ClonExpress_MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法
PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号：大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR 产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。
有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。
无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。
技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。
PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。
如下图：适用范围：1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点：1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接；2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物；3. 混合温育30分钟即可转化，节约时间和精力；4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸；5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好；6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。
ClonExpress One Step Cloning一步法定向克隆无缝克隆讲座
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform 3.5 hr over all
Vector with Multi Insertions Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
BamHI (1794) SalI (596) SalI (355) Eco RI (16) Xho I (347) Xho I (1424) SalI (1473) SalI (1965) SalI (2220) Xho I (2381)
ORF
ORF
2514 bp
Poor sites for digestion: buffer choice Poor sites for ligation: blunt-sticky ends ligation
First and most important thing: Select you cloning site GC content/repeat sequence 40-60%/try to avoid
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
综述：无缝克隆与基因融合(中文版)
无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
stratagene品牌的点突变试剂盒的Protocol
Hieff Clone TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp 片段。
将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。
将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。
克隆阳性率可达95%以上。
克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。
产品-20 ºC保存。
实验流程实验流程概览1)线性化克隆载体制备；2)插入片段扩增引物设计；3)插入片段PCR扩增；4)进行重组反应；5)反应产物转化、涂板；6)克隆鉴定。
图一实验流程概览注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
1.制备线性化克隆载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。
推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。
当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
无缝克隆——让载体构建更简单
让载体构建更easy，分子克隆其实可以ze么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2、可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4、体系反应时间仅需20min，快速反应。
那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。
唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
图1：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式1）质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
2）质粒PCR法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。
图2.PCR法线性化载体示意图。
在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段2、PCR获取目的片段。
设计的引物５’端需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段）；图3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。
ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书
Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产 物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物 5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化 克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30 min即可进行 转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM II是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组 酶ExnaseTM II。和上一代产品相比，ExnaseTM II中添加了独特的重组增强因子。一方面，这 种增强因子可以显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实 现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)。另一方面，ExnaseTM II还兼容常规酶切、PCR反应体系。 克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆 ，极大的简化了实验步骤。 产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行定向克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可高效克隆50 bp～10 kb片段 -不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆 应用范围 -快速克隆 -高通量克隆 -无缝克隆 -DNA定点突变
新克隆技术不用酶切位点,直接克隆
Sean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. Nucleic Acids Res., May 2010; 38: 2624 - 2636.
•
In-Fusion®应用实例---插入突变
策略一
将human TIM-4 (hTIM-4)第45位的色氨酸（W或Trp）突变为丙氨 酸（A或Ala），构建hTIM-4 W45A 突变体。
引物设计并扩增目的片段206-bp 和509-bp
5′ Sense Primer (Overlap with Vector Underlined, SpeI Site Bold) 5′-GCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTG-3′ Antisense Mutant Primer (Mutation Underlined) 206-bp PCR Product 5′-GAAGCGGATGAGTACAGACAGGGCAAAGTC-3′ Sense Mutant Primer (Mutation Underlined) 5′-TGTACTCATCCGCTTCTCACAACAGCAACAGC-3′ 3′ Antisense Primer (BspEI Site Bold) 509-bp PCR product 5′-TGTGGCTTCCTCCGGAAGGGTGCTTGGGGTTA-3′
20 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
•
In-Fusion®应用实例---多片段克隆
多片段连接---构建真正无缝融合蛋白
将白细胞介素2 (IL-2)分泌信号序列与CD101胞外域序列（删除内源性 信号序列）和鼠免疫球蛋白 G3 (IgG3)的可结晶片段进行融合，构建无缝融 合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并将其转染COS细胞检测表达情况。
ClonExpress_MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 线性化克隆载体制备 选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物 退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
05/ 06
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不 是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需 纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都 会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量 的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方 式可查阅表二。
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左 右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式 注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活， 以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
载体构建简介
载体构建SOP载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。
主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。
载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
原核重组表达常用载体构建策略有多种选择，（1）常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术，主要优点是技术稳定，缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败，如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点；（2）同源重组是目前流行的克隆技术。
同源重组（Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，将目的片段和线性载体按照一定比例混合后，在重组酶的作用下即可发生重组，本实验室常用37℃的温度，30min反应即可完成。
一、目的载体进行双酶切（一）实验准备1.实验材料：质检合格的目的载体。
2.试剂与耗材：buffer，ddH2O，琼脂糖（Spain，9012-36-6）、TBE缓冲液、PCR 管（国产，81245）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen，AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。
3.仪器与设备：PCR仪（杭州博日，TC-96/G/H（b）A）、mini离心机（其林贝尔，LX600）、电泳槽（北京君意，JY-SPCT）、凝胶成像仪（Bio-rad，GelDoc/ChemiDocuniversal hood II）、分光光度计（天根，OSE-260-01）。
ClonExpress
使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。
基因克隆实验手册
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
T T
限制性内切酶/连接
Bam H Ⅰ
5’ GATC
纯化回收（参考第10页）。
↓ ⑥回收液作为插入DNA片段溶液［A］。
2. 准备载体质粒
①使用限制性内切酶在目的载体质粒（环状）的克隆位点进行酶切反应 【载体的线性化】
载体质粒DNA Hin d Ⅲ Bam H Ⅰ 10 × K Buffer 灭菌水
(≤1 μg) 1 μl 1 μl 2 μl
up to 20 μl(轻弹混合)
10,000 U 10,000 U
1.25 U
灭菌水
up to 50 μl (轻弹混合)
94℃ 1 min. ↓ 98℃ 10 sec. 60℃ 15 sec. 68℃ 30 sec./kb
30 cycles
↓
②PCR扩增产物的纯化 使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0等 进行PCR扩增产物的纯化（参考第10页）。
利用市面上销售的3’末端附加有 dT的载体。
In-Fusion克隆
利用在引物末端附加与载体末端相同的15个碱基 序列进行目的基因的扩增。
可使用任意载体。仅需限制性内切 酶处理或PCR扩增使载体线性化。
■ 根据使用目的推荐的克隆用试剂盒
实验目的
In-Fusion克隆技术介绍
反应液 直接转化
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
引物设计原则
引物设计网络工具
在线支持工具
/infusion
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
简便、快速、高效的克隆技术
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
不附பைடு நூலகம்任何多余序列
A
克隆位点
In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。 In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。
In-Fusion®克隆技术的应用
多片段克隆 插入突变位点
应用
构建载体模型 高通量克隆
应用实例
实例：多个DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同时克隆
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
Step 2: 目的DNA片段扩增 重组载体 Step 3: 一次In-Fusion连接反应
克服传统克隆技术的限制
克服其它克隆技术的限制
其它克隆技术的限制
•载体的限制 •不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体 •必须使用提供的载体
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。
二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix20 tests 200 μlPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 μlPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 μl储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0 pmols。
HiFi 一步法无缝克隆试剂盒说明书
HiFi一步法无缝克隆试剂盒货号：T1690规格：20T/100T保存：-20℃，1年产品说明：本产品为升级版的无缝克隆连接反应试剂盒，专门为提高克隆效率及克隆准确性而设计。
其采用优化的酶组合体系，专门针对多片段无缝组装反应进行了优化，不引入额外的碱基序列，可快速高效实现1至5个插入片段的定向组装克隆，不受载体平末端/粘性末端的限制和插入片段酶切位点的影响。
高度优化的反应缓冲体系和增强的酶混合物，可显著提高片段无缝组装的效率和对杂质的耐受度，极大地提高了无缝组装的效率。
试剂盒中配备了M13Forward和Reserve通用型引物，可用于含有M13引物位点载体的测序和鉴定，以及检测阳性对照组的阳性率。
本产品适用于包含16-25 bp末端重叠序列的片段与载体间的快速、定向、无缝克隆。
工作原理：产品组份：组分20T50T 2×HiFi OneStep Assembly Cloning Mix100µL100µL x5Linearized Control Vector（3kb40ng/µL）5µL5µLControl Insert1（800bp20ng/µL）5µL5µLControl Insert2（1500bp40ng/µL）5µL5µLM13Forward Primer（10µM）20µL100µLM13Reserve Primer（10µM）20µL100µL使用方法：1.线性化载体的制备选择合适的克隆位点：尽量选择无重复序列且GC含量适中的区域进行克隆。
载体的克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40-60%之间时组装效率最大。
1）酶切制备线性化载体：单酶切或双酶切所得线性载体，平末端或粘末端，酶切胶回收线性化载体。
一步法无缝克隆试剂盒适用单片段
版本号:2018-03-20
一步法无缝克隆试剂盒（适用单片段）
SE 2×Seamless Cloning Mix
(目录号：ZC231)
·快速
·简单
·高效
·无缝
·定向
一步法无缝克隆试剂盒（适用单片段）
■ 产品组成
试剂盒组成 SE 2×Seamless Cloning Mix 保存：-20℃至少保存1年。
■ 操作步骤
A. 载体制备--线性化处理 1. 酶切法： 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，但是单酶切容易导致载体自 连，载体线性化不彻底容易导致假阳性的产生。为了降低自连背景，提高阳性率，建议 采用双酶切，而且对酶切后的载体进行割胶纯化。 注： 一步法无缝克隆反应体系内无双链DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因 此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化 后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。 我们推荐酶切后胶回收可以把这种未线性化载体比例降低到最低程度。 2. PCR法 选取合适的位点，设计正向和反向引物，建议采用高保真的DNA聚合酶 扩增。 注：以质粒为模板的PCR来源线性载体（PCR产物）纯化前用Dpn I内切酶消化质 粒模板，可以降低背景，提高阳性率。但是一般情况下，经过胶回收已经足以把这种未 线性化载体比例降低到最低，因此PCR来源的线性化载体我R仪中放置30分钟，然后转移到冰上。 3. 立即进行感受态细胞转化实验，剩余反应液可保存在-20 ℃待用。 注意事项： *本试剂盒连接效率较低，为了得到更多的克隆数，感受态转化效率需＞108 Cfu/ug DNA,如果效率不够会影响实验效果。 *大片段载体和基因，可以提高载体和目的片段的量。 本试剂盒不适用多片段连接。
CloneSelect Imager, ClonePix2细胞筛选系统和QPix微生物克隆挑选
７天追踪克隆生长－聚集每个成像时间点叠加成像
系统参数
成像 软件 白光成像 数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 源板类型 源板载量 仪器尺寸 仪器重量 整合性 监管部门获批
3% Day 1 5% Day 2 15% Day 3 55% Day 7
ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ 专用成像软件预装在高性能ＰＣ上，Ｗｉｎ ７操作系统 透射光 １个内部的条形码阅读器可以追踪每个板数据 整合１６位冷ＣＣＤ相机 ９６孔板：２．５分钟 标准：３．６微米；最大：１．８微米
９６孔板或者３８４孔板 １块 ７２０ｍｍ（宽）×４５８ｍｍ（高）×５７０ｍｍ（深） ５５ｋｇ ＯＥＭ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ａｖａｉｌａｂｌｅ
ＣＥ标志
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ＱＰｉｘ微生物筛选系统
ＱＰｉｘ系列微生物筛选系统可自动挑选特异性微生物，具有运行速度快、精度高、性能稳定等优点，是微生物筛选的理 想工具。作为自动化微生物筛选产品的鼻祖，Ｇｅｎｅｔｉｘ发展出多项独特的技术和工具，并据此设计了一系列适合不同通 量以及实验应用要求的筛选系统，包括：
具有特定细胞表面标记的细胞 根据细胞内报告基因的表达筛选克隆（ｅ．ｇ． ＧＦＰ） 昆虫杆状病毒筛选，杆状病毒蛋白表达系统，自动挑取琼脂糖培养基上形成的病毒斑
ＣｌｏｎｅＰｉｘ系统
选择多孔板
条形码 可追踪 克隆
机械挑选臂可精确、 轻轻挑取和转移克隆
堆板器可操作 １￣６－孔培养 板和９６孔转
移板
自动化 移去和 替代板盖
04
工作站 可清洗 和消毒
系统参数
成像 软件
白光成像
荧光成像
数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 污染 源板类型 终板类型 源板载量 终板载量 挑取头 挑取针大小 挑取速度 洗浴 挑取系统液流 针头干燥 仪器尺寸 仪器重量 压缩机 压缩元件 尺寸 重量 最小运作压力 最小操作体积 监管部门获批
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Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和 线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端 序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应 30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM MultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重 组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTM MultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多 至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTM MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体 系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于 重组克隆，极大的简化了实验步骤。 产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆 应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物 退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
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PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不 是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需 纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都 会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量 的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方 式可查阅表二。
图三：第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温 度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
最后设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正反向扩增引物。设计方式与第一片段的 反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。具体方案参见图三。 ４．４ 插入片段ＰＣＲ扩增 插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组 过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增 (PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501)，以减少扩增突变的引入。
TM
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 线性化克隆载体制备 选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左 右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式 注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活， 以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
线性化载体制备方式 酶切消化制备
模板类型 环状质粒
快速实验方案 加热失活内切酶后 直接使用 DpnI 消化后直接使用 (降解扩增模板) 直接使用
最佳实验方案 胶回收 胶回收或DpnI 消化后 胶回收 胶回收
图一：使用ClonExpress MultiS进行多片段拼接克隆实验流程 用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得， 也可由反向PCR扩增环状载体获得 (图，上左)。插入片段由PCR扩增制备。所用扩增引物在设 计时需在其5’端添加同源重组序列 (图中以深蓝色、深灰色、浅蓝色和红色标记)。使用这些引 物分别扩增插入片段，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源 重组的一致序列 (图，上右)。以线性化克隆载体和插入片段扩增产物配制重组反应体系，37℃ 反应30 min即可完成重组反应，实现多片段顺序拼接并克隆至目标载体 (图，中)。重组产物直 接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选 (图，下)。
PCR扩增情况
PCR模板类型 与克隆载体抗性相同 的环状质粒 预线性化质粒、 基因组、cDNA
快速实验方案 DpnI 消化后直接使用* 直接使用 胶回收
最佳实验方案 胶回收或DpnI 消化后胶回收 胶回收
或者涡旋混匀)。置于37℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
４／实验方案
４．１ 实验流程概览（图一） 1).线性化克隆载体制备 (参见4.2)； 2).插入片段扩增引物设计 (参见4.3)； 3).插入片段PCR扩增 (参见4.4)； 4).进行重组反应 (参见4.5)； 5).反应产物转化、涂板 (参见4.6)； 6).克隆鉴定 (参见4.7)。 B
ClonExpressTM MultiS 重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产 物加热失活内切酶 (参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活) 后可直接用于重组反应。 线性化克隆载体由反向PCR扩增制备 我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线 性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。 CloneExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预 线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。 克隆载体酶切产物或 PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接 使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提 高 DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体) 。不 同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
ClonExpressTM MultiS试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要时可进行阳性对照 反应，每次反应各加1 μl。 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡
40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。 克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。 A 线性化克隆载体由酶切制备
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首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插 入片段)，如图二所示
其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的 同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物 中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 (第一片段)的反向扩增 引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：
产品概要 产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例 注意事项 常见问题与解决方案
-DNA定点突变
２／产品组成
组 分
5 × CE MultiS Buffer ExnaseTM MultiS pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)
ClonExpressTM MultiS
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335 销售/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
注意: 1. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围 时，直接选择最低/最高使用量即可。 2. 插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用 10 ng即可。 3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体 积的1/5，即4 μl。