病毒及其疫苗的生产制备技术

二、病毒生产制备的方法
1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用 鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒 （NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细 胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃ 孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝 效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获 卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接 种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章）
脊 髓 灰 灭活（Salk株 猴肾细胞（原代 /2-3代） ） 质炎疫苗 活（Sabin株） Vero细胞 腮 腺 炎 活（ME株） 疫 苗 幼地鼠、狗肾 豚鼠肾细胞
Edomonste、 原代鸡胚纤维母 L16、沪191 细胞，人二倍体 麻疹活疫 人羊膜、狗肾、 、 苗 羊肾 Moraten、 豚鼠肾细胞 Schwar2株
一、病毒生产的目的和用途
1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单 位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免 疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗， 以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的 病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫 苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台 病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵 抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能 通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病 毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。
半成品 分装
成品 检定 合格成品
兔肾、豚鼠肾
鸡胚纤维母细胞 转瓶培养 幼地鼠肾细胞
• 三、用细胞培养制备病毒疫苗的优点： • （1）在细胞传代期间可进行比较全面的检查 ，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保 安全。 • （2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培 基中生产繁殖，以排除过敏因素。 • （3）可挑选对病毒敏感的细胞克隆。以利病 毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提 高。 • （4）易于大量生产和进行连续自动化工业生 产，以满足量的需求。
第二节 病毒疫苗的生产制备
• 病毒疫苗的生产制备与病毒的生 产制备基本相同，目前进行人工 主动免疫，用于病毒病预防的疫 苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）, 又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗 、基因缺失的减毒活疫苗，基因 工程亚单位疫苗，重组牛痘多价 疫苗。
• 四、提高疫苗的效力常采用的方 法： • （1）细胞的药物处理 • （2）在维持液中补充某些物质也 有利于某些病毒的复制 • （3）毒种的选择 • （4）病毒液的浓缩
处理细胞的药物
刺激的病毒
5-碘-2-脱氧尿核 风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40 甙 维生素A或 脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒 Tween-80 胆固醇或卵磷质 脊髓灰质炎病毒 DEAE-dextran 胰 酶 脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒，付流 感病毒 痘类病毒、呼吸道肠道病毒，流感病毒 、鼻病毒 脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒 麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒
一、病毒疫苗的种类 (一)灭活疫苗 (二)减毒活疫苗 (三)亚单位疫苗 (四)多肽疫苗 (五)基因缺失的减毒活疫苗 (六)基因工程亚单位疫苗
(二)细胞培养法制备的常用疫 苗(表25-1)
疫 名 称
苗 活/死(疫苗株)
制备疫苗 的细胞
培养方法 转瓶培养 微载体培养 转瓶培养 罗氏瓶培养 罗氏瓶培养 转瓶培养
• 六、 生产病毒和制备病毒疫苗的 常用方法
(一)制备工艺流程 • （1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺
• 2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制 备工艺
地鼠肾 剪碎，胰酶消化
灭活病毒液 合并，安全及效力试验
地鼠肾细胞悬液 37℃,3天细胞培养液，pH7.0～7.2
原液 加入亚硫酸氨钠
单层细 洗涤，去除牛血清 10-4～10-5浓度病毒感染细胞 32～34℃培养2～3天 收获病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛 22℃，8天
单纯疮疹
罗氏瓶培 养 死（72株） 病毒疫苗 豚鼠胚成纤维细 转瓶培养 胞 WI-38人胚肺细 转瓶培养 巨细胞病 活（Towne株） 毒疫苗 胞 微载体培 狂犬病毒 死（AV01/AV02 人二倍体细胞 养 疫苗 株） （CUS株） 流行性乙 灭活（5-3株） 型 脑炎疫苗 森林脑炎 病毒疫苗 灭活 人二倍体细胞 多层滋养 增殖器
第25章
病毒及其疫苗的生产制 备技术
第一节 病毒的生产制备
细胞培养技术，在病毒学研究方面 获得了广泛的应用，为病毒的繁殖 、鉴定提供了来自不同动物（包括 人）、不同组织的细胞来源，通过 敏感性筛选，绝大多数病毒均可有 相应的敏感细胞，为病毒的分离、 鉴定和增殖创造了条件,也为病毒的 大量生产提供了细胞来源，只要有 敏感的细胞，就可以进行大规模生 产。
二甲亚砜 放线菌素D
在维持液中补充某些物质也有利于某些病毒的复制
增加的药物 Tween-80或油酸钠 谷氨酰胺 精氨酸 脯氨酸、赖氨酸
刺 激 的 病 毒 乙型脑炎 麻疹、脊髓灰质炎病毒 、仙台病毒 痘类病毒、疱疹病毒 乙型脑炎
五、影响疫苗Hale Waihona Puke Baidu量的因素：
• （1）毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫 苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒 力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低， 免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在 传代细胞上传代的毒种。 • （2）培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒 ，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格 检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只 能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。 • （3）培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋 白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应 尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。 • （4）甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗 原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。