流式细胞术：样本处理与存储-李奈林
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27
28ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
样本染色 (VII) –– 孵育温度
• 低温孵育引起体外假象的可能性较小
样本孵育温度对白细胞CD11b测定的影响
10.0 4°C 15°C *
Leukocyte CD11b MFI
7.5
22°C 37°C ++
• 体温 (37°C) 孵育适于观察细胞体外反应性
5.0
2.5
++
• 最适孵育温度需根据具体检测项目而定
4
1.0% PF 2.0% PF
2
0 8
0.1 µM fMLP
6
4
2
• 样本固定方法需具体评估
0
31
0
1
3(log hour) 6 12 Time
24
48
32
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
结语
• 流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准。 There is NOT a golden protocol for flow cytometric sample preparation that suits every application.
血液抗凝剂:
• 枸橼酸钠: 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试,
DNA分析
• 肝素: • EDTA: • 水蛭素:
细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试, DNA分析
10
9
血液抗凝剂对白细胞 CD11b 流式细胞术检测的影响
1.0 0.5 0.0 2.0
Unstimulated
0.5 0.0 2.0
Monocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
Lymphocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
0
1
3
6 12 24
0
1
3
6 12 24
Halldén G, et al. Ann Allerg Asthma Immunol 1999; 83: 413-421. 14
0.0
* * ++ ++
Unstimulated
29
0.1 µM fMLP
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65. 30
5
样本固定
• 样本固定（染色前或染色后）提高样本稳定性和/ 或终止细胞反应
样本的固定与稳定性: 白细胞CD11b表达在48小时内的动态变化
17 18
• 溶血分离法
• 最常用, 染后溶血 >> 溶血后染色 • 优点: 经济; 高细胞回收率 高细胞回收率 • 缺点: 亦 易导致制样假象
3
细胞分离过程对单核细胞CD11b测定的影响
样本制备过程应避免温度的反复升降
Lundahl J, et al. J Immunol Methods 1995; 180: 1993-100.
白细胞的分离 (I)
• 密度梯度分离法
• 较少用 • 优点: 细胞亚群纯化; 去除死细胞 • 缺点: 耗时; 低细胞回收率 低细胞回收率 , 易导致制样假象
白细胞的分离 (II)
• 荧光抗体或DNA染料的识别染色法 • 应用不断增多 • 优点: 样本处理简单, 样本处理简单, 制样假象少, 制样假象少, 选择性强而灵活 • 缺点: 相对贵一些 • 抗体包被的磁珠分选法 • 应用不断增多 • 优点: 快捷, 快捷, 选择性强 • 缺点: 昂 贵
3 4
固体组织的酶消化性解聚
• 基本程序:
新鮮组织 → 酶 切 组织消化 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 → 洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
培养细胞的细胞悬液制备 (I)
• 钙螯合法
• 过程: 5 mM EDTA, > 30 min • 优点: 细胞表面抗原保存好 • 缺点: 耗时, 低细胞回收率 低细胞回收率 , 减低存活率 减低存活率
样本染色 (V) –– 萤光素的选择
• 荧光素的明亮度
• phycoerytherin (PE) > PE-Cy5 > PE-Texas Red (E (ECD ) > allophycocyanin (APC) > fluorescein isothiocyanate (FITC)
样本染色 (VI) –– 洗涤还是不洗涤
• 基本程序
新鮮组织 → 组织分散 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 →
• 机械性解联 Mechanical dissociation
洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
• 注意事项 • 酶消化性解联 Enzymatic dissociation
• 在 4°C 4°C的培养液中保存和处理样本 • 用手术刀片刮散组织 • 用 80 µm 金属筛网过滤原始悬液
7
染色 ↓ 解脫
解脫 ↓ 染色
8
Gräbner R, et al. Cytometry 2000; 40: 238-244.
培养细胞的细胞悬液制备 (II)
• 机械刮脫
• 过程: 机械推刮 • 优点: 简单快速 简单快速, 细胞表面抗原表达保存好 • 缺点: 可能导至细胞机械损伤 可能导至细胞机械损伤
Forsyth KD & Levinsky RJ. J Immunol Methods 1990; 128: 159-163.
20
样本染色 (I) –– 总论
• 样本染色难予广义, 简单地描述
样本染色 (II) –– 细胞内抗原
• 分布于细胞内或同时分布于细胞内外的单一抗原染色
• 固定 通透化 染色
流式细胞术样本处理的主要任务与目标
流式细胞术: 样本处理与存储
Flow Cytometry: Sample Preparation and Storage
• 样本对流式细胞仪的可视化
Visualize the sample to cytometer • 单细胞悬液 Single cell suspension
• 几个要点:
• 消化酶 消化酶 组成: 2.5 mg/ml 胰蛋白酶 胰蛋白酶 (trypsin), 0.5 mg/ml 胶原 酶 (collagenase) II, 和 20 µg/ml DNA酶 (DNase) I • 组织消化条件: 37°C, 1 小时, 温和振荡 • 用 80 µm 金属筛网过滤原始悬液 • 组织消化可能显著改变细胞表面标志
Lundahl J, et al. APMIS 1991; 99: 136-146.
23
24
4
样本染色 (IV) –– 抗体选择 2
• 抗体在使用前以15,000 g离心除去聚集体 • Fc受体阻断的策略
• 用非特异抗体进行预 用非特异抗体进行预 孵育 • 目标抗体染色时加入超饱和非特异性抗体 目标抗体染色时加入超饱和非特异性抗体 • 采用 F(ab) or F(ab’ F(ab’) 2 片段
Fc受体阻断对目标抗原染色的作用
FITC-CD3染色15 min
鼠IgG孵育10 min + FITC-CD3染色15 min
• 次级抗体需采用F(ab) 或F(ab’)2片段
25 26 Stewart CC & Stewart SJ. Methods Cell Biol 2001; 63: 217-251.
2.5
染色前的样本储存 Pre-sample handling storage
原则: 原则:
越短越好 保存温度: 4°C或室温 合适的保存方式取决于细胞种类, 合适的保存方式取决于细胞种类, 分析类型和样 本处理方法 粒细胞功能, 血小板功能, 髓系细胞的免疫表型, 细胞周期分析
Leukocyte CD11b MFI
• ≤ 72 h:
淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
12
2
白细胞CD11b表达和反应性在24小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0 2.0
嗜酸性粒细胞CD69表达在24小时 存储(4°C)中的动态变化
Leukocytes
1.5
Neutrophils
1.5 1.0
fMLP 0.1 µM
Leukocyte CD11b MFI
5
• 酶切消化法
• 过程: trypsin/EDTA (0.02-0.1%/5 mM), 1– 1–10 min • 优点: 快速, 高细胞回收率 高细胞回收率 , 高存活率 高存活率 • 缺点: 可能显著改变 细胞表面抗原表达 可能显著改变细胞表面抗原表达
6
1
胰蛋白酶消化可能显著改变培养细胞的 表面抗原表达
李奈林
瑞典 斯德哥尔摩 卡罗林斯卡医学院/大学医院 内科系 临床药理科 杭州 浙江大学医学院 病理学与病理生理学教研室
1
• 荧光标记 Fluorescent labelling
• 防止或减低样本制备引起的假象
Prevent or minimize artefacts during sample handling
• 洗涤与否取决于下列得失平衡:
• 洗涤: 洗涤过程引起假象 洗涤过程引起假象? • 不 洗涤 : 增加背景染色?
• 荧光素的分子大小
• PE > PE-Cy5 > FITC
•
“洗涤” 是一个必需的环节
• 检测细胞表面的抗体结合 • 悬浮介质含大量的可溶性抗原
• 选择最明亮的荧光素标记低密度抗原 • 选择FITC标记细胞核抗原
CD11b Expression MFI
1.5
• 应用: 应用: 细胞分型, DNA分析
1.0
Unfixed
0.5
• 冰冻保存
• 应用: DNA分析, 细胞分型
15
0.5% formaldehyde fixed
0.0
0
1
3
6
12
24
48
16
Time (hour)
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
Time (hour)
13 Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
样本的长期保存与长途运输
• 固定
• 固定剂: 甲醛 福尔马林 , 多聚甲醛, 多聚甲醛, 乙醇, 乙醇, 甲醇
固定全血的白细胞CD11b表达在48小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0
20
免疫萤光标记先于胰蛋白酶消化可能 改善细胞表面抗原保存
800
EC VCAM-1 Expression (arbitrary unit)
600
15
ICAM-1 Expression (arbitrary unit)
400
10
200
5
0 0
EDTA
Trypsin/EDTA
Corver WE, et al. Cytometry 1995; 19: 267-272.
• 细胞膜通透化的方法需逐个评估
22
白细胞胞膜通透化对光散射特性的影响
Control 0.1% Triton 0.8% OG
样本染色 (III) –– 抗体选择 1
• 抗体特异性 • IgG 作为首选 • 选择明亮萤光素标记的抗体检测密度低的抗原 • 细胞内染色IgG较好, 尤其是细胞核内抗原 • 同型阴性对照抗体的萤光素/蛋白质比例 (F/P ratio) 应与阳性染色抗体的相近
• 优化和标准化样本制备程序
Optimize and standize sample handling precedures
2
固体组织的机械解聚 固体组织和培养细胞的细胞悬液制备
Cell suspension preparation from solid tissues and cultured cells
8
Unfixed
Unstimulated
6
0.2% F 0.5% F 1.0% F
Leukocyte CD11b MFI
• 固定剂的类别
• 非凝固性固定剂 非凝固性固定剂 • 多聚甲醛 Paraformaldehyde: 0.5-4% in PBS • 甲醛 Formaldehyde: 0.2-1% in saline or PBS • 戊二醛 Glutaraldehyde: 少用 • 凝固性固定剂 凝固性固定剂 • 乙 醇 Ethanol: 少用 • 甲醇 Methanol: 少用 • 丙酮 Acetone: 少用
2.0
* Hirudin
§
Heparin EDTA Citrate
1.5
• 即时:
1.0
* * *
• ≤ 1 h, 4°C: 单核细胞表面抗原分析 • < 2 h, 4°C: 固体组织 • ≤ 24 h, 4°C: 嗜酸性粒细胞表面抗原分析
0.5
0.0
Unstimulated
0.1 µM fMLP
11 Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
• 需要考虑的要点 • 细胞表面还是细胞内抗原 • 抗体选择 • 萤光素 • 具体检测的特殊要求
21
• 多抗原分別分布于细胞表面和细胞内的染色
• 表面染色 固定 通透化 细胞内染色
• 细胞膜通透化的常用试剂
• Triton X-100, NP-40, Tween 20, Lysolecithin, saponin, and OG
28ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
样本染色 (VII) –– 孵育温度
• 低温孵育引起体外假象的可能性较小
样本孵育温度对白细胞CD11b测定的影响
10.0 4°C 15°C *
Leukocyte CD11b MFI
7.5
22°C 37°C ++
• 体温 (37°C) 孵育适于观察细胞体外反应性
5.0
2.5
++
• 最适孵育温度需根据具体检测项目而定
4
1.0% PF 2.0% PF
2
0 8
0.1 µM fMLP
6
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• 样本固定方法需具体评估
0
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0
1
3(log hour) 6 12 Time
24
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Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
结语
• 流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准。 There is NOT a golden protocol for flow cytometric sample preparation that suits every application.
血液抗凝剂:
• 枸橼酸钠: 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试,
DNA分析
• 肝素: • EDTA: • 水蛭素:
细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试, DNA分析
10
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血液抗凝剂对白细胞 CD11b 流式细胞术检测的影响
1.0 0.5 0.0 2.0
Unstimulated
0.5 0.0 2.0
Monocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
Lymphocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
0
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6 12 24
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Halldén G, et al. Ann Allerg Asthma Immunol 1999; 83: 413-421. 14
0.0
* * ++ ++
Unstimulated
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0.1 µM fMLP
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65. 30
5
样本固定
• 样本固定（染色前或染色后）提高样本稳定性和/ 或终止细胞反应
样本的固定与稳定性: 白细胞CD11b表达在48小时内的动态变化
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• 溶血分离法
• 最常用, 染后溶血 >> 溶血后染色 • 优点: 经济; 高细胞回收率 高细胞回收率 • 缺点: 亦 易导致制样假象
3
细胞分离过程对单核细胞CD11b测定的影响
样本制备过程应避免温度的反复升降
Lundahl J, et al. J Immunol Methods 1995; 180: 1993-100.
白细胞的分离 (I)
• 密度梯度分离法
• 较少用 • 优点: 细胞亚群纯化; 去除死细胞 • 缺点: 耗时; 低细胞回收率 低细胞回收率 , 易导致制样假象
白细胞的分离 (II)
• 荧光抗体或DNA染料的识别染色法 • 应用不断增多 • 优点: 样本处理简单, 样本处理简单, 制样假象少, 制样假象少, 选择性强而灵活 • 缺点: 相对贵一些 • 抗体包被的磁珠分选法 • 应用不断增多 • 优点: 快捷, 快捷, 选择性强 • 缺点: 昂 贵
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固体组织的酶消化性解聚
• 基本程序:
新鮮组织 → 酶 切 组织消化 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 → 洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
培养细胞的细胞悬液制备 (I)
• 钙螯合法
• 过程: 5 mM EDTA, > 30 min • 优点: 细胞表面抗原保存好 • 缺点: 耗时, 低细胞回收率 低细胞回收率 , 减低存活率 减低存活率
样本染色 (V) –– 萤光素的选择
• 荧光素的明亮度
• phycoerytherin (PE) > PE-Cy5 > PE-Texas Red (E (ECD ) > allophycocyanin (APC) > fluorescein isothiocyanate (FITC)
样本染色 (VI) –– 洗涤还是不洗涤
• 基本程序
新鮮组织 → 组织分散 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 →
• 机械性解联 Mechanical dissociation
洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
• 注意事项 • 酶消化性解联 Enzymatic dissociation
• 在 4°C 4°C的培养液中保存和处理样本 • 用手术刀片刮散组织 • 用 80 µm 金属筛网过滤原始悬液
7
染色 ↓ 解脫
解脫 ↓ 染色
8
Gräbner R, et al. Cytometry 2000; 40: 238-244.
培养细胞的细胞悬液制备 (II)
• 机械刮脫
• 过程: 机械推刮 • 优点: 简单快速 简单快速, 细胞表面抗原表达保存好 • 缺点: 可能导至细胞机械损伤 可能导至细胞机械损伤
Forsyth KD & Levinsky RJ. J Immunol Methods 1990; 128: 159-163.
20
样本染色 (I) –– 总论
• 样本染色难予广义, 简单地描述
样本染色 (II) –– 细胞内抗原
• 分布于细胞内或同时分布于细胞内外的单一抗原染色
• 固定 通透化 染色
流式细胞术样本处理的主要任务与目标
流式细胞术: 样本处理与存储
Flow Cytometry: Sample Preparation and Storage
• 样本对流式细胞仪的可视化
Visualize the sample to cytometer • 单细胞悬液 Single cell suspension
• 几个要点:
• 消化酶 消化酶 组成: 2.5 mg/ml 胰蛋白酶 胰蛋白酶 (trypsin), 0.5 mg/ml 胶原 酶 (collagenase) II, 和 20 µg/ml DNA酶 (DNase) I • 组织消化条件: 37°C, 1 小时, 温和振荡 • 用 80 µm 金属筛网过滤原始悬液 • 组织消化可能显著改变细胞表面标志
Lundahl J, et al. APMIS 1991; 99: 136-146.
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样本染色 (IV) –– 抗体选择 2
• 抗体在使用前以15,000 g离心除去聚集体 • Fc受体阻断的策略
• 用非特异抗体进行预 用非特异抗体进行预 孵育 • 目标抗体染色时加入超饱和非特异性抗体 目标抗体染色时加入超饱和非特异性抗体 • 采用 F(ab) or F(ab’ F(ab’) 2 片段
Fc受体阻断对目标抗原染色的作用
FITC-CD3染色15 min
鼠IgG孵育10 min + FITC-CD3染色15 min
• 次级抗体需采用F(ab) 或F(ab’)2片段
25 26 Stewart CC & Stewart SJ. Methods Cell Biol 2001; 63: 217-251.
2.5
染色前的样本储存 Pre-sample handling storage
原则: 原则:
越短越好 保存温度: 4°C或室温 合适的保存方式取决于细胞种类, 合适的保存方式取决于细胞种类, 分析类型和样 本处理方法 粒细胞功能, 血小板功能, 髓系细胞的免疫表型, 细胞周期分析
Leukocyte CD11b MFI
• ≤ 72 h:
淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
12
2
白细胞CD11b表达和反应性在24小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0 2.0
嗜酸性粒细胞CD69表达在24小时 存储(4°C)中的动态变化
Leukocytes
1.5
Neutrophils
1.5 1.0
fMLP 0.1 µM
Leukocyte CD11b MFI
5
• 酶切消化法
• 过程: trypsin/EDTA (0.02-0.1%/5 mM), 1– 1–10 min • 优点: 快速, 高细胞回收率 高细胞回收率 , 高存活率 高存活率 • 缺点: 可能显著改变 细胞表面抗原表达 可能显著改变细胞表面抗原表达
6
1
胰蛋白酶消化可能显著改变培养细胞的 表面抗原表达
李奈林
瑞典 斯德哥尔摩 卡罗林斯卡医学院/大学医院 内科系 临床药理科 杭州 浙江大学医学院 病理学与病理生理学教研室
1
• 荧光标记 Fluorescent labelling
• 防止或减低样本制备引起的假象
Prevent or minimize artefacts during sample handling
• 洗涤与否取决于下列得失平衡:
• 洗涤: 洗涤过程引起假象 洗涤过程引起假象? • 不 洗涤 : 增加背景染色?
• 荧光素的分子大小
• PE > PE-Cy5 > FITC
•
“洗涤” 是一个必需的环节
• 检测细胞表面的抗体结合 • 悬浮介质含大量的可溶性抗原
• 选择最明亮的荧光素标记低密度抗原 • 选择FITC标记细胞核抗原
CD11b Expression MFI
1.5
• 应用: 应用: 细胞分型, DNA分析
1.0
Unfixed
0.5
• 冰冻保存
• 应用: DNA分析, 细胞分型
15
0.5% formaldehyde fixed
0.0
0
1
3
6
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Time (hour)
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
Time (hour)
13 Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
样本的长期保存与长途运输
• 固定
• 固定剂: 甲醛 福尔马林 , 多聚甲醛, 多聚甲醛, 乙醇, 乙醇, 甲醇
固定全血的白细胞CD11b表达在48小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0
20
免疫萤光标记先于胰蛋白酶消化可能 改善细胞表面抗原保存
800
EC VCAM-1 Expression (arbitrary unit)
600
15
ICAM-1 Expression (arbitrary unit)
400
10
200
5
0 0
EDTA
Trypsin/EDTA
Corver WE, et al. Cytometry 1995; 19: 267-272.
• 细胞膜通透化的方法需逐个评估
22
白细胞胞膜通透化对光散射特性的影响
Control 0.1% Triton 0.8% OG
样本染色 (III) –– 抗体选择 1
• 抗体特异性 • IgG 作为首选 • 选择明亮萤光素标记的抗体检测密度低的抗原 • 细胞内染色IgG较好, 尤其是细胞核内抗原 • 同型阴性对照抗体的萤光素/蛋白质比例 (F/P ratio) 应与阳性染色抗体的相近
• 优化和标准化样本制备程序
Optimize and standize sample handling precedures
2
固体组织的机械解聚 固体组织和培养细胞的细胞悬液制备
Cell suspension preparation from solid tissues and cultured cells
8
Unfixed
Unstimulated
6
0.2% F 0.5% F 1.0% F
Leukocyte CD11b MFI
• 固定剂的类别
• 非凝固性固定剂 非凝固性固定剂 • 多聚甲醛 Paraformaldehyde: 0.5-4% in PBS • 甲醛 Formaldehyde: 0.2-1% in saline or PBS • 戊二醛 Glutaraldehyde: 少用 • 凝固性固定剂 凝固性固定剂 • 乙 醇 Ethanol: 少用 • 甲醇 Methanol: 少用 • 丙酮 Acetone: 少用
2.0
* Hirudin
§
Heparin EDTA Citrate
1.5
• 即时:
1.0
* * *
• ≤ 1 h, 4°C: 单核细胞表面抗原分析 • < 2 h, 4°C: 固体组织 • ≤ 24 h, 4°C: 嗜酸性粒细胞表面抗原分析
0.5
0.0
Unstimulated
0.1 µM fMLP
11 Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
• 需要考虑的要点 • 细胞表面还是细胞内抗原 • 抗体选择 • 萤光素 • 具体检测的特殊要求
21
• 多抗原分別分布于细胞表面和细胞内的染色
• 表面染色 固定 通透化 细胞内染色
• 细胞膜通透化的常用试剂
• Triton X-100, NP-40, Tween 20, Lysolecithin, saponin, and OG