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细胞化学染色
细胞化学染色检验前言细胞化学是细胞和化学相结合的一门科学。
细胞化学染色是根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。
在病理情况下，血细胞的化学成分可发生改变。
因此，细胞化学染色不仅对研究血细胞的代谢活动、生理功能，而且对生理和病理情况下血细胞的化学成分的变化、各种类型血细胞的鉴别、某些血液病的鉴别诊断、疾病的疗效观察以及发病机制的探讨均有重要意义。
研究血细胞的化学物质较多，如各种酶类、脂类、糖元、铁等。
下面主要介绍血液学中常用的一些细胞化学染色方法。
瑞氏染色法：瑞氏染色液的配制：瑞氏染料（粉）1g纯甲醇60ml将染料放在乳钵内加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解得倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直到全部染料溶解及用完甲醇为止。
制配好的染液保存于温室中一周便可应用。
新鲜配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性，染液储存愈久染色愈好。
缓冲液的配制及其作用:1% KH2PO4 (即1g KH2PO4+100ml蒸馏水) 30ml1% Na2HPO420ml加蒸馏水至1000mlPH 6.4~6.8过氧化物酶染色一、原理：细胞中的过氧化物酶（POX）分解底物过氧化氢（H2O2）产生新生态氧，后者使联苯胺氧化为联苯胺蓝沉淀而定位于POX活性部位。
二、过氧化物酶染色法染液的配制：（1）联苯胺（Benzidine）0.3g95%乙醇（Ethye alcohol）99ml36%亚硝基铁氰化钠（Sodium Nitroprusside）1ml (0.36g+1ml蒸馏水，置于37℃水浴箱中促溶。
)（2）30%mlml过氧化氢溶液：30%双氧水，吸取一滴约0.05ml放入50ml蒸馏水内，每次用时必须新鲜配制。
三、结果判断：细胞质中有蓝色颗粒的为阳性细胞。
四、临床意义：粒细胞中除早期原粒细胞呈阴性反应外，晚期原粒细胞及以后各阶段粒细胞均呈阳性反应，细胞越成熟反应越强。
第三章 细胞化学染色
第三章 第二节 细胞化学染色
急性单核细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；
3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化 活性增高：见于再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细
其他为阳性。
第三章 第二节 细胞化学染色
第三章 第二节 细胞化学染色
四、过碘酸-雪夫（PAS）反应
【正常血细胞的染色反应 】
1.粒细胞系统 分化差的原始粒细胞呈阴性，分化 好的原始粒细胞至中性分叶核粒细 胞均呈阳性，并随着细胞的成熟而 逐渐增强；嗜酸性粒细胞中颗粒之 间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中 的嗜碱性颗粒呈阳性。
2.红细胞系统 有核红细胞及红细胞均呈阴性。 3.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性，
第三章 第二节 细胞化学染色
（二）α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)染色
【临床意义 】
1.急性单核细胞白血病 单核系细胞多呈阳性，阳性 反应能被氟化钠抑制。
2.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阴性或弱阳性， 阳性反应不能被氟化钠抑制。
3.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性，阳 性反应不能被氟化钠抑制。
第三章 第二节 细胞化学染色
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性； 3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
帮助鉴 别急性 白血病 的类型
临床意义
是辅助判断急性白 血病细胞类型的首选、 最重要的细胞化学染色
成熟中性 粒细胞过 氧化物酶 活性的变 化
第三章 第二节 细胞化学染色
急性单核细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；
3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
【临床意义】
1.帮助鉴别急性白血病的类型 2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化 活性增高：见于再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细
其他为阳性。
第三章 第二节 细胞化学染色
第三章 第二节 细胞化学染色
四、过碘酸-雪夫（PAS）反应
【正常血细胞的染色反应 】
1.粒细胞系统 分化差的原始粒细胞呈阴性，分化 好的原始粒细胞至中性分叶核粒细 胞均呈阳性，并随着细胞的成熟而 逐渐增强；嗜酸性粒细胞中颗粒之 间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中 的嗜碱性颗粒呈阳性。
2.红细胞系统 有核红细胞及红细胞均呈阴性。 3.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性，
第三章 第二节 细胞化学染色
（二）α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)染色
【临床意义 】
1.急性单核细胞白血病 单核系细胞多呈阳性，阳性 反应能被氟化钠抑制。
2.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阴性或弱阳性， 阳性反应不能被氟化钠抑制。
3.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性，阳 性反应不能被氟化钠抑制。
第三章 第二节 细胞化学染色
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性； 3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性
一、过氧化物酶（POX）染色
帮助鉴 别急性 白血病 的类型
临床意义
是辅助判断急性白 血病细胞类型的首选、 最重要的细胞化学染色
成熟中性 粒细胞过 氧化物酶 活性的变 化
第三章 第二节 细胞化学染色
细胞化学染色
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6、临床意义 （1）正常分布 粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈 不同程度阳性。 单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。 淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。
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（2）急性白血病的鉴别诊断 幼稚细胞POX阳性率≥3% ：急非淋（AML) 幼稚细胞POX阳性率＜3% ：急淋（ALL)
至9.2，4℃保存！
（3）作用(基质液): 磷酸萘酚钠
5mg
N-N二甲基酰胺 1ml
Tris-Hcl液
4ml
坚固蓝RR盐
5mg
（4）复染液：1%中性红
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3.操作步骤 1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及 对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干； 2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干； 3、1%中性红复染1min
过氧化物酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 糖原染色 非特异性酯酶染色 特异性酯酶染色 骨髓铁染色
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（一)过氧化物酶(POX)染色
1、原理：
pox
H2O2
O
联苯胺
联苯胺蓝 +
亚硝基铁氰化钠
蓝黑色颗粒
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2.试剂 (1)联苯胺酒精溶液： 取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml, 再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。 (2) 稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加 30%H2O21滴。 （3）瑞吉氏复染液
细胞化学染色检验
申家辉
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一、概述 二、细胞化学染色的基本方法 三、临床应用
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一、概 述
1、概念： 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门
血细胞化学染色--3
【原理】
氯乙酸AS-D萘酚被细胞内特异性酯酶水解
，产生AS-D蔡酚，再与稳定的重氮盐（坚
牢紫酱GBC)偶联，生成不溶性红色沉淀， 定位于胞浆中。
细胞质酯酶活性部位呈红宝石色颗粒，定 位于胞浆中。 （－） （+） （++） (+++) 无红色颗粒沉淀 胞质内1/2区域出现颗粒沉淀 胞质内3/4区域出现颗粒沉淀 胞质内全部区域出现颗粒沉淀 （± ） 颗粒少量、稀疏
【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒， 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 “＋”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或 弥散紫色）。 “2＋”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3＋”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核 清晰。 “4＋”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥 散深色，胞核不清晰。
【临床意义】
（1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明 显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴 性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性， AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单 核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高， 阳性颗粒小而多，呈弥散分布。
M1 - POX(+)
×
二、苏丹黑B染色
【原理】苏丹黑B (sudan black B , SB )是
一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细
胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即
使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出 来。
【结果】
脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的 1/4有致密的颗粒。
有粗大红色颗粒
（++++） 颗粒粗大并有红色块状
氯乙酸AS-D萘酚被细胞内特异性酯酶水解
，产生AS-D蔡酚，再与稳定的重氮盐（坚
牢紫酱GBC)偶联，生成不溶性红色沉淀， 定位于胞浆中。
细胞质酯酶活性部位呈红宝石色颗粒，定 位于胞浆中。 （－） （+） （++） (+++) 无红色颗粒沉淀 胞质内1/2区域出现颗粒沉淀 胞质内3/4区域出现颗粒沉淀 胞质内全部区域出现颗粒沉淀 （± ） 颗粒少量、稀疏
【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒， 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 “＋”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或 弥散紫色）。 “2＋”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3＋”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核 清晰。 “4＋”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥 散深色，胞核不清晰。
【临床意义】
（1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明 显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴 性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性， AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单 核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高， 阳性颗粒小而多，呈弥散分布。
M1 - POX(+)
×
二、苏丹黑B染色
【原理】苏丹黑B (sudan black B , SB )是
一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细
胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即
使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出 来。
【结果】
脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的 1/4有致密的颗粒。
有粗大红色颗粒
（++++） 颗粒粗大并有红色块状
《细胞化学染色检验》课件
样本的保存
样本应保存在适当的温度 和湿度条件下，以确保其 质量和稳定性。
结果的准确性
操作的规范性
在细胞化学染色检验中，应遵循正确的操作步骤和规范，以确保 结果的准确性。
仪器设备的校准
使用的仪器设备应在有效期内进行校准，以确保其准确性和可靠性 。
结果的解读
检验结果应由专业人员进行解读，避免误判或漏判。同时，应定期 对结果进行复核和验证，以确保结果的准确性和可靠性。
目的
细胞化学染色检验主要用于诊断疾病、研究细胞生物学特性、评估治疗效果等 。
历史与发展
历史
细胞化学染色检验技术自19世纪末开始发展，经历了多个阶段，包括手工染色、 半自动染色和全自动染色等。
发展
随着科技的不断进步，细胞化学染色检验技术也在不断改进和完善，如免疫组织 化学染色、荧光染色等新技术的应用，使得检测的灵敏度和特异性得到了显著提 高。
04
结果报告
将分析结果整理成报告，向相 关人员或机构提供准确的实验 数据和结论。
04
细胞化学染色检验应用
在疾病诊断中的应用
肿瘤诊断
通过细胞化学染色检验，可以观 察肿瘤细胞的形态、染色特征和 组织结构，有助于肿瘤的早期发
现和诊断。
感染性疾病诊断
某些细菌、病毒等感染性疾病会导 致细胞发生特异性改变，通过细胞 化学染色检验可以辅助诊断。
染色完成后，进行充分 的洗涤和复染，以提高
染色效果和对比度。
结果观察与解读
01
显微镜观察
使用显微镜观察染色后的样本 ，观察细胞形态、染色情况等 。
02
结果记录
对观察到的染色结果进行详细 记录，包括细胞形态、染色强 度、分布等。
03
细胞化学染色
•【染色方法】
• 1.取新鲜骨髓涂片置浓福尔马林中蒸3分钟。（2 滴） • 2.放入作用液37℃温箱30分钟。 • 作用液配制：取固兰40mg，1%α -萘酚（以50%丙 酮做溶剂）0.8ml，0.05mol/L磷酸盐缓冲液 （PH7.4）40ml混合，过滤后使用。 • 3.用自来水冲洗，晾干。 • 4.用1%沙黄复染45秒。 • 5.水洗，晾干后镜检。
【正常血细胞的染色结果】
• 细胞中如有蓝黑色即为阳性细胞。根据阳性 颗粒的有无及多少，将染色结果分为（-）、 （+）、（++）、（+++）、（++++）。
阳性反应细胞 阳性强度 阳性特征 阴性反应细胞 部分原粒细胞 嗜碱性粒细胞 大部分单系细胞 淋巴细胞 浆细胞 红系细胞
部分原粒细胞 +~++ 颗粒细小，分布稀疏 早幼粒细胞 ++~++++ 颗粒状或弥散状 中性成熟粒细胞 ++~+++ 同上 嗜酸性粒细胞 ++~++++ 粗颗粒状，密集 少数单系细胞 +~++ 细小，弥散，较少
• 【标本要求】
• 一般用新鲜的骨髓涂片做POX染色； 如果外周血中白血病细胞多而骨髓涂 片不够的情况下，可选择新鲜的血涂 片来做。为了保证酶的活性，片子一 般应在固定后一周内完成染色。
•【染色方法】
• 一、试剂：甲液：联苯胺（0.3g）；95%乙醇 （99ml）；亚硝基氰化钠饱和溶液（1ml） 乙液：3%过氧化氢（0.3ml）；蒸馏水（2ml） 注：乙液必须现配现用（5mlH2O+1滴H2O2） 二、染色：1.滴加甲液在干的涂片上。 2.待30秒后滴加乙液。（比例为2:1） 3.过3-4分钟后用自来水冲洗3-4分钟。 4.复染15分钟。
细胞化学染色检验
2.细胞内铁 观察100个中幼红细胞和晚幼红细胞，计算 出铁粒幼红细胞的百分比（即细胞内铁阳 性率）。铁粒幼红细胞是指胞质中出现蓝 色铁颗粒的幼红细胞，根据蓝色铁颗粒多 少、粗细分为：I型、II型、III型、IV型及环 形铁粒幼红细胞。环形铁粒幼红细胞是指 幼红细胞胞质内蓝色颗粒在5星以上，围绕 核周三分之一以上者，成熟红细胞中出现 铁颗粒称为铁粒红细胞。
临床用途：
①辅助判断白血病细胞的类型的。不同的细胞系列， 其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同，随着细胞的分化阶段 及病理生理状态变化，这些物质的含量也会发生相应改变。因此根据 细胞化学染色结果的不同，可推断细胞的所属系列。因此临床上细胞 化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。 ②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。在病理情况下，血细胞的化 学物质的成分及含量会发生改变，据此可以辅助疾病的鉴别诊断。如 中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。
二：中性粒细胞碱性磷酸染色（NAP）
Kaplow偶氮偶联法： 成熟中性粒细胞碱性磷 酸酶在PH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液 中的磷酸萘酚钠底物，释放萘酚，后者与重氮盐 偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶 活性所在之处。
【参考范围】： 1.细胞外铁（+）~（++），约2/3人为 （++），约1/3为（+）。 2.细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率在 12%~44%。以I、II型为主，无环形铁粒幼 红细胞 及铁粒红细胞。
【临床意义】：铁染色是临床应用最广泛 的细胞化学染色之一，主要用于缺铁性贫 血和环形铁粒幼红细胞增多性贫血的诊断 和鉴别诊断。 1.缺铁性贫血 外铁（-）；内铁＜10%； 治疗有效后，内外铁↑。 2.铁粒幼细胞贫血 外铁↑；内铁阳性率↑，环形铁粒幼红细胞 增多。
细胞化学染色检验
。 雪夫(Schiff)染液应避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6个月，试剂应为无色，变红则失效。 10g/L过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以20min为宜。 染色时间和温度应相对恒定，一般以37℃染色30min最适宜。 染色好的涂片应及时检查，以免褪色。 偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。 碱性品红的质量对实验结果有影响。
失染 。 色 液 适 宜 p H 值 应 为 5 . 5 ， 若
度与加入量不能随意更改。涂片
pH值 <5.0会出现假阳性结果。
中粒细胞看不见阳性颗粒，红细
胞呈棕色或绿色，即表示过氧化
氢过浓。若过氧化氢加于血片上
不 产 生 气 泡试，剂则应示置无于效低。温 暗 处 ， 防 止 光 线 照 射 失 效 。
1. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分
混匀，否则同一片子上细胞染色情况不一致。
临床意义
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细 胞化学染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较 多， 较粗大，常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应； AMOL时白血病细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小， 呈弥散分布。
阴 性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳 性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。
注意事项
涂片应新鲜制作、厚薄适宜。
TMB 配制在85％～88％的乙
醇溶液中染色效果较好，勿用
失染 。 色 液 适 宜 p H 值 应 为 5 . 5 ， 若
度与加入量不能随意更改。涂片
pH值 <5.0会出现假阳性结果。
中粒细胞看不见阳性颗粒，红细
胞呈棕色或绿色，即表示过氧化
氢过浓。若过氧化氢加于血片上
不 产 生 气 泡试，剂则应示置无于效低。温 暗 处 ， 防 止 光 线 照 射 失 效 。
1. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分
混匀，否则同一片子上细胞染色情况不一致。
临床意义
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细 胞化学染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较 多， 较粗大，常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应； AMOL时白血病细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小， 呈弥散分布。
阴 性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳 性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。
注意事项
涂片应新鲜制作、厚薄适宜。
TMB 配制在85％～88％的乙
醇溶液中染色效果较好，勿用
细胞化学染色(lishai)
正常血细胞的染色反应
淋巴细胞系统 大多数阴性，少数阳性。 巨核细胞系统 巨核细胞和血小板阳性，阳性反应 的程度随细胞的发育成熟而增强。
临床意义
◆红细胞系统疾病
红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中 幼红细胞可阳性（均匀红色或块状）；某些 红系良性疾病如缺铁贫、巨幼贫等阴性。
◆白细胞系统疾病
ALL：（原幼淋细胞阳性率升高，呈粗颗粒或 块状） 急粒：少数原粒呈阳性，阳性细颗粒状 急单：可呈阳性，阳性细颗粒状
过氧化物酶染色
Peroxidase stain, POX
染色原理（四甲基联苯胺法）
H2O2
溶酶体颗粒中的ＰＯＸ
H2O＋O2
四甲基联苯胺
O2
联苯胺蓝
O2
联苯胺蓝＋亚硝基铁氰化钠
蓝色物质
（沉淀）
正常血细胞的染色反应
粒细胞系统 原粒（可为阴性） 分叶（阳性程 度逐渐增强） 嗜酸阳性最强 嗜碱阴性 单核细胞系统 阴性或弱阳性（颗粒少而 细） 其他血细胞 阴性
细胞化学染色的基本步骤 固定
显示
保持细胞结构及化学成分不变，并使血 膜在染色、冲洗过程中不易脱落损坏
形成稳定的有色沉淀，显示出被检 测的化学物质
复染
既能显示细胞结构又能清楚地看出细 胞化学染色结果
细胞化学染色的种类
过氧化物酶染色（POX)、苏丹黑染色
（SBB) 过碘酸-雪夫反应（PAS）又称糖原染色 酯酶染色 酸性磷酸酶染色（ACP) 铁染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）
PAS临床意义
MA 幼红细胞呈阴性反 应
AML-M6 幼红细胞呈阳性反 应
ALL
AML-M6
AML-M6 PAS(+)
细胞化学染色
【临床意义】 （1）生理变化：
新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老 人更低；激烈运动增高；
月经期经前增高，行经后降低，经后期 恢复正常；
妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高， 分娩时达到高峰，产后恢复正常。
（2）、病理变化 增高：严重化脓性感染、类白血病反应、 AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴 瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、 MDS。
【结果】
脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的
1/4有致密的颗粒。 （++）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。 （+++）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。 （++++） 颗粒极密，颗粒间无间隙。
【临床意义】 1. 粒细胞系 早幼粒及以下阶段随着细胞成熟，阳性颗
×
二、苏丹黑B染色
【原理】 苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能 溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的 中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞 内微细结构的脂类物质也能显示出来。
【试剂】 1. 10%甲醛液。 2. 苏丹黑B乙醇溶液
【操作】 1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。 2．自来水冲洗。 3．放人染色液中，37 ℃染色30~60min。 4．用70%乙醇脱色1~2min，水洗lmin。. 5．瑞氏染液复染20~30min。
这些方法学在白血病的鉴别诊断上 具有重要意义。
一、过氧化物酶染色（POX）
（一）四甲基联苯胺法 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的
髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧 化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧 化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色 化合物沉着于细胞质内。
细胞生物学荧光染色实验 ppt课件
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四、实验方法
(一)利用荧光增白剂观察植物细胞壁 植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很 多荧光染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还 是荧光增白剂，以此来鉴别细胞壁的状况，并常用 于检查原生质体细胞壁是否分解完全，以及原生质 体再生细胞壁的鉴别。
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1．取洋葱表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以 荧光增白剂染色5分钟，加盖玻片，荧光显微 镜下观察其细胞壁。 2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于 载玻片上，加荧光增白剂一滴，染色 5分钟，加
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（四) 线粒体观察 取洋葱内表皮细胞 (1cm2)置于载玻片，以 0.0l％罗丹明染色5分钟生理盐水冲洗一次，加盖 玻片，荧光显微镜下绿光激发观察。
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五、作业
分别描述DNA，蛋白质及线粒体在细胞内的 分布与颜色。
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实验六 细胞活力的测定
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一、实验目的
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三、实验用品
(一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细 胞。 (二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。 (三) 试剂： 1．二丙酸酯荧光素溶液：取l0mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将 此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到 出现永久性乳白沉淀为止。 2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。
学习荧光显微镜的使用，了解荧光 显微技术原理和方法，以及荧光技术在 细胞化学方面的应用。
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二、实验原理
荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而 在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体 受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体 发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有பைடு நூலகம்生 物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同 样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。
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阴 性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳 性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。
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注意事项
1. 涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 2. TMB 配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90
％～95％乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞 内渗入而使显色反应减弱或消失。 3. 过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂 片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过 氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。 4. 染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结果。 5. 试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。 6. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同 一片子上细胞染色情况不一致。
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方法步骤
1. 新鲜干燥的涂片用95％乙醇固定10min，流水冲洗，待干。 2. 加入10g/L过碘酸氧化15～20min，蒸馏水冲洗，待干。 3. 置雪夫染液中37℃(或室温)染色30～60min。 4. 用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用流水冲洗2～3min，待干。 5. 20g/L甲绿复染10～20min。 6. 水洗，待干，镜检。 7. 结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无
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过碘酸-雪夫反应(PAS)
目的: 了解过碘酸-雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。 原理: 过碘酸-雪夫反应(Periodic acid Schiff reaction, PAS)又称糖 原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙二醇基的糖类氧化 而产生双醛基，后者与雪夫(Schiff)染料作用，使无色品红变为紫红 色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及 含量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。
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临床意义
1. 红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁 性贫血、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征时幼红细胞呈强 阳性反应；溶血性贫血、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴 性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血时幼红细 胞呈阴性反应。
2. 白血病类型的鉴别：AML原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳 性反应，以弥漫性反应为主；ALL原、幼淋巴细胞多呈块状阳性 反应，也有少数呈阴性反应；AMOL原、幼单核细胞呈强阳性反 应，其颗粒细小，弥散分布。
色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下：
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（1）中性粒细胞的分级标准： 0分 胞质无色。 1分 胞质内呈淡红色，有极ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ颗粒。 2分 胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。 3分 胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。 4分 胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。
（2）淋巴细胞分级标准： 0分 胞质内无色。 1分 胞质内呈弥散淡红或有少数细颗粒(<10个)。 2分 胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒(≥10个)。 3分 胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。 4分 胞质内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。
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方法步骤
1. 取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl，溶液呈淡 棕黄色。染色液应在临用前配制。
2. 在新鲜干燥的涂片上，加0.1％TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试 剂0.5ml，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀，染色6min。
3. 直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染15～20min。 4. 流水冲洗后，待干，用油镜镜检。 5. 结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。
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临床意义
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急 性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细胞化学 染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较多， 较粗大， 常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细胞呈 阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。
细胞化学染色检验
一、过氧化物酶染色（POX)
目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。 原理(四甲基联苯胺法）: 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物 酶(peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2，使之氧化为四甲基联苯胺 蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝 色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则 自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。
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（3）幼红细胞的分级标准： 0分 胞质内无色。 1分 胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。 2分 胞质中有1～2个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。 3分 胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。 4分 胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。
（4）巨核细胞的分级标准： 0分 胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。 1分 少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。 2分 中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3。 3分 大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/2。 4分 糖原包涵体充满整个胞质。
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注意事项
1. 所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。 2. 雪夫(Schiff)染液应避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6个月，
试剂应为无色，变红则失效。 3. 10g/L过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以
20min为宜。 4. 染色时间和温度应相对恒定，一般以37℃染色30min最适宜。 5. 染色好的涂片应及时检查，以免褪色。 6. 偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。 7. 碱性品红的质量对实验结果有影响。
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注意事项
1. 涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 2. TMB 配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90
％～95％乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞 内渗入而使显色反应减弱或消失。 3. 过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂 片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过 氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。 4. 染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结果。 5. 试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。 6. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同 一片子上细胞染色情况不一致。
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方法步骤
1. 新鲜干燥的涂片用95％乙醇固定10min，流水冲洗，待干。 2. 加入10g/L过碘酸氧化15～20min，蒸馏水冲洗，待干。 3. 置雪夫染液中37℃(或室温)染色30～60min。 4. 用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用流水冲洗2～3min，待干。 5. 20g/L甲绿复染10～20min。 6. 水洗，待干，镜检。 7. 结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无
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过碘酸-雪夫反应(PAS)
目的: 了解过碘酸-雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。 原理: 过碘酸-雪夫反应(Periodic acid Schiff reaction, PAS)又称糖 原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙二醇基的糖类氧化 而产生双醛基，后者与雪夫(Schiff)染料作用，使无色品红变为紫红 色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及 含量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。
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临床意义
1. 红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁 性贫血、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征时幼红细胞呈强 阳性反应；溶血性贫血、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴 性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血时幼红细 胞呈阴性反应。
2. 白血病类型的鉴别：AML原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳 性反应，以弥漫性反应为主；ALL原、幼淋巴细胞多呈块状阳性 反应，也有少数呈阴性反应；AMOL原、幼单核细胞呈强阳性反 应，其颗粒细小，弥散分布。
色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下：
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（1）中性粒细胞的分级标准： 0分 胞质无色。 1分 胞质内呈淡红色，有极ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ颗粒。 2分 胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。 3分 胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。 4分 胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。
（2）淋巴细胞分级标准： 0分 胞质内无色。 1分 胞质内呈弥散淡红或有少数细颗粒(<10个)。 2分 胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒(≥10个)。 3分 胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。 4分 胞质内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。
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方法步骤
1. 取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl，溶液呈淡 棕黄色。染色液应在临用前配制。
2. 在新鲜干燥的涂片上，加0.1％TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试 剂0.5ml，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀，染色6min。
3. 直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染15～20min。 4. 流水冲洗后，待干，用油镜镜检。 5. 结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。
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临床意义
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急 性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细胞化学 染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较多， 较粗大， 常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细胞呈 阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。
细胞化学染色检验
一、过氧化物酶染色（POX)
目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。 原理(四甲基联苯胺法）: 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物 酶(peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2，使之氧化为四甲基联苯胺 蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝 色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则 自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。
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（3）幼红细胞的分级标准： 0分 胞质内无色。 1分 胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。 2分 胞质中有1～2个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。 3分 胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。 4分 胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。
（4）巨核细胞的分级标准： 0分 胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。 1分 少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。 2分 中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3。 3分 大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/2。 4分 糖原包涵体充满整个胞质。
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注意事项
1. 所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。 2. 雪夫(Schiff)染液应避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6个月，
试剂应为无色，变红则失效。 3. 10g/L过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以
20min为宜。 4. 染色时间和温度应相对恒定，一般以37℃染色30min最适宜。 5. 染色好的涂片应及时检查，以免褪色。 6. 偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。 7. 碱性品红的质量对实验结果有影响。
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