流式细胞术：样本处理与存储-李奈林
流式细胞术课件
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞术的组织样本，你会处理吗？
流式细胞术的组织样本，你会处理吗？前⾔常常听到流式操作的⽼师说，你细胞数量太少⽆法获取有效数据，或者细胞聚团导致管路堵塞等问题。
本来就好不容易排到队去分析样本，还会被后⾯同学各种嫌弃，1min实验有时候10min都没做出来！细胞数⽬的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠⼜会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，常常是我们做流式的⼀⼤通病。
特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。
本期就看看如何从不同组织中分离出优质样本。
组织样本的单细胞制备与贴壁或者悬浮细胞相⽐，组织样本的单细胞制备相对有⼀定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地⽅，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎⽚太多等。
下⾯就具体看看组织中的细胞如何制备。
⽬前，最常⽤两种⽅法是物理法和酶解消化法。
组织样本的处理⽅法⼀、物理⽅法：原理：是指利⽤物理⽅法（机械法）分散组织，经过滤⽹过滤获得单细胞悬液。
应⽤：常⽤于处理部分软组织例如⾻髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴⾁瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及⼀些软组织⾁瘤等，⽤单纯的机械法就可以获得⼤量⾼质量的单分散细胞。
优势：操作⽅便，耗时短，且能获得⼤量的细胞。
缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎⽚和细胞团块，所以常与其他⽅法配合使⽤；对硬组织或纤维组织效果不好。
⼆、酶解消化法：原理：利⽤酶（主要是胶原酶和蛋⽩酶）破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、⽔解组织细胞的紧密连接结构的蛋⽩质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的⽅法。
应⽤：既可⽤于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上⽪、肝、肾等或含有⼤量结缔组织的肿瘤----⾷管癌、乳腺癌、⽪肤癌等。
优势：适⽤于⼤部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间⼤。
缺点：操作步骤⽐较繁琐，消化时间⽐较长且难控制。
不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。
下⾯具体介绍这2种⽅式的操作步骤：⼀物理⽅法1. 吹打：⽤移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的⽅法。
流式细胞术的操作、原理与应用
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
1
5
50
104
1.7 min
20 s
2s
105
16.8 min 3.4 min
20 s
106
2.8 h
3.4 min
3.4 min
107
1.2 天
5.6 h
34 min
分选时间表(机器流速10000个/s时)
分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。
分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达 99%以上。
光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3,
FL4)。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分 析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) log)
电子系统
光电转换器 数据处理系统
细胞分选系统
喷嘴 电偏转板 样本收集器
1.3.1 液流系统
鞘流技术：根据层流原理 发展起来的技术，可以实 现两种液体的同轴流动， 样本细胞流位于轴心稳定 流动，外面包裹有鞘液 (sheath)。
流体动力学聚焦：稳定的 液流从截面积较大的部分 流入截面积较小的部分后， 有一个聚焦收缩作用，细 胞流直径被约束在1020um，避免了多个细胞重 叠进入检测区。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞术详解
流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D 公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
实用流式细胞技术及其样品处理
FACSAria (FACSDiva)
流式细胞术基本原理 在不同领域的应用 样品及其前处理
一、 流式细胞术基本原理
Orange
Time
SSC
Green
Time
FSC Data Processor
FSC SSC
Time Green
Time
Orange Time Red
5、CTL功能分析
评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡， CTL介导的裂解功能的抑制。
proteolytic cleavage sites for individual caspases fluorophore 18-amino-acid peptides
细胞分选
分选纯度
分选产率
厂家、型号、激光器、滤光片、软件
Becton Dickinson (Maxwell W. Becton and Fairleigh S. Dickinson BD)： FACS
“Fluorescence Activated Cell Sorter”
FACS I,II,III,IV,400,420,440,FACStar,Vantage, DiVa, Aria : Sorters. FACS Analyser, can, Calibur* , LSR, Canto: ‘Benchtop’.
（二）细胞功能分析
细胞活性分析
细胞膜电位
线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6
细胞内Ca2+
胞浆内pH
活性氧（ROS）
1、细胞活性分析
根据对细胞膜的渗透性不 同来区分活/死/凋亡细胞： PI，EB，7-AAD and Hoechst 33342
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。
流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。
一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。
流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。
3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。
4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。
二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。
2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。
3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。
4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。
5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。
流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞术基本原理及应用
流式细胞术基本原理及应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学和临床医学研究的技术，能够快速、高效地分析和计数细胞，同时可以对细胞进行多参数的定位、鉴定和分离。
该技术的原理是通过激光束激发细胞中的荧光染料或标记物，然后检测细胞散射光的强度和荧光信号的强度，进而对细胞进行分析和排序。
本文将介绍流式细胞术的基本原理及其应用。
样本制备是流式细胞术的第一步，通过样本的处理来获取以细胞为基础的单细胞悬浮液。
这个过程可以通过机械或酶的方法破碎组织以获得细胞，并使用缓冲液来稀释细胞以避免细胞团。
通常，通过过滤或离心的方法，除去细胞碎片和大颗粒物质。
然后，用缓冲液沉淀细胞并冲洗细胞以去除细胞外的成分。
细胞悬浮是将细胞从红细胞和组织碎片中剥离并悬浮在缓冲液中的过程。
一种常用的方法是将细胞悬浮在含有胎牛血清等蛋白质的培养基中，以保持细胞的活力和稳定性。
细胞检测是流式细胞术的核心步骤，通过激光光束照射细胞，然后测量散射光和荧光信号来分析细胞的性状。
散射光包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。
FSC反映了细胞的大小和形态，SSC反映了细胞的复杂性和颗粒含量。
荧光信号是通过用具有荧光标记分子（如抗体或染料）标记细胞，然后用激光激发标记物并测量其荧光强度来检测的。
可以使用多个激光器和相应的滤光片来激发和检测多个荧光染料，从而实现多参数的分析。
数据分析是流式细胞术的最后一步，通过计算机软件对测量到的数据进行处理和解读。
数据分析可以根据散射光和荧光信号的特征，将细胞分类和鉴定。
可以根据亮度、大小和形状等参数来区分细胞的不同类型或亚群。
1.免疫细胞学研究：通过荧光标记的抗体，流式细胞术可以用来鉴定和分析细胞表面分子的表达情况和细胞亚群的分布。
例如，用荧光标记的CD4和CD8抗体可以区分T细胞亚群，并研究它们在疾病发展中的作用。
2.细胞周期分析：流式细胞术可以通过荧光染料标记DNA，从而实现对细胞周期的分析。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
操作步骤包括细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测。
流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。
流式细胞仪由液流系统、光学系统和电子系统三部分形成。
流式细胞技术基本原则：1.并使各种液体和漂浮细胞样本新鲜，尽快顺利完成样本制取和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或edta处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤非政府可以采用或单胺酶消化法，机械收编法和化学集中法去赢得足够多数量的单细胞悬液；4.对石蜡上皮组织非政府应先切开若干40-50um薄的蜡片，经二甲苯重熔至水后，再用前述方法制取单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不该多于个。
流式细胞的具体实验步骤基本是细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测两部分。
一、细胞表面标记的检测1.试剂平衡至室温。
准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写编号纸并编号；3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。
加血前摇匀血样；4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟；5.离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；6.加入pbs洗液2ml，震荡，离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；7.加入pbs l。
上机前4度保存；8.上机。
二、细胞内细胞因子的检测1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写下编号纸并编号；3.取出pma（1∶），bfa（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠pbs稀释储存液；4.提振：挑全血或pbmcs（细胞数在0.5-1 ）50l/管，再重新加入50l rpmi展开吸收一倍，重新加入刺激剂pma，离子霉素和bfa，搅匀。
流式样本检测命名及保存说明
流式样本检测命名及保存说明1.流式样本检测命名一般按照：ID1 + ID2 + ID3项目名称+条形码号+荧光抗体造血干细胞单管检测CD34CD45，命名一般按照：ID1 + ID2 + ID3项目名称+条形码号+检测时间2.具体项目命名如下：(1)外周血免疫细胞治疗AIL：AIL+ASI000000+荧光抗体LMD文件存放于LMD>AIL(2)脐血免疫细胞治疗QX-CIK：QX-CIK+ASA000000+荧光抗体LMD文件存放于LMD>QX-CIK(3)脐带间充质干细胞MSC：MSC+ASU000000+荧光抗体LMD文件存放于LMD>MSC(4)胎盘间充质干细胞：MSC+ASSP000000+荧光抗体LMD文件存放于LMD>MSC(5)脐血单个核CB-MNC：CB-MNC+ASA000000+检测时间LMD文件存放于LMD> CB-MNCPDF文件存放于PDF>CD34CD45ASA(6)脐血干细胞冻存：CD34+ASZ000000+检测时间LMD文件存放于LMD> CD34ASZPDF文件存放于PDF>CD34CD45ASZ(7)外周血干细胞冻存：CD34+ASH000000+检测时间LMD文件存放于LMD> CD34ASHPDF文件存放于PDF>CD34CD45ASH外周血干细胞出库：CD34+ASH000000（+袋次）+检测时间LMD文件存放于LMD> CD34ASH>出库PDF文件存放于PDF>CD34CD45ASH>出库(8)胎盘造血干细胞冻存：CD34+ASZP000000+检测时间LMD文件存放于LMD> CD34ASZPPDF文件存放于PDF>CD34CD45ASZP备注：检测结束后，请及时将LMD文件及PDF文件存放于相应的文件（定位到月份）。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合二、凋亡1．凋亡的检测方法：2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞,又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价.第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题.在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响.目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种.（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类-—胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等,都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
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固体组织的酶消化性解聚
• 基本程序:
新鮮组织 → 酶 切 组织消化 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 → 洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
培养细胞的细胞悬液制备 (I)
• 钙螯合法
• 过程: 5 mM EDTA, > 30 min • 优点: 细胞表面抗原保存好 • 缺点: 耗时, 低细胞回收率 低细胞回收率 , 减低存活率 减低存活率
27
28
样本染色 (VII) –– 孵育温度
• 低温孵育引起体外假象的可能性较小
样本孵育温度对白细胞CD11b测定的影响
10.0 4°C 15°C *
Leukocyte CD11b MFI
7.5
22°C 37°C ++
• 体温 (37°C) 孵育适于观察细胞体外反应性
5.0
2.5
++
• 最适孵育温度需根据具体检测项目而定
5
• 酶切消化法
• 过程: trypsin/EDTA (0.02-0.1%/5 mM), 1– 1–10 min • 优点: 快速, 高细胞回收率 高细胞回收率 , 高存活率 高存活率 • 缺点: 可能显著改变 细胞表面抗原表达 可能显著改变细胞表面抗原表达
6
1
胰蛋白酶消化可能显著改变培养细胞的 表面抗原表达
流式细胞术样本处理的主要任务与目标
流式细胞术: 样本处理与存储
Flow Cytometry: Sample Preparation and Storage
• 样本对流式细胞仪的可视化
Visualize the sample to cytometer • 单细胞悬液 Single cell suspension
1.0 0.5 0.0 2.0
Unstimulated
0.5 0.0 2.0
Monocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
Lymphocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
0
1
3
6 12 24
0
1
3
6 12 24
Halldén G, et al. Ann Allerg Asthma Immunol 1999; 83: 413-421. 14
20
免疫萤光标记先于胰蛋白酶消化可能 改善细胞表面抗原保存
800
EC VCAM-1 Expression (arbitrary unit)
600
15
ICAM-1 Expression (arbitrary unit)
400
10
200
5
0 0
EDTA
Trypsin/EDTA
Corver WE, et al. Cytometry 1995; 19: 267-272.
2.5
染色前的样本储存 Pre-sample handling storage
原则: 原则:
越短越好 保存温度: 4°C或室温 合适的保存方式取决于细胞种类, 合适的保存方式取决于细胞种类, 分析类型和样 本处理方法 粒细胞功能, 血小板功能, 髓系细胞的免疫表型, 细胞周期分析
Leukocyte CD11b MFI
17 18
• 溶血分离法
• 最常用, 染后溶血 >> 溶血后染色 • 优点: 经济; 高细胞回收率 高细胞回收率 • 缺点: 亦 易导致制样假象
3
细胞分离过程对单核细胞CD11b测定的影响
样本制备过程应避免温度的反复升降
Lundahl J, et al. J Immunol Methods 1995; 180: 1993-100.
白细胞的分离 (I)
• 密度梯度分离法
• 较少用 • 优点: 细胞亚群纯化; 去除死细胞 • 缺点: 耗时; 低细胞回收率 低细胞回收率 , 易导致制样假象
白细胞的分离 (II)
• 荧光抗体或DNA染料的识别染色法 • 应用不断增多 • 优点: 样本处理简单, 样本处理简单, 制样假象少, 制样假象少, 选择性强而灵活 • 缺点: 相对贵一些 • 抗体包被的磁珠分选法 • 应用不断增多 • 优点: 快捷, 快捷, 选择性强 • 缺点: 昂 贵
• 优化和标准化样本制备程序
Optimize and standize sample handling precedures
2
固体组织的机械解聚 固体组织和培养细胞的细胞悬液制备
Cell suspension preparation from solid tissues and cultured cells
7
染色 ↓ 解脫
解脫 ↓ 染色
8
Gräbner R, et al. Cytometry 2000; 40: 238-244.
培养细胞的细胞悬液制备 (II)
• 机械刮脫
• 过程: 机械推刮 • 优点: 简单快速 简单快速, 细胞表面抗原表达保存好 • 缺点: 可能导至细胞机械损伤 可能导至细胞机械损伤
• ≤ 72 h:
淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
12
2
白细胞CD11b表达和反应性在24小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0 2.0
嗜酸性粒细胞CD69表达在24小时 存储(4°C)中的动态变化
Leukocytes
1.5
Neutrophils
1.5 1.0
fMLP 0.1 µM
Leukocyte CD11b MFI
样本染色 (V) –– 萤光素的选择
• 荧光素的明亮度
• phycoerytherin (PE) > PE-Cy5 > PE-Texas Red (E (ECD ) > allophycocyanin (APC) > fluorescein isothiocyanate (FITC)
样本染色 (VI) –– 洗涤还是不洗涤
• 细胞膜通透化的方法需逐个评估
22
白细胞胞膜通透化对光散射特性的影响
Control 0.1% Triton 0.8% OG
样本染色 (III) –– 抗体选择 1
• 抗体特异性 • IgG 作为首选 • 选择明亮萤光素标记的抗体检测密度低的抗原 • 细胞内染色IgG较好, 尤其是细胞核内抗原 • 同型阴性对照抗体的萤光素/蛋白质比例 (F/P ratio) 应与阳性染色抗体的相近
血液抗凝剂:
• 枸橼酸钠: 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试,
DNA分析
• 肝素: • EDTA: • 水蛭素:
细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试, DNA分析
10
9
血液抗凝剂对白细胞 CD11b 流式细胞术检测的影响
Fc受体阻断对目标抗原染色的作用
FITC-CD3染色15 min
鼠IgG孵育10 min + FITC-CD3染色15 min
• 次级抗体需采用F(ab) 或F(ab’)2片段
25 26 Stewart CC & Stewart SJ. Methods Cell Biol 2001; 63: 217-251.
CD11b Expression MFI
1.5
• 应用: 应用: 细胞分型, DNA分析
1.0
Unfixed
0.5
• 冰冻保存
• 应用: DNA分析, 细胞分型
15
0.5% formaldehyde fixed
0.0
0
1
3
6
12
24
48
16
Time (hour)
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
李奈林
瑞典 斯德哥尔摩 卡罗林斯卡医学院/大学医院 内科系 临床药理科 杭州 浙江大学医学院 病理学与病理生理学教研室
1
• 荧光标记 Fluorescent labelling
• 防止或减低样本制备引起的假象
Prevent or minimize artefacts during sample handling
8
Unfixed
Unstimulated
6
0.2% F 0.5% F 1.0% F
Leukocyte CD11b MFI
• 固定剂的类别
• 非凝固性固定剂 非凝固性固定剂 • 多聚甲醛 Paraformaldehyde: 0.5-4% in PBS • 甲醛 Formaldehyde: 0.2-1% in saline or PBS • 戊二醛 Glutaraldehyde: 少用 • 凝固性固定剂 凝固性固定剂 • 乙 醇 Ethanol: 少用 • 甲醇 Methanol: 少用 • 丙酮 Acetone: 少用
4
1.0% PF 2.0% PF
2
0 8
0.1 µM fMLP
6
4
2
• 样本固定方法需具体评估
0
31
0
1
3(log hour) 6 12 Time
24
48
32
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
结语
• 流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准。 There is NOT a golden protocol for flow cytometric sample preparation that suits every application.
0.0
* * ++ ++
Unstimulated
29
0.1 µM fMLP