303 A181V/T+M204V/I A D V+L D T+L AM0101 V173L+L180M+M204V+M204V/I A D V+L AM+L D T0101 A181V/T+N236T+M204V/I A D V+L AM+L D T0101 M204V/I+M204I L D T+L AM0404 M204V/I+M204V L D T+L AM0303 M204V/I L D T+L AM0404 L180M+M204V/I+S202G/I E T V+L AM0101 L180M+M204V/I+M204V E T V+L AM0505 S202G/I+L180M+M250V/L/I+M204V+M204V/I E T V+L AM0101 L180M+M204V/I+M204I E T V+L AM+L D T0213 I160T+L180M+M250V/L/I+M204V/I E T V+L AM+L D T0101 V173L+L180M+M204I+M204V/I E T V+L AM+L D T0101 T184A/G/S/I/L/F+M204I+M204V/I A D V+E T V+L AM+L D T0202 N236T+M250V/L/I+M204I+M204V/I A D V+E T V+L AM+L D T01013讨论H B V是严重危害人类健康的肝炎病毒之一, N A s能有效抑制H B V D N A复制,缓解病情,但H B V在慢性持续感染中可产生自然变异,也会因药物治疗产生诱导变异,从而导致其对抗病毒药物敏感性降低,难以根除病毒,患者病情反复发作,给临床治疗带来了极大的困扰[5-6]㊂本研究对甘肃地区H B V 基因分型特征及耐药突变模式进行分析,对指导临床用药具有一定意义㊂目前,将H B V分为9个基因型(A~I),另有报道J型H B V[7]㊂H B V不同基因型呈现不同的地区分布特点,B型和C型是我国最常见的H B V基因型,约占我国乙型肝炎患者的95%[8]㊂其中北方以C型多见,南方以B型为主,各省间分布不完全相同[9]㊂本研究对甘肃地区131例H B V感染者进行H B V基因型分析,结果显示,共检出B㊁C㊁D3种基因型,C型为主要基因型,这与既往研究结果一致[10]㊂临床常用的N A s有L AM㊁L D T㊁A D V㊁E T V㊁T D F这5种[11]㊂本研究131例患者中共检出51例耐药突变,耐药率达38.93%,耐药形势严峻,且多发生联合耐药㊂混合突变以M204V/I/㊁L180M㊁M204V位点及其组合形式突变例数较多,这3种位点突变导致L AM及L D T耐药㊂L AM与L D T是我国较早上市的核苷酸类药物,虽有一定的抗病毒疗效,但耐药屏障低,长时间服用易导致患者产生耐药性[12]㊂单药耐药以A181V/T㊁N236T及其组合形式突变导致的A D V耐药最为常见,耐药率为29.41%㊂部分患者在L AM㊁L D T及A D V耐药基础上发生M250V/I㊁T184A/G/S/I㊁V173L㊁S202G/I位点突变导致E T V耐药且耐药率高,这提示本地区患者仍大量使用耐药屏障低的N A s作为初治药物,会导致E T V类耐药屏障高的药物耐药,应减少L AM㊁A D V㊁L D T等耐药屏障低的药物的使用,首选强效耐药屏障高的药物[13]㊂有研究显示80%患者在使用L AM㊁㊃62㊃检验医学与临床2024年1月第21卷第1期 L a b M e d C l i n,J a n u a r y2024,V o l.21,N o.1A D V等耐药屏障低的药物作为初治药物是导致我国HB V耐药率居高不下的重要因素之一[14-15]㊂T D F耐药在临床中少见,这提示T D F在本地乙型肝炎治疗中具有广泛应用前景㊂慢性乙型肝炎患者需长期服药,停药后复阳率高[16-17]㊂但由于经济条件差及随访制度不健全等因素,我国慢性乙型肝炎患者坚持长期服药的依从性并不高㊂有研究显示,依从性差是导致慢性乙型肝炎抗病毒初级治疗失败的主要原因[18-20]㊂患者自行停药不仅起不到治疗作用,还可能加速H B V耐药的发生,甚至使病毒复制增多,导致病情加重㊂一旦发生耐药,患者须加大药物剂量或者换药,从而进一步增加治疗成本㊂随着N A s纳入医保及强效低耐药屏障药物的应用,患者的依从性及耐药情况都有所改善㊂综上所述,本研究通过对甘肃地区H B V患者进行基因分型及耐药突变位点的检测分析,为制订患者个体化精准治疗方案提供了一定科学依据,在用药过程中临床需加强对患者的监测与管理,以免发生多重耐药㊂参考文献[1]W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n.G l o b a l p r o g r e s s r e p o r t o nH I V,v i r a l h e p a t i i s a n d s e x u a l l y t r a n s m i t t e d i n f e c t i o n s,2021.A c c o u n t a b i l i t y f o r t h e g l o b a l h e a l t h s e c t o r s t r a t e-g i e s2016-2021:a c t i o n s f o r i m p a c t[E B/O L].[2023-01-05].h t t p s://a p p s.w h o.i n t/i r i s/h i t s t r e a m/h a n d l e/10665/342808/9789240030985-e n g.p d f.[2]L I U J,L I A N G W,J I N 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